Name: In vitro Análise da Função Ligase E3 Ubiquitin (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 6 s
Description: Aprenda a analisar a função da ligase E3 ubiquitina in vitro, incluindo especificidade de E2, seleção de substratos e transferência de ubiquitina. Este método permite avaliar a atividade catalítica de ligases E3 usando proteínas recombinantes.

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Agradecemos aos membros do nosso laboratório por discussão crítica e conselhos úteis sobre o manuscrito. Pedimos desculpas por não ter citado contribuições valiosas devido à limitação de tamanho. Este trabalho é apoiado pela Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, German Research Foundation) - SFB 1218 - Projektnumber 269925409 e Cluster of Excellence EXC 229/ CECAD to TH. Este trabalho foi financiado pela Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, German Research Foundation) sob a Estratégia de Excelência da Alemanha - EXC 2030 - 390661388 e - SFB 1218 - Projektnumber 269925409 à T.H. Diese Arbeit wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) im Rahmen der deutschen Exzellenzstrategie - EXC 2030 - 390661388 und - SFB 1218 - Projektnummer: 269925409 um T.H. gefördert.

1. Preparação de tampões e reagentes
NOTA: Buffers e reagentes que foram preparados manualmente no laboratório estão listados abaixo. Todos os outros buffers e reagentes utilizados nos protocolos foram comprados de diferentes fontes e utilizados de acordo com as instruções dos fabricantes.
<ol><li>Prepare 10x salina tamponada com fosfato (10x PBS). Para isso, misturar 1,37 M de cloreto de sódio (NaCl), cloreto de potássio de 27 mM (KCl), 80 mM de dihidrato de dissódio-hidrogênio-fosfato (Na2HPO4.2 H2O), e 20 mM de fosfato de potássio-dihidrogênio (KH2PO4) em 1 L de H2O destilado duplo (ddH2O). Autoclave o PBS 10x, e prepare uma solução PBS 1x em ddH2O.<ol>
<li>A autoclavagem é realizada por 15 min a 121 °C e 98,9 kPa. NOTA: A autoclavagem é realizada nessas condições para todos os buffers e soluções. Se não for indicado de outra forma, as soluções são armazenadas à temperatura ambiente (RT).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prepare 1 L de solução PBS-Tween (PBS-T) adicionando 0,1% Tween a 1 L de 1x PBS.</li>
	<li>Prepare 10 mL de uma solução de estoque de L-lysine de 0,5 M L dissolvendo L-lysine em ddH2O. Aliquot L-lysine em porções de 1 mL, e armazene-as a -20 °C até uso adicional. NOTA: A l-lysina pode ser congelada e descongelada repetidamente.</li>
	<li>Prepare uma solução de 0,25 M de diamina de diamina tetra actic (EDTA) dissolvendo EDTA em 200 mL de ddH2O.<ol>
<li>Ajuste o pH para 8,0 com hidróxido de sódio (NaOH).</li>
		<li>Ajuste o volume para 250 mL com ddH2O.</li>
		<li>Autoclave a solução.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prepare 10 mL de uma solução de albumina de soro bovino de 20 mg/mL (BSA) dissolvendo bsa em ddH2O. Armazene a -20 °C em 200 alíquotas μL. NOTA: A BSA pode ser congelada e descongelada repetidamente.</li>
	<li>Prepare 1 L de 2-(N-morpholino)ácido sulfônico de etano (MES) dissolvendo 50 mM MES, 50 mM Base Tris, 3,47 mM sulfato de dodecyl de sódio (SDS) e 1,03 mM EDTA em 0,9 L de ddH2O. Depois de misturar corretamente, ajuste o volume para 1 L.<ol>
<li>O pH do buffer 1x é 7.6. Não ajuste o pH com ácido ou base.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prepare 200 mL de solução de bloqueio (5% de leite) dissolvendo 10 g de leite em pó em 1x PBS-T. Armazene a solução de bloqueio a 4 °C por até uma semana.</li>
	<li>Prepare 1 L de tampão de transferência (ver a Tabela de Materiais) de acordo com a instrução do fabricante.</li>
	<li>Prepare o buffer de amostra SDS 2x dissolvendo a base tris de 125 mM, 4% SDS, 4% glicerol, 0,03% azul bromofenol e 50 μL/mL de β-mercaptoethanol em 50 mL ddH2O. Aliquot em porções de 1 mL, e armazenar a -20 °C até usar.</li>
</ol>2. Ensaio de auto-ubiquização in vitro
<ol><li>Preparação e execução de ensaios<ol>
<li>Calcule o volume de cada reagente necessário por reação com base nas molaridades dadas das proteínas e nas concentrações proteicas das soluções proteicas. Por reação de auto-ubiquização, use 100 nM E1, 1 μM E2, 1 μM E3 e 50 μM Ub. Ajuste o volume da reação para 20 μL com ddH2O. NOTA: A solução ATP e o buffer de ubiquização foram comprados como soluções de estoque 10x e usados em 1x.</li>
		<li>Prepare um esquema de pipetting para todas as reações. Teste nove enzimas E2 diferentes para sua capacidade de funcionar (I) com CHIP, (II) com um mutante CHIP (H260Q) catalíticomente inativo, e (III) sem CHIP em reações individuais de ubiquização.</li>
		<li>Para evitar erros de pipetação, prepare uma mistura mestre no gelo que contenha o volume necessário para todas as reações mais uma reação extra. Calcule a quantidade de mistura mestre necessária por reação. NOTA: Os componentes do mix mestre são reagentes igualmente necessários para cada reação, ou seja,., E1, E3, Ub, ATP e tampão de ubiquização.</li>
