Diferenciação Dirigida de Células Endoteliais Hemogênicas de Células-Tronco Pluripotentes Humanas
31 de março de 2021
Apresenta-se aqui um protocolo simples para a diferenciação direcionada de células endoteliais hemogênicas de células-tronco pluripotentes humanas em aproximadamente 1 semana.
Este protocolo detalha um método para gerar uma população bem caracterizada de células endoteliais hemogênicas humanas. Essas células podem ser utilizadas para estudar a regulação molecular e a transição endotelial-hematopoiética. Comece cultivando células-tronco embrionárias humanas por quatro dias para diferenciá-las em células endoteliais primordiais.
No quinto dia, aspirar o meio acima das células. Em seguida, lave suavemente as células com um mililitro de DMEM / F-12 por poço. Adicione um mililitro de meio de diferenciação de células endoteliais hemogênicas recém-preparado por poço e incube as células por 24 horas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.
No sexto e sétimo dia, substitua o meio acima das células por um mililitro de meio de diferenciação de células endoteliais homogênicas recém-preparado por poço e incube as células por mais 24 horas. No oitavo dia. depois de separar e lavar as células, divida-as uniformemente em tubos de microcentrífuga no gelo, cada um contendo um mínimo de 600 microlitros de células a uma densidade de 1 vez 10 para a 5ª célula por mililitro.
Adicione anticorpos aos tubos que contêm células, conforme apropriado, e incube no gelo protegido da luz por 30 minutos. Pellet as células por centrifugação a 1000 vezes G e 4 graus Celsius durante cinco minutos. Remova o sobrenadante e ressuspenda os pellets em 600 microlitros de tampão de classificação gelado.
Coe as amostras através da tampa do filtro de malha de tubos FACS de cinco mililitros e armazene as células no gelo protegidas da luz para triagem imediata das células. Para isolar células endoteliais hemogênicas por FACS, primeiro a população de células CD45-negativas. Então, dentro da população CD45-negativa, porta as células CD31-positivas.
Em seguida, dentro da população CD31-positiva, porta para a população de células VE-caderina-negativas. E então, dentro da população negativa de caderina VE, porta para as células c-Kit-positivas. Da população c-Kit-positiva, a população de células CD34-positivas.
E, finalmente, a partir da população celular CD34-positiva, identificar e coletar as células KDR-positivas. Após a semeadura de células endoteliais hemogênicas em um meio à base de metilcelulose formulado para o crescimento de células progenitoras hematopoiéticas, colônias de unidades formadoras de colônias eritróides e colônias de unidade formadora de explosão - eritróides são contadas no oitavo dia. Unidade Formadora de Colônia-Granulócito-Macrófago e Unidade Formadora de Colônia-Granulócito, Eritróide, Macrófago e Megacariócito.
Colônias progenitoras hematopoiéticas multipotentes são contadas no dia 14. Por cada 1000 células endoteliais hemogênicas plaqueadas, aproximadamente 20 unidades formadoras de colônias são geradas. Células com morfologia de células endoteliais também são visíveis nas culturas.
Estas são as células endoteliais hemogênicas que dão origem a progenitores hematopoiéticos de múltiplas linhagens em um nível de célula única. Este protocolo é um sistema de cultura livre de soro e murino 2D que pode gerar células endoteliais hemogênicas humanas em aproximadamente uma semana.
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Visão Geral
Este artigo apresenta um protocolo detalhado para a obtenção de células endoteliais hemogênicas a partir de células-tronco embrionárias humanas em aproximadamente uma semana. O método permite aos pesquisadores gerar uma população bem caracterizada dessas células, que são cruciais para o estudo da transição endotelial para hematopoiética e possuem potenciais aplicações na medicina regenerativa e na produção de derivados sanguíneos.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Biologia de células-tronco
- Biologia vascular
- Hematopoese
- Engenharia de tecidos
Contexto
- Os vasos sanguíneos são essenciais para a função tecidual e são revestidos por células endoteliais vasculares.
- As células endoteliais hemogênicas são um subtipo especializado que dá origem a células-tronco hematopoiéticas e células progenitoras durante o desenvolvimento.
- A geração dessas células in vitro é valiosa para o estudo do desenvolvimento das células sanguíneas e para possíveis aplicações terapêuticas.
- Os protocolos existentes para derivação de células endoteliais não produzem células endoteliais hemogênicas bem caracterizadas a partir de células-tronco humanas.
Objetivo do Estudo
- Estabelecer um protocolo reprodutível para gerar células endoteliais hemogênicas a partir de células-tronco embrionárias humanas.
- Permitir o estudo da regulação molecular e da transição endotelial para hematopoiética in vitro.
- Fornecer um sistema livre de células de apoio e livre de soro, adequado para aplicações posteriores.
