Name: Diferenciação Dirigida de Células Endoteliais Hemogênicas de Células-Tronco Pluripotentes Humanas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 23 s
Description: Aprenda a diferenciar células endoteliais hemogênicas a partir de células-tronco pluripotentes humanas em aproximadamente uma semana. Este protocolo livre de soro e alimentador permite estudar a transição endotelial-hematopoietica e gerar produtos sanguíneos ex vivo.

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Este trabalho foi parcialmente apoiado pelos subsídios do NIH HL128064 e U2EB017103. Mais apoio foi fornecido pela concessão CT Innovations 15-RMB-YALE-04.

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O autor não tem nada a revelar.

Neste documento, descrevem-se os passos para a produção de células endoteliais hemogênicas a partir de células-tronco embrionárias humanas em aproximadamente 1 semana usando um sistema de cultura 2D livre de murino e soro (Figura 1). Esse protocolo expande um método descrito por Sriram et al. (2015) para obter CEs primordiais38. A natureza primordial e o potencial de especificação dos CD31+ CD45- ECs são demonstrados pela cultura dessas células e...

As células endoteliais (CEs) são uma população heterogênea de células que desempenham múltiplas funções em todo o corpo humano e em tecidos modificados. Além de apoiar e regular outros tipos de células (ou seja, cardiomiócitos1, células osteoblásticas2), essas funções incluem a formação de uma barreira seletiva entre sangue e tecidos e auxiliam na formação de tecidos3. A diferenciação de CEs maduras durante o desenvolvimento normal requer diversas vias de sinalização. As CEs primordiais são derivadas de progenitores mesodérmicos e, em seguida, são especificadas para fenótipos arteriais, venosos, capilares e linfáticos maduros4. Além disso, um pequeno subconjunto de CEs no saco vitelino extraembrionário e na região embrionária da Aorta-Gônada-Mesonférfos (AGM) também é especificado para se tornar CEs hemogênicas, que dão origem a células-tronco hematopoiéticas e progenitoras (HSPCs) que migram para o fígado fetal e a medula óssea fetal, onde permanecem no pós-natal e geram todos os tipos de células sanguíneas ao longo da vida4. A gama diversificada de fenótipos de CE é essencial para todo o desenvolvimento e manutenção dos tecidos.
Assim, as CEs e seus derivados são componentes críticos de estudos voltados para modelar e elucidar mecanismos de desenvolvimento humano e/ou doenças, bem como aplicações de medicina regenerativa e engenharia de tecidos 5,6,7,8. No entanto, a principal limitação para esses tipos de estudos é a falta de disponibilidade de CEs humanas primárias na quantidade necessária. Estima-se que um mínimo de 3 x 108 CEs seria necessário para a maioria das aplicações terapêuticas6. Para resolver esse problema, o uso de células-tronco embrionárias humanas (hESCs) e células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (hiPSCs) tem sido proposto devido ao seu potencial de linhagem diversificada e sua capacidade de gerar um grande número de progênies 6,9.
De fato, a utilidade de células derivadas de hESCs ou hiPSCs tem sido demonstrada em múltiplos estudos focados em modelagem de doenças e rastreamento de drogas10,11,12. A tecnologia Organ-on-a-Chip (OOC) tem sido usada para recapitular mais fielmente a fisiologia do corpo humano, integrando células e tecidos em andaimes tridimensionais. Além disso, a conexão de múltiplos OOCs individuais (o chamado corpo-ou-humano-em-um-chip, BOC/HOC) pode ser realizada via microfluídica para permitir o crosstalk entre os órgãos de interesse13,14,15. Tecidos de suporte, como a vasculatura, são componentes críticos de OOCs e BOC/HOCs; a incorporação de vasculatura permite o transporte de nutrientes, oxigênio e fatores parácrinos por todos os tecidos, promovendo assim o microambiente tecidual específico necessário 3,12. Assim, métodos para derivar CEs humanas maduras, como CEs arteriais, venosas, linfáticas e hemogênicas, são cruciais para o avanço dessas abordagens de engenharia de tecidos.