		<li>Adicione ddH2O e misture mestremente aos tubos de reação de corrente de polimerase (PCR). Mantenha os tubos no gelo.</li>
		<li>Antes de iniciar as reações de ubiquização adicionando as enzimas E2, configure um ciclo de calor PCR com o seguinte programa: 2 h, 37 °C seguido de 4 °C, infinitamente.</li>
		<li>Adicione 1 μM das enzimas E2 nos respectivos tubos e incubar as amostras no ciclo térmico PCR pelo período de tempo indicado.</li>
		<li>Depois de 2h, adicione o buffer de amostra SDS a cada reação e misture por pipetação para cima e para baixo várias vezes. NOTA: O volume necessário do buffer amostral depende da concentração de estoque do buffer amostral. Aqui, 20 μL de tampão amostra de SDS 2x foram adicionados a cada reação.</li>
		<li>Ferva as amostras imediatamente a 95 °C por 5 min, e continue com eletroforese de gel de poliacrilamida (PAGE). Armazene as proteínas desnaturadas a -20 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Eletroforese de gel e mancha ocidental<ol>
<li>Após o descongelamento, gire as amostras por aproximadamente 10 s e carregue o gel SDS-PAGE. Use uma escada de proteína como referência de tamanho. NOTA: Aqui, foram utilizados 4-12% géis gradientes Bis-Tris e 3 μL de escada proteica. Divida os volumes amostrais e carregue dois géis igualmente usando 20 μL de cada amostra.</li>
		<li>Execute o gel em 160-200 V por aproximadamente 30-45 min para que a frente da amostra atinja a parte inferior do gel.</li>
		<li>Transfira cada gel para um recipiente plástico cheio de tampão de manchas semidry e incuba-o por 2-5 min na RT. Remova o gel de empilhamento.</li>
		<li>Prepare duas peças de papel de mancha do tamanho de gel e uma membrana de nitrocelulose do tamanho de gel por gel SDS e pré-mergulhe em tampão de manchas semidry. Monte o sanduíche de mancha ocidental (WB) em uma câmara WB de baixo para cima na seguinte ordem: papel manchador, membrana nitrocelulose, gel SDS-PAGE, papel de mancha.</li>
		<li>Remova bolhas de ar que podem ter ficado presas entre as camadas do sanduíche. Para isso, use um rolo para rolar cuidadosamente o sanduíche algumas vezes.</li>
		<li>Feche a câmara e deixe o excesso de tampão de manchas drenar.</li>
		<li>Coloque a câmara no respectivo dispositivo de manchas e utilize o seguinte programa para manchas semidórias: 25 V, 1,0 A, 30 min.</li>
		<li>Transfira a membrana manchada para um recipiente plástico cheio de solução de bloqueio e incuba por 30 minutos na RT.</li>
		<li>Prepare a solução de anticorpos primário adicionando o anticorpo a 10 mL de PBS-T contendo um reagente de bloqueio (ver a Tabela de Materiais). NOTA: A concentração de trabalho do anticorpo é específica de anticorpos. Neste caso, um anticorpo anti-ubiquitina de camundongo monoclonal foi usado em uma diluição de 1:5.000. Para o segundo gel, um anticorpo anti-CHIP de coelho monoclonal foi usado em 1:5.000 em PBS-T/reagente de bloqueio.</li>
		<li>Substitua a solução de bloqueio pela solução de anticorpos primários e incuba durante a noite a 4 °C em um roqueiro.</li>
		<li>Lave a membrana três vezes por 10 minutos com PBS-T.</li>
		<li>Prepare a solução de anticorpos secundários adicionando o respectivo anticorpo a 10 mL de PBS-T. NOTA: Aqui, anticorpos anti-rato e camundongos são usados em uma diluição de 1:10.000.</li>
		<li>Incubar a membrana com o anticorpo secundário por 1 h no RT em um roqueiro.</li>
		<li>Lave a membrana três vezes por 5 minutos com PBS-T.</li>
	</ol></li>
	<li>Análise de dados<ol>
<li>Adicione reagentes de detecção de manchas ocidentais para anticorpos conjugados por rabanete (HRP) à membrana lavada de acordo com as instruções do fabricante e capture o sinal HRP usando películas de raios-X ou uma câmera de dispositivo acoplada a carga(Figura 1).</li>
	</ol></li>
</ol>3. Ensaio de ubiquização de substrato in vitro
<ol><li>Preparação e execução de ensaios<ol>
<li>Calcule o volume de cada reagente necessário por reação, com base nas molaridades dadas das proteínas e nas concentrações proteicas das soluções proteicas. Por reação de ubiquização substrato, use 100 nM E1, 1 μM E2, 1 μM E3, 1 μM substrato e 50 μM Ub. Use solução ATP 10x e tampão de ubiquização de 10x em 1x. Ajuste o volume da reação de ubiquização do substrato para 20 μL com ddH2O.</li>
		<li>Prepare um esquema de pipetting para todas as reações. Inclua reações de controle adequadas verificando se a ubiquização do substrato é específica do E3. Use a proteína UNC-45B como um substrato representativo do CHIP e um mutante CHIP cataticamente inativo (H260Q) como controle. Preparar as seguintes reações: E1, E2, Ub mix (incluindo Ub, ATP, tampão de ubiquidade); E1, E2, Ub mix, UNC-45B; E1, E2, Ub mix, CHIP(H260Q), UNC-45B; e E1, E2, Ub mix, CHIP, UNC-45B.</li>
		<li>Para evitar erros de pipetação, prepare uma mistura mestre no gelo que contenha o volume necessário para todas as reações mais uma reação extra. Calcule o volume da mistura mestre que é necessária por reação. NOTA: Os componentes de mixagem mestre para este ensaio incluem E1, E2, Ub, ATP e tampão de ubiquidade.</li>
		<li>Adicione componentes de reação na seguinte ordem: ