Name: Corte de precisão Fatias pulmonares como uma ferramenta eficiente para ex vivo estrutura de vasos pulmonares e estudos de contratibilidade (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 8 s
Description: Aprenda a preparar fatias pulmonares de precisão em modelo murino para estudar estrutura vascular e contratilidade ex vivo. Este método preserva a arquitetura pulmonar tridimensional e permite análises funcionais e moleculares integradas.

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Os autores gostariam de agradecer aos Drs. Yuan Hao e Kaifeng Liu pelo apoio técnico. Este trabalho foi apoiado por um NIH 1R01 HL150106-01A1, a Parker B. Francis Fellowship, e o Prêmio de Pesquisa da Associação de Hipertensão Pulmonar Aldrighetti ao Dr. Ke Yuan.

Todos os cuidados com animais estavam de acordo com as diretrizes do Hospital Infantil de Boston e do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais aprovou protocolos. Os camundongos utilizados neste estudo são ratos do tipo selvagem C57/B6 e camundongos cruzados Cdh5-CreERT2 x Ai14 tdTomato.
1. Preparação de soluções
<ol><li>Prepare a solução tampão fosfato (1x PBS) e a solução de 2% de agarose necessária durante o experimento com antecedência.<ol>
<li>Misture 2 g de pó de agarose em 100 mL de água autoclavada. Aqueça-o no micro-ondas alguns segundos de cada vez até que a solução esteja clara.</li>
		<li>Coloque a solução em um banho de água a 42 °C até usar. NOTA: Tanto o PBS quanto a 2% de agarose podem ser armazenados à temperatura ambiente por semanas.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Extração do pulmão do camundongo
<ol><li>Eutanize o rato por overdose de isoflurane. Obter overdose de isoflurane colocando uma pequena quantidade de isoflurane no papel de tecido no nível inferior e colocando o rato no nível superior em um dessecador. O rato permanece no desiccator até inconsciente.</li>
	<li>Certifique-se da morte do mouse aplicando pressão inferior no pescoço e puxando caudal na cauda. Leve o mouse para a superfície de dissecação.</li>
	<li>Coloque o mouse na posição supina e fixe-o no lugar batendo patas e nariz à mesa com fita adesiva.</li>
	<li>Pulverize a superfície ventral do mouse com 70% de etanol e limpe o excesso de etanol.</li>
	<li>Levante a pele abdominal do camundongo com fórceps na localização da bexiga e corte na linha média com uma tesoura cirúrgica, movendo-se superiormente para a região cervical, expondo a traqueia.</li>
	<li>Levante a camada fascial subjacente com pinças e corte com tesoura cirúrgica para expor órgãos viscerais e compartimento mediastinal, cortando novamente inferiormente para superior.</li>
	<li>Corte o esterno no meio da linha para expor o coração e o pulmão.</li>
	<li>Usando dissecção sem cortes, retire o diafragma do fígado e do compartimento abdominal.</li>
	<li>Localize a veia cava inferior (IVC) sob os intestinos e corte o IVC.</li>
	<li>Localize o ventrículo direito. NOTA: O ventrículo direito terá uma aparência mais leve em comparação com o ventrículo esquerdo e o septo intraventricular deve ser visualizado, separando o ventrículo direito do ventrículo esquerdo.</li>
	<li>Injete 0,5 mL de heparina fracionada de 1% no ventrículo direito com uma agulha borboleta de 25-30 G e depois lave lentamente, mas firmemente com 10-15 mL de 1x PBS(Figura 1A).<ol>
<li>Tenha cuidado para não inserir a agulha através do coração e injetar heparina na cavidade mediastinal. NOTA: A injeção de 1x PBS torna o tecido pulmonar branco. O fluido extravasado da aorta abdominal deve ser claro e incolor e o fígado pode ficar branco na aparência após o sucesso da descarga.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Localize a laringe e disseque a fáscia e o tecido ao redor usando pinças de ponta cega.</li>
	<li>Coloque a sutura cirúrgica sob a traqueia e amarre um nó cirúrgico.</li>
	<li>Coloque um pequeno orifício na traqueia superior à corda e canulate com agulha de 20 G sem corte.</li>
	<li>Aperte a sutura ao redor da agulha e da traqueia usando um nó cirúrgico.</li>
	<li>Injete 2,5-4 mL de agarose na traqueia e monitore a inflação do pulmão.</li>
	<li>Depois que a agarose é incutida, despeje frio, resfriado 1x PBS sobre o pulmão para solidificar a ágarose.</li>
	<li>Corte a traqueia superior à sutura cirúrgica e disseque o pulmão e o coração do mediastino removendo quaisquer aderências e fáscia.</li>
	<li>Após a solidificação, coloque em 1x DMEM (suficiente para submergir tecido) em uma placa de Petri para manter no gelo. Corte imediatamente um lobo usando uma máquina de vibratome(Figura 1B).</li>
</ol>3. Cortes de precisão de fatias pulmonares
<ol><li>Conecte a amostra à plataforma com supercola, mantendo o lado medial da amostra voltado para cima.</li>
	<li>Encha o recipiente de amostra com 1x PBS, garantindo que a amostra esteja completamente submersa.</li>
	<li>Encha o recipiente ao redor do recipiente de amostra com gelo para manter o PBS circundante e prove frio.</li>
	<li>Ligue o vibratome e ajuste-se às configurações desejadas abaixo.<ol>
<li>Coloque a espessura em 300um.</li>
		<li>Defina a frequência para 100 Hz.</li>
		<li>Defina a amplitude para 0,6 mm.</li>
		<li>Defina a velocidade para 5 μm/s.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Usando uma chave Allen, gire o suporte da lâmina na posição segura e abra as mandíbulas para inserir uma lâmina.</li>
	<li>Aperte as mandíbulas com uma chave Allen e gire o suporte da lâmina na posição apropriada para cortar.</li>
	<li>Coloque a amostra e a plataforma sobre a caixa e deslize na frente da lâmina.</li>
	<li>Encha a caixa ao redor da plataforma de amostra com 1x PBS até que a amostra esteja submersa.</li>
	<li>Leve a lâmina vibratome até a borda do bloco e baixe manualmente a lâmina até que esteja mesmo com a parte superior da amostra.</li>
	<li>Confirme as configurações apropriadas e execute o vibratome(Figura 2).</li>
	<li>À medida que as fatias frescas são cortadas, remova as amostras do PBS e coloque-as em uma placa de Petri estéril com 10 mL de 1x DMEM contendo 1x antibiótico-antimíctico.</li>
	<li>Quando terminar, retraia a lâmina inteiramente e, em seguida, use a chave Allen para levantar a lâmina em uma posição segura.</li>
	<li>Armazene as amostras em 1x DMEM em uma incubadora a 37 °C com viabilidade preservada por até 10 dias (veja experiência de viabilidade abaixo).</li>
</ol>4. Exemplo de experimento vasoconstritor
<ol><li>Coloque uma fatia de vibratome em um slide de microscópio.</li>
	<li>Antes de colocá-lo no slide, use uma limpeza para se livrar do meio de excesso (PBS).</li>
	<li>Coloque a amostra sob microscopia de contraste de fase e use ampliação de 10-20x para identificar um vaso.</li>
	<li>Coloque 500 μL de vasoconstritores, como 60 mM KCl ou 1 μM Endothelin-1 para submergir completamente o slide.</li>
	<li>Observe e capture o vídeo gravando para 30 s-60 s(Vídeo 1).</li>
</ol>5. Preparando o tecido para RNA ou lise proteica no PCLS
<ol><li>Antes de começar o experimento, encha uma pequena caixa de espuma de poliestireno com 1 L de nitrogênio líquido.</li>
	<li>Coloque dois pequenos tubos de microcentrifuutura (1,5 mL) no recipiente com nitrogênio líquido antes de iniciar. NOTA: O nitrogênio líquido deve esfriar fora dos tubos, no entanto, não estar dentro. Certifique-se de manusear nitrogênio líquido com cuidado e não exponha a pele a nitrogênio líquido. Use fórceps e luvas para colocar e remover tubos da caixa.</li>
	<li>Coloque 4-5 fatias frescas de vibratome em uma tigela de argamassa.</li>
	<li>Despeje 5-10 mL de líquido N2 em cima das fatias na tigela de argamassa.</li>
	<li>Use rapidamente o pilão para moer as fatias de congelamento de flash em pó antes que o nitrogênio líquido evapore. NOTA: O tecido deve condensar em um pó fino. Se não, adicione nitrogênio líquido adicional até ser alcançado.</li>
	<li>Usando um scooper de laboratório de aço (pré-eded com nitrogênio líquido), colher o pó nos dois tubos de microcentrifuuge refrigerados.</li>
	<li>Lise o pó adicionando 500 μL de reagente de extração de RNA para prosseguir com o isolamento de RNA ou 500 μL de tampão RIPA (contém 1x inibidores de protease) para prosseguir com a lise proteica.</li>
	<li>Armazene as amostras a -80 °C até o isolamento adicional do RNA, medição de BCA e mancha ocidental.</li>
</ol>6. Determinando a viabilidade
<ol><li>Após a preparação do vibratome, coloque duas fatias pulmonares em uma placa de cultura de 24 poços com 450 μL de mídia DMEM e 50 μL de reagente de viabilidade celular (certifique-se de que o tecido está totalmente submerso).</li>
	<li>Coloque as amostras de volta em 5% de CO2 a 37 °C da incubadora durante a noite com exposição mínima à luz.</li>
	<li>Pela manhã, observe a solução para a mudança de cor. A solução azul fica rosa quando o tecido é viável.</li>
</ol>7. Preservação da rotulagem celular
<ol><li>Trate um Cdh5-CreERT2 transgênico cruzado com o mouse Ai14 tdTomato com uma injeção IP de Tamoxifen (2 mg/dia) por um total de 5 dias (dose total de 10 mg tamoxifen) para induzir células positivas de rótulo TdTomato.</li>
	<li>Uma semana após a injeção, prepare os pulmões usando os passos acima 1 a 3.</li>
	<li>Após a preparação da fatia pulmonar cortada com precisão, coloque o tecido em uma lâmina de microscópio e coloque uma mancha de cobertura em cima do tecido.</li>
	<li>Use um microscópio confocal para detectar a coloração do TdTomato (usando comprimento de onda de excitação 555 nm).</li>
</ol>