Vários protocolos foram publicados detalhando etapas para a derivação de ECs primordiais ou progenitoras humanas de hESCs ou hiPSCs 5,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26 . Muitos desses protocolos dependem da formação de corpos embrionários (EB) ou co-cultura de ESCs/iPSCs com uma camada alimentadora murina de células estromais. Essas estratégias tendem a ser difíceis e demoradas, com baixos rendimentos de CE e/ou contaminação de CEs humanas com células murinas. Protocolos que dependem estritamente da cultura 2D sem o uso de células estromais geralmente requerem induções longas, utilizam combinações complexas de fatores de crescimento e / ou inibidores para indução, têm longos períodos de expansão após a separação celular ou uma combinação desses fatores. O avanço do conhecimento das vias de sinalização e dos fatores envolvidos na derivação de tipos maduros de CE in vivo fornece as bases para um protocolo de diferenciação in vitro simples e robusto.
Anteriormente, foram identificados papéis-chave para as vias de sinalização de Notch e Ácido Retinóico (AR) na especificação de CEs murinas e hemogênicas, respectivamente, durante o desenvolvimento. A via de sinalização Notch desempenha múltiplos papéis na especificação e manutenção do fenótipo arterial da CE. O trabalho utilizando o modelo de vascularização murina da retina identificou uma via na qual o estresse por cisalhamento de líquidos induz um eixo de sinalização Notch-Cx37-p27, promovendo a parada do ciclo celular G1, o que possibilita a especificação da CE arterial27. A hipótese de que os estados do ciclo celular desempenham um papel nas decisões de destino celular, fornecendo janelas de oportunidade distintas nas quais as células são receptivas a certos sinais que podem induzir a expressão gênica e mudanças fenotípicas28. Essa parada G1 mediada por Notch permitiu a expressão de genes enriquecidos em ECs arteriais, incluindo efrinB2, Cx40, DLL4, Notch1 e Notch 4 (revisado em29,30). Também foi demonstrado que a especificação hemogênica da CE é promovida in vivo via sinalização daAR 31,32. Estudos adicionais identificaram que, a jusante da sinalização da AR, a expressão de c-Kit e Notch regulam a p27, o que possibilita a especificação hemogênica no saco vitelino murino e AGM33. As CEs hemogênicas murinas podem ser minimamente identificadas pela expressão de marcadores endoteliais (ou seja, CD31, KDR) e hematopoiéticos (ou seja, c-Kit, CD34)4. Por fim, as CEs hemogênicas passam por uma transição endotelial-hematopoiética (EHT) para a formação de HSPCs, o que pode dar origem a todos os tipos de células sanguíneas 4,34,35.
Trabalhos recentes testaram se essa mesma hierarquia de sinalização pode promover a especificação hemogênica humana da CE. Para tanto, foi desenvolvido um protocolo de cultura 2D sem soro e alimentador para derivar CEs hemogênicas de hESCs, e essas CEs hemogênicas foram caracterizadas em um único nível celular como CD31+ KDR+ c-Kit+ CD34+ VE-Cadherin-CD45-. Este estudo também aproveitou o relator Fluorescent Ubiquitination Cell Cycle Indicator (FUCCI), que identifica diferentes estados do ciclo celular, utilizando H9-hESCs que expressam o construto repórter FUCCI (H9-FUCCI-hESC)36. Em estudos com essas células, demonstrou-se que a AR promove a parada precoce do ciclo celular G1 nas CEs, e o estado G1 precoce permite a especificação hemogênica in vitro37. Neste documento, um protocolo detalhado para a diferenciação dessas células endoteliais hemogênicas humanas e ensaios confirmando sua identidade são fornecidos. Este método simples fornece um meio útil de gerar este subconjunto especializado de CEs para estudos futuros de mecanismos de desenvolvimento de células sanguíneas humanas.