Métodos Utilizados
- Cultura de células-tronco embrionárias humanas e diferenciação em etapas ao longo de oito dias.
- Indução das linhagens mesodérmica e endotelial utilizando fatores de crescimento específicos e moléculas pequenas (por exemplo, inibidor da GSK3β, bFGF, BMP4, VEGF-A, ácido retinóico).
- Citometria de fluxo (FACS) para seleção sequencial e isolamento de células endoteliais hemogênicas com base em marcadores de superfície (CD45-, CD31+, VE-caderina-, c-Kit+, CD34+, KDR+).
- Avaliação funcional por meio de ensaios de formação de colônias em meio baseado em metilcelulose para avaliar o potencial hematopoético.
Resultados Principais
- O protocolo produz uma população definida de células endoteliais hemogênicas em até uma semana.
- São geradas aproximadamente 20 unidades formadoras de colônias por 1000 células endoteliais hemogênicas, indicando potencial hematopoiético robusto.
- São observadas colônias de progenitores hematopoiéticos eritroides e multipotentes.
- A morfologia de células endoteliais é mantida em cultura, confirmando a identidade celular.
Conclusões
- Este protocolo livre de células de apoio e livre de soro gera eficientemente células endoteliais hemogênicas humanas a partir de células-tronco embrionárias.
- O método facilita estudos in vitro da transição endotelial para hematopoiética e da regulação molecular.
- Oferece uma plataforma para a possível geração ex vivo de produtos sanguíneos e reduz a dependência de doadores humanos.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A diferenciação direcionada de células endoteliais hemogênicas a partir de células-tronco pluripotentes humanas aborda um gargalo crítico na modelagem do desenvolvimento hematopoiético e na geração de linhagens sanguíneas ex vivo. Essa capacidade permite a desmistificação mecanicista da transição endotelial para hematopoiética e sustenta a confiança preditiva em pipelines de terapias celulares e medicina regenerativa em estágios iniciais. O design do protocolo livre de camada de sustentação e livre de soro aumenta a reprodutibilidade e escalabilidade para portfólios empresariais de P&D.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a investigação das vias moleculares que regulam a transição endotelial para hematopoiética.
- Apoia a validação funcional de alvos para fatores que influenciam a especificação da linhagem sanguínea.
- Facilita a desmistificação preditiva de alvos candidatos no desenvolvimento hematopoiético.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Fornece uma população celular padronizada e bem caracterizada para ensaios funcionais subsequentes.
- Permite a avaliação quantitativa da formação de colônias hematopoéticas a partir de progenitores definidos.
- Permite triagem reprodutível de moduladores que afetam o destino endotelial ou hematopoético.
Pesquisa Translacional e Pré-Clinica
- Estabelece uma plataforma para modelar defeitos hematopoiéticos relevantes para doenças in vitro.
- Permite a continuidade do descobrimento à validação pré-clínica de estratégias de geração de células sanguíneas.
- Apoia o avanço ajustado ao risco de conceitos terapêuticos baseados em células.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este protocolo se integra ao continuum de descoberta a pré-clínico ao permitir a geração e isolamento robustos de células endoteliais hemogênicas para estudos mecanicistas e ensaios funcionais.
- Biologia da Descoberta: Apoia testes de hipóteses sobre a regulação molecular do surgimento de linhagens sanguíneas.
- Triagem: Fornece resultados quantitativos e reprodutíveis de formação de colônias para análise comparativa.
- Análises: Oferece análise por citometria de fluxo e quantificação de colônias para leituras objetivas.
- Pesquisa Translacional: Conecta modelagem in vitro com avaliação pré-clínica do potencial hematopoiético.
- Reutilização Empresarial: Oferece um sistema escalonável e livre de células de apoio, adaptável a diferentes linhagens de células-tronco e modelos de doenças.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na modelagem da linhagem hematopoiética e na validação de alvos.
- Valor Operacional: Aprimora a padronização, reprodutibilidade e escalabilidade dos fluxos de trabalho de diferenciação celular.
- Valor Estratégico: Melhora a tomada de decisões de prosseguir ou não em programas de terapia celular e medicina regenerativa.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de candidatos terapêuticos celulares em estágios iniciais.
Considerações sobre a Implementação
- Exige experiência em protocolos de cultura e diferenciação de células-tronco pluripotentes humanas.
- Requer acesso a instrumentação de citometria de fluxo para ordenação celular multiparamétrica.
- Necessita padronização entre equipes das estratégias de seleção por portas (gating) e da quantificação de colônias.
- Adaptável a diversas linhagens de células-tronco humanas mediante otimização do protocolo.
- Depende de painéis de anticorpos validados e ensaios funcionais baseados em metilcelulose.