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<li>Gerckens, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human+3D+lung+tissue+cultures+%283D-LTCs%29+for+disease+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Generation of human 3D lung tissue cultures (3D-LTCs) for disease modeling.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (144), e58437(2019).</li>
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</ol>

Os autores não têm conflitos de interesse para divulgar.

Neste manuscrito, descreve-se um método aprimorado para produzir imagens de alta resolução do tecido pulmonar murino que preserva a estrutura vascular e otimiza a flexibilidade experimental, utilizando especificamente a aplicação do PCLS para obter microsapos de tecido pulmonar que podem ser visualizados em três dimensões com contrariedade preservada da vasculatura. Usando o reagente de viabilidade, o protocolo demonstra que fatias cuidadosamente preparadas e preservadas podem reter viabilidade por mais de uma semana. A ...

Avanços na preparação e imagem do tecido pulmonar que preserva componentes celulares sem sacrificar a estrutura anatômica fornecem uma compreensão detalhada das doenças pulmonares. A capacidade de identificar proteínas, RNA e outros compostos biológicos, mantendo a estrutura fisiológica, oferece informações vitais sobre o arranjo espacial das células que podem ampliar a compreensão da fisiopatologia em inúmeras doenças pulmonares. Essas imagens detalhadas podem levar a uma melhor compreensão de doenças vasculares pulmonares, como a hipertensão arterial pulmonar, quando aplicadas a modelos animais, potencialmente levando a melhores estratégias terapêuticas.
Apesar dos avanços tecnológicos, a obtenção de imagens de alta qualidade do tecido pulmonar murino continua sendo um desafio. O ciclo respiratório é impulsionado por uma pressão intratorácica negativa gerada durante a inalação1. Ao tradicionalmente obter biópsias e preparar amostras pulmonares para imagem, o gradiente de pressão negativa é perdido resultando no colapso das vias aéreas e da vasculatura, que não se representa mais em seu estado atual. Para alcançar imagens realistas refletindo as condições atuais, as vias aéreas pulmonares devem ser reinfladas, e a vasculatura perfundida, transformando o pulmão dinâmico em uma luminária estática. A aplicação dessas técnicas distintas permite a preservação da integridade estrutural, vasculatura pulmonar e componentes celulares, incluindo células imunes, como macrófagos, permitindo que o tecido pulmonar seja visto o mais próximo possível de seu estado fisiológico.
O corte de precisão do corte pulmonar (PCLS) é uma ferramenta ideal para estudar a anatomia e a fisiologia da vasculatura pulmonar2. O PCLS fornece imagens detalhadas do tecido pulmonar em três dimensões, preservando componentes estruturais e celulares. O PCLS tem sido usado em modelos animais e humanos para permitir imagens vivas e de alta resolução de funções celulares em três dimensões, tornando-se uma ferramenta ideal para estudar potenciais alvos terapêuticos, medir a contração das pequenas vias aéreas e estudar a fisiopatologia de doenças pulmonares crônicas como DPOC, ILD e câncer de pulmão3. Utilizando técnicas semelhantes, a exposição de amostras de PCLS a vasoconstritores pode preservar a estrutura pulmonar e a contratilidade do vaso, replicando condições in vitro. Juntamente com a preservação da contratilidade, as amostras preparadas podem passar por análises adicionais, como sequenciamento de RNA, mancha ocidental e citometria de fluxo quando preparadas corretamente. Finalmente, as células rotuladas de cor repórter marcadas com fluorescência tdTomato após a colheita pulmonar podem preservar a rotulagem após o preparo de microslices, tornando-a ideal para estudos de rastreamento celular. A integração dessas técnicas proporciona um modelo sofisticado preservando o arranjo espacial das células e da contratude dos vasos que podem levar a uma compreensão mais detalhada das cascatas sinalizadoras e potenciais opções terapêuticas na doença da vasculatura pulmonar.
Neste manuscrito, o tecido pulmonar murino PCLS é exposto a vasoconstritores, demonstrando integridade estrutural preservada e contratlidade do vaso. O estudo demonstra que o tecido preparado e manuseado adequadamente pode permanecer viável por 10 dias. O estudo também demonstra a preservação de células com fluorescência endógena (tdTomato), permitindo que as amostras forneçam imagens de alta resolução da vasculatura pulmonar e da arquitetura. Finalmente, foram descritas formas de manusear e preparar fatias de tecido para a medição do RNA e da mancha ocidental para investigar mecanismos subjacentes.

<table><tbody><tr><td>0,5cc de heparina fracionada em seringa</td><td>BD</td><td>100 unidades USP por mL</td><td></td></tr><tr><td>1X PBS</td><td>Corning</td><td>&nbsp; 21-040-CM</td><td></td></tr><tr><td>20 1/2 polegada calibre agulha de extremidade romba para canulação de traqueia</td><td>Cml Supply</td><td>90120050D</td><td></td></tr><tr><td>30cc seringa</td><td>BD</td><td>309650</td><td></td></tr><tr><td>Anti solução</td><td>Gibco</td><td>15240096</td><td></td></tr><tr><td>Micrótomo de lâmina vibratória automatizada</td><td>Leica</td><td>VT1200S</td><td></td></tr><tr><td>Reagente de viabilidade celular (alamarBlue)</td> <td>Thermofisher</td><td>DAL1025</td><td></td></tr><tr><td>Confocal</td><td>Zeiss</td><td>880</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Modified Eagle Medium e GLutaMAX, suplementado com 10% FBS, 1% Pen/Strep</td><td>Gibco</td><td>10569-010</td><td></td></tr><tr><td>Endothelin-1</td><td>Sigma</td><td>E7764</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>7447-40-7</td><td></td></tr><tr><td>Almofariz e pilão</td><td>Amazon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RIPA lise e tampão de extração</td><td>Thermoscientific</td><td>89900</td><td></td></tr><tr><td>Sutura cirúrgica 6/0</td><td>FST</td><td>18020-60</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol Reagente</td><td>Invitrogen, Thermofisher</td><td>15596026</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Baixo Ponto de Fusão Agarose</td><td>Invitrogen</td><td>16520050</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica Biosystems</td><td>VT1200 S</td><td></td></tr><tr><td>Conjunto de coleta de sangue alado (agulha borboleta) 25-30G</td><td>BD</td><td>25-30G</td><td></td></tr></tbody></table>

corte de precisão fatias pulmonares como uma ferramenta eficiente para ex vivo estrutura de vasos pulmonares e estudos de contratibilidade

Precision Cut Lung Slices as an Efficient Tool for Ex vivo Pulmonary Vessel Structure and Contractility Studies