<table><tbody><tr><td>Pratos de 15 cm</td><td>Corning</td><td>430599</td><td>tratamento com cultura de tecidos</td></tr> pratos de <tr><td>35 mm</td><td>Corning</td><td>430165</td><td>tratamento</td></tr><tr><td>com cultura de tecidos Placas de 6 poços</td><td>Corning</td><td>3516</td><td>tratamento com cultura</td></tr><tr><td>de tecidos Reagente antimicrobiano Marca: Normocin</td><td>Invitrogen</td><td>ant-nr-1</td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>R& D systems</td><td>233-FB-025</td><td>uso a 50 ng/mL</td></tr><tr><td>BMP4</td><td>BioLegend</td><td>595202</td><td>uso a 25 ng/mL</td></tr><tr><td>de albumina de soro bovino (BSA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1600-1</td><td></td></tr><tr><td>Solução de descolamento de células Marca: Accutase</td><td>Stemcell Technologies</td><td>7920</td><td></td></tr><tr><td>Dimetil Sulfóxido (DMSO)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2650-100mL</td><td></td></tr><tr><td>Separar</td><td>Stemcell Technologies</td><td>7913</td><td></td></tr><tr><td>DLL4</td><td>R& D systems</td><td>1506-D4/CF</td><td>humano recombinante; uso a 10 &mu; g / mL</td></tr><tr><td>DMEM: F12</td><td>Gibco</td><td>11320-033</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (PBS)</td> <td>Gibco</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>Meio de crescimento de células endoteliais Marca: EGM-2 Meio de crescimento de células endoteliais-2 BulletKit (EGM-2)</td> <td>Lonza</td><td>CC-3162</td><td></td></tr><tr><td>Tubos FACS</td><td>Corning</td><td>352235</td><td>poliestireno fundo redondo com tampa</td></tr> <tr><td>de filtroSoro Fetal Bovino (FBS)</td><td>Gemini Bio</td><td>100-106</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectina</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>33016015</td><td>uso em 4 &mu; g/cm2</td></tr><tr><td>GSK3i/CHIR99021</td><td>Stemgent</td><td>04-0004-02</td><td>Estoque de 10 mM; use a 5 &mu; </td></tr><tr><td>Solução Saleira Balanceada M Hanks (HBSS)</td><td>Gibco</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>Ácido Clorídrico (HCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A144S-500</td><td></td></tr><tr><td>Matrix protein&nbsp; Marca: Matrigel</td><td>Corning</td><td>356230</td><td>Fator de crescimento reduzido. Consulte o Certificado de Análise do lote para determinar a concentração de proteína (Matrigel). Esta concentração é necessária para calcular o volume de Matrigel que contém 1 mg de proteína.</td></tr><tr><td>Meio à base de metilcelulose Marca: MethoCult H4435 Tecnologias</td><td>de células-tronco</td> enriquecidas <td>4435</td><td></td></tr><tr><td>Meio de diferenciação de células-tronco pluripotentes Marca: STEMdiff APEL 2</td><td>Stemcell Technologies</td><td>5270</td><td></td></tr><tr><td>Células-tronco pluripotentes: H1, H9, H9-FUCCI</td><td>WiCell</td><td>WA09 (H9), WA01 (H1)</td><td>humano; H9-FUCCI foram obtidos no laboratório do Dr. Ludovic Vallier no Cambridge Stem Cell Institute</td></tr><tr><td>Protein-Free Hybridoma Medium (PFMH)</td><td>Gibco</td><td>12040077</td><td></td></tr><tr><td>Retinoic Acid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R2625-50mg</td><td>use a 0,5 &mu; M</td></tr><tr><td>Reverse transcription master mix Marca: iScript Reverse Transmix Supermix</td><td>BioRad</td><td>1708840</td><td></td></tr><tr><td>kit de extração de RNA Marca: RNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de Sódio (NaOH)</td><td>Fisher Scientific</td><td>SS255-1</td><td></td></tr><tr><td>Meio de crescimento de células-tronco Marca: mTeSR1</td><td>Stemcell Technologies</td><td>85850</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green master mix Marca: iTaq Universal SYBR Green Master Mix</td><td>BioRad</td><td>1725121</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25299956</td><td>0,25%</td></tr> <tr><td>VEGF165 (VEGF-A)</td><td>PeproTech</td><td>100-20</td><td>use a 50 ng/mL</td></tr><tr><td>&alpha;-CD31-FITC</td><td>BioLegend</td><td>303104</td><td>2 &mu; g/mL*</td></tr><tr><td>&alpha;-CD34-Pacific</td><td>Blue BioLegend</td><td>343512</td><td>2 &mu; g/mL*</td></tr><tr><td>&alpha;-CD45-APC/Cy7</td><td>BioLegend</td><td>304014</td><td>2 &mu; g/mL*</td></tr><tr><td>&alpha;-c-Kit-APC</td><td>BioLegend</td><td>313206</td><td>2 &mu; g/mL*</td></tr><tr><td>&alpha;-Flk-1-PE/Cy7</td><td>BioLegend</td><td>359911</td><td>2 &mu; g/mL*</td></tr><tr><td>&alpha;-VE-Caderina-PE</td><td>BioLegend</td><td>348506</td><td>2 &mu; g/mL*</td></tr><tr><td>* Os conjugados fluorescentes de anticorpos devem ser otimizados com base no classificador de células usado. Aqui estão apresentadas as concentrações finais utilizadas neste estudo.</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

diferenciação dirigida de células endoteliais hemogênicas de células-tronco pluripotentes humanas

Directed Differentiation of Hemogenic Endothelial Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Os vasos sanguíneos são distribuídos de forma onipresente em todos os tecidos do corpo e desempenham diversas funções. Assim, a derivação de células endoteliais vasculares maduras, que revestem lúmens de vasos sanguíneos, a partir de células-tronco pluripotentes humanas é crucial para uma infinidade de aplicações de engenharia e regeneração de tecidos. In vivo, as células endoteliais primordiais são derivadas da linhagem mesodérmica e são especificadas para subtipos específicos, incluindo arteriais, venosas, capilares, hemogênicas e linfáticas. As células endoteliais hemogênicas são de particular interesse porque, durante o desenvolvimento, dão origem a células-tronco hematopoiéticas e progenitoras, que geram todas as linhagens sanguíneas ao longo da vida. Assim, a criação de um sistema para gerar células endoteliais hemogênicas in vitro proporcionaria uma oportunidade para estudar a transição endotelial para hematopoiética e poderia levar à produção ex vivo de produtos sanguíneos humanos e à redução da dependência de doadores humanos. Embora existam vários protocolos para a derivação de células endoteliais progenitoras e primordiais, a geração de células endoteliais hemogênicas bem caracterizadas a partir de células-tronco humanas não foi descrita. Aqui, um método para a derivação de células endoteliais hemogênicas de células-tronco embrionárias humanas em aproximadamente 1 semana é apresentado: um protocolo de diferenciação com células estriadas primitivas formadas em resposta ao inibidor de GSK3β (CHIR99021), depois indução de linhagem mesodérmica mediada por bFGF, seguida de desenvolvimento de células endoteliais primordiais promovidas por BMP4 e VEGF-A e, finalmente, especificação de células endoteliais hemogênicas induzida por ácido retinóico. Este protocolo produz uma população bem definida de células endoteliais hemogênicas que podem ser usadas para entender melhor sua regulação molecular e transição endotelial-hematopoiética, que tem o potencial de ser aplicada a aplicações terapêuticas a jusante.

Um esquema delineando a especificação de CEs primordiais e CEs hemogênicas de hESCs e uma imagem representativa das células 24 h após o revestimento são mostradas na Figura 1. Seguindo a especificação, CEs primordiais e CEs hemogênicas são FACS purificadas nos dias 5 e 8, respectivamente. As CEs primordiais são definidas como CD31+ CD45- e as CEs hemogênicas são definidas como CD31+ KDR+ c-Kit+ CD34+ VE-Cadherin-CD45-</su...

Apresenta-se aqui um protocolo simples para a diferenciação direcionada de células endoteliais hemogênicas de células-tronco pluripotentes humanas em aproximadamente 1 semana.

Diferenciação Dirigida de Células Endoteliais Hemogênicas de Células-Tronco Pluripotentes Humanas

Blood vessels are ubiquitously distributed within all tissues of the body and perform diverse functions. Thus, derivation of mature vascular endothelial ...