A visualização do tecido pulmonar murino fornece informações estruturais e celulares valiosas sobre as vias aéreas subjacentes e a vasculatura. No entanto, a preservação de vasos pulmonares que realmente representam condições fisiológicas ainda apresenta desafios. Além disso, a delicada configuração dos pulmões murinos resulta em desafios técnicos na preparação de amostras para imagens de alta qualidade que preservam tanto a composição celular quanto a arquitetura. Da mesma forma, ensaios de contrailidade celular podem ser realizados para estudar o potencial das células para responder aos vasoconstritores in vitro,mas esses ensaios não reproduzem o ambiente complexo do pulmão intacto. Em contraste com essas questões técnicas, o método de corte de precisão da fatia pulmonar (PCLS) pode ser aplicado como uma alternativa eficiente para visualizar o tecido pulmonar em três dimensões sem viés regional e servir como um modelo de contração de substituto vivo por até 10 dias. Tecido preparado com PCLS tem estrutura preservada e orientação espacial, tornando-se ideal para estudar processos de doença ex vivo. A localização de células etiquetadas tdTomato endógenas em PCLS colhidas a partir de um modelo de murina tdTomato indutível pode ser visualizada com sucesso por microscopia confocal. Após a exposição aos vasoconstritores, o PCLS demonstra a preservação tanto da contração do vaso quanto da estrutura pulmonar, que pode ser capturada por um módulo de lapso de tempo. Em combinação com os outros procedimentos, como a análise da mancha ocidental e do RNA, o PCLS pode contribuir para a compreensão abrangente das cascatas sinalizadoras que sustentam uma ampla variedade de distúrbios e levam a uma melhor compreensão da fisiopatologia em doenças vasculares pulmonares.

Quando adicionado às células ou tecidos, o reagente de viabilidade é modificado pelo ambiente redutor do tecido viável e fica rosa/vermelho, tornando-se altamente fluorescente. As alterações de cor representativas detectadas a partir do dia 0-1 e do dia 9-10 são demonstradas na Figura 3. Como observado, a solução começou azul e ficou rosa da noite para o dia, demonstrando viabilidade. A mudança de cor normalmente ocorre dentro de 1-4 h; no entanto, um tempo maior pode ser necessário. Para av...

Apresentado aqui é um protocolo para preservar a contração vascular do tecido pulmonar murino PCLS, resultando em uma imagem tridimensional sofisticada da vasculatura pulmonar e das vias aéreas, que pode ser preservada por até 10 dias suscetíveis a inúmeros procedimentos.

Corte de precisão Fatias pulmonares como uma ferramenta eficiente para ex vivo estrutura de vasos pulmonares e estudos de contratibilidade

The visualization of murine lung tissue provides valuable structural and cellular information regarding the underlying airway and vasculature. However, ...

O método de corte de precisão das fatias pulmonares preservará a estrutura e as orientações espaciais em três dimensões sem viés regional e poderá servir como um modelo de substituto vivo para as medidas de contração de vasos e vias aéreas. Em combinação com imagens de lapso de tempo, bolha ocidental e análise de RNA, as fatias pulmonares cortadas com precisão contribuem para a compreensão abrangente das cascatas sinalizadoras que sustentam uma grande variedade de distúrbios e levam a uma melhor compreensão da fisiopatologia em doenças vasculares pulmonares. Para começar, coloque o rato adulto eutanizado em uma posição supina e fixe-o no lugar, gravando as patas e o nariz na mesa com fita adesiva.Pulverize a superfície ventral do mouse com 70% de etanol. Use fórceps para levantar a pele abdominal do camundongo na localização da bexiga e tesoura cirúrgica para cortar na linha média, movendo-se superiormente para a região cervical para expor a traqueia. Em seguida, use pinças para levantar a camada de fáscia subjacente e usar tesoura cirúrgica para expor os órgãos viscerais e compartimento mediastinal, novamente cortando inferiormente para superior.Corte o esterno no meio da linha para expor o coração e o pulmão. Disseca o diafragma cuidadosamente do fígado e do compartimento abdominal. Localize a veia cava inferior sob os intestinos e corte-a.Depois de localizar o ventrículo direito, use uma agulha borboleta de 25 a 30 para injetar 0,5 mililitros de heparina fracionada de 1% no ventrículo direito e lavá-lo lentamente, mas de forma constante, com 10 a 15 milímetros de PBS. Depois de localizar a laringe, use pinças de ponta sem corte para dissecar a fáscia e tecido circundante, em seguida, coloque a sutura cirúrgica sob a traqueia e amarre livremente um nó cirúrgico. Coloque um pequeno orifício na traqueia superior à corda e cannulate com uma agulha de ponta sem corte de 20 bitolas.Aperte a sutura ao redor da agulha e da traqueia usando um nó cirúrgico. Em seguida, injete de 2,5 a 4 mililitros de agarose na traqueia e monitore a inflação do pulmão. Após a injeção de agarose, despeje pbs frio sobre o pulmão para solidificar a agarose.Em seguida, corte a traqueia superior à sutura cirúrgica e disseque o pulmão e o coração do mediastino removendo quaisquer aderências e fáscia. Após a solidificação, coloque o tecido em DMEM em uma placa de Petri no gelo, e imediatamente prossiga para cortar um lobo usando uma máquina de vibratome. Para preparar as fatias pulmonares, conecte a amostra à plataforma com supercola, mantendo o lado medial voltado para cima.Em seguida, encha o recipiente de amostra com PBS. Encha o recipiente com gelo para manter o PBS circundante e prove frio. Ligue o vibratome.Ajuste a espessura para 300 micrômetros, frequência de 100 Hertz, amplitude para 0,6 milímetros e velocidade para cinco micrômetros por segundo. Usando uma chave Allen, gire o suporte da lâmina na posição segura e abra as mandíbulas para inserir uma lâmina. Em seguida, aperte as mandíbulas com uma chave allen.Coloque a amostra sobre a caixa, garantindo que ela esteja submersa em PBS. Deslize a caixa para cima na posição correta e certifique-se de que está segura. Gire o suporte da lâmina na posição apropriada para cortar.Leve a lâmina vibratome até a borda do bloco e baixe manualmente a lâmina até que esteja mesmo com a parte superior da amostra. Confirme as configurações e execute o vibratome. Depois que as fatias frescas forem cortadas, remova as amostras do PBS e coloque-as em uma placa de Petri estéril com 10 mililitros de DMEM contendo antibiótico antimíctico único.Depois de colocar todas as fatias em uma placa de Petri, retraia a lâmina inteiramente e use a chave Allen para levantar a lâmina em uma posição segura. Armazene as amostras em DMEM a 37 graus Celsius. E coloque uma fatia de vibratome em um slide de microscópio.Use uma limpeza para remover o excesso de meio. Coloque a amostra na microscopia de contraste de fase e use ampliação de 10 a 20X para identificar um vaso. Em seguida, adicione 500 microliters de vasoconstritores, como 60 milimolars de cloreto de potássio ou uma endotelina micromolar-1 para submergir completamente o slide.Observe e capture o vídeo gravando por 30 a 60 segundos. Antes de começar o experimento, encha uma pequena caixa de espuma de poliestireno com um litro de nitrogênio líquido e coloque dois tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitro no recipiente com nitrogênio líquido. Coloque de quatro a cinco fatias frescas de vibratome em uma tigela de argamassa.Despeje de 5 a 10 mililitros de nitrogênio líquido em cima das fatias e use rapidamente o pilão para moer as fatias em pó antes que o nitrogênio líquido evapora. Use um scooper de laboratório de aço pré-refrigerado para colher o pó nos dois tubos de microcentrifuuge refrigerados e lise o pó adicionando 500 microliters de reagente de extração de RNA para isolamento de RNA ou 500 microliters de tampão RIPA para lise proteica. No experimento de viabilidade representativa, a mudança de cor das fatias do PCLS foi detectada do dia zero ao um e do dia 9 a 10.A solução foi inicialmente azul e ficou rosa da noite para o dia, demonstrando viabilidade. A mudança de cor normalmente ocorreu dentro de uma a quatro horas, mas um tempo maior pode ser necessário. A diferença diária entre a absorvância em 562 e 613 comprimentos de onda nanômetros para o tecido preparado por vibratome é mostrada aqui.A constrição da vasculatura em um tecido pulmonar preparado por vibratome usando endotelina-1 e cloreto de potássio pode ser visualizada aqui. A preservação da rotulagem tdTomato nas células uma semana após a injeção de tamoxifeno é demonstrada nessas fatias pulmonares. É mais importante realizar a limpeza pulmonar e a inflação passo bem para remover todo o sangue de circulação antes de experimentos adicionais e imagens.Além das doenças vasculares, o PCLS pode ser aplicado para estudar fisiobiologia de doenças relacionadas às vias aéreas, podendo ser testado em tecidos pulmonares humanos em cenários clinicamente relevantes.