Este protocolo detalha um método para gerar uma população bem caracterizada de células endoteliais hemogênicas humanas. Essas células podem ser utilizadas para estudar a regulação molecular e a transição endotelial-hematopoiética. Comece cultivando células-tronco embrionárias humanas por quatro dias para diferenciá-las em células endoteliais primordiais.No quinto dia, aspirar o meio acima das células. Em seguida, lave suavemente as células com um mililitro de DMEM / F-12 por poço. Adicione um mililitro de meio de diferenciação de células endoteliais hemogênicas recém-preparado por poço e incube as células por 24 horas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.No sexto e sétimo dia, substitua o meio acima das células por um mililitro de meio de diferenciação de células endoteliais homogênicas recém-preparado por poço e incube as células por mais 24 horas. No oitavo dia. depois de separar e lavar as células, divida-as uniformemente em tubos de microcentrífuga no gelo, cada um contendo um mínimo de 600 microlitros de células a uma densidade de 1 vez 10 para a 5ª célula por mililitro.Adicione anticorpos aos tubos que contêm células, conforme apropriado, e incube no gelo protegido da luz por 30 minutos. Pellet as células por centrifugação a 1000 vezes G e 4 graus Celsius durante cinco minutos. Remova o sobrenadante e ressuspenda os pellets em 600 microlitros de tampão de classificação gelado.Coe as amostras através da tampa do filtro de malha de tubos FACS de cinco mililitros e armazene as células no gelo protegidas da luz para triagem imediata das células. Para isolar células endoteliais hemogênicas por FACS, primeiro a população de células CD45-negativas. Então, dentro da população CD45-negativa, porta as células CD31-positivas.Em seguida, dentro da população CD31-positiva, porta para a população de células VE-caderina-negativas. E então, dentro da população negativa de caderina VE, porta para as células c-Kit-positivas. Da população c-Kit-positiva, a população de células CD34-positivas.E, finalmente, a partir da população celular CD34-positiva, identificar e coletar as células KDR-positivas. Após a semeadura de células endoteliais hemogênicas em um meio à base de metilcelulose formulado para o crescimento de células progenitoras hematopoiéticas, colônias de unidades formadoras de colônias eritróides e colônias de unidade formadora de explosão - eritróides são contadas no oitavo dia. Unidade Formadora de Colônia-Granulócito-Macrófago e Unidade Formadora de Colônia-Granulócito, Eritróide, Macrófago e Megacariócito.Colônias progenitoras hematopoiéticas multipotentes são contadas no dia 14. Por cada 1000 células endoteliais hemogênicas plaqueadas, aproximadamente 20 unidades formadoras de colônias são geradas. Células com morfologia de células endoteliais também são visíveis nas culturas.Estas são as células endoteliais hemogênicas que dão origem a progenitores hematopoiéticos de múltiplas linhagens em um nível de célula única. Este protocolo é um sistema de cultura livre de soro e murino 2D que pode gerar células endoteliais hemogênicas humanas em aproximadamente uma semana.

directed-differentiation-hemogenic-endothelial-cells-from-human

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Geração de linfócitos T de tronco pluripotentes induzidas (iPS) células dá uma abordagem alternativa de utilização de células-tronco embrionárias para T imunoterapia baseada em células. O método mostra que, utilizando...

Diferenciação de células Dirigido tronco pluripotentes induzidas no sentido de Linfócitos T

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Diferenciando células-tronco pluripotentes induzidas por humanos em células endoteliais microvasculares cerebrais

Nós, com base no conhecimento da biologia do desenvolvimento e pesquisas publicadas, desenvolvemos um protocolo otimizado para gerar com eficiência neurônios dopaminérgicos do mesencéfalo A9 a partir de células-tronco embrionárias humanas e células-tronco pluripotentes induzidas humanas, o que seria útil para modelagem de doenças e terapia de substituição celular para a doença de Parkinson.

Dirigido neurônios dopaminérgicos Diferenciação de Células-Tronco pluripotentes humanas

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A indução direta de hegemônicos endotélio e sangue por sobre-expressão de fatores de transcrição na pluripotentes humanas Células-Tronco

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Dirigido a diferenciação de progenitores hematopoiéticos primitivo e definitiva de células pluripotentes humanas

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Diferenciação de Células-Tronco Pluripotentes Induzidas Humanas em Células Semelhantes a Células Endoteliais Microvasculares Cerebrais com Fenótipo Imune Maduro;

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Aprenda a diferenciar células endoteliais hemogênicas a partir de células-tronco pluripotentes humanas em aproximadamente uma semana. Este protocolo livre de soro e alimentador permite estudar a transição endotelial-hematopoietica e gerar produtos sanguíneos ex vivo.

Diferenciação Dirigida de Células Endoteliais Hemogênicas de Células-Tronco Pluripotentes Humanas

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