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Medicine

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As culturas de explante de tecido primário organotípico, que incluem fatias de corte preciso, representam a arquitetura tridimensional (3-D) do tecido, bem como as interações multicelulares do tecido nativo. Este vídeo descreve a cultura de fatias de tecido derivado de tumor de pulmão murino usando uma unidade de incubação rotativa, um sistema que permite a exposição intermitente dos tecidos ao oxigênio e nutrientes. O protocolo descreve a metodologia para gerar e cultivar fatias de tumor de...

Cultura de explante de tecido de tumor de pulmão: um procedimento para gerar e cultivar fatias de tumor de pulmão cortadas com precisão

Neste vídeo, descrevemos um procedimento para inflar pulmões humanos isolados com agarose e preparar cortes de pulmão humanos cortados com precisão. As fatias de pulmão ex vivo preparadas podem ser usadas para outros experimentos imunológicos.

Preparação à base de agarose de fatias de pulmão humanas cortadas com precisão

A vasoconstrição pulmonar hipóxica (HPV) é um importante fenômeno fisiológico pelo qual a perfusão pulmonar de hipóxia alveolar é compatível com a ventilação. O principal segmento vascular que contribui para o HPV é a artéria intra-acinar. Aqui, descrevemos nosso protocolo para a análise do HPV de vasos pulmonares murinas com diâmetros de 20-100 μm.

Análise videomorfométrica da vasoconstrição pulmonar hipoxica de artérias intra-pulmonares usando fatias pulmonares cortadas por precisão de murina

Descreve-se um método para a geração de corte de precisão pulmonar fatias (PCLS) e imunocoloração-los para visualizar a localização de vários tipos de células imunitárias no pulmão. Nosso protocolo pode ser estendido para visualizar a localização e função de muitos tipos diferentes de células sob uma variedade de condições.

Rato pulmão Slices para Visualize células vivas pulmonar dendríticas precisão de corte

Tendo em conta o princípio dos 3R, modelos respiratórios como alternativas para estudos animais estão evoluindo. Especialmente para a avaliação dos riscos das substâncias respiratórias, há uma falta de ensaios adequados. Aqui, descrevemos o uso de fatias de pulmão humano de precisão de corte para a avaliação de substâncias no ar.

Avaliação do citotóxicos e efeitos imunomoduladores de substâncias no pulmão humano de precisão de corte fatias

Este protocolo fornece um método simples e confiável para a produção de fatias hepáticas de corte de precisão viável de camundongos. As amostras de tecido ex vivo podem ser mantidas condições de cultura de tecidos de laboratório por vários dias, fornecendo um modelo flexível para examinar a patobiologia hepática.

Murine Precision-Cut Liver Slices como um modelo ex vivo de biologia hepática

Este protocolo descreve um método para gerar tecidos pulmonares projetíveis, de pequena escala, repovoando fatias pulmonares descelularizadas cortadas com células epiteliais tipo 2 alveolares, fibroblastos e células endoteliais.

Tecidos pulmonares projetados preparados a partir de fatias pulmonares descelularizadas

O presente protocolo descreve a preparação e utilização de fatias pulmonares cortadas com precisão do rato para avaliar as vias aéreas e a contratilidade muscular liso arterial intrapulmonar em um ambiente quase in vivo .

Utilizando a fatia pulmonar cortada com precisão para estudar a regulação contratil das vias aéreas e do músculo liso arterial intrapulmonar

Desenvolvemos uma técnica de processamento tecidual utilizando tecido pulmonar embebido em vibratótomo e agarose para gerar cortes pulmonares, permitindo a aquisição de imagens de alta resolução da arquitetura pulmonar. Empregamos a coloração de imunofluorescência para observar a expressão proteica espacial usando marcadores estruturais pulmonares específicos.

Secção Automatizada por Vibratomo de Tecido Pulmonar Incorporado em Agarose para Imagem por Fluorescência Multiplex

Aqui, descrevemos um protocolo simples e econômico para realizar a quantificação imparcial da densidade microvascular pulmonar para tecido pulmonar de camundongos inteiros usando coloração única de Isolectina B4.

Quantificando a densidade microvascular pulmonar em camundongos através de lóbulos

Aprenda a preparar fatias pulmonares de precisão em modelo murino para estudar estrutura vascular e contratilidade ex vivo. Este método preserva a arquitetura pulmonar tridimensional e permite análises funcionais e moleculares integradas.

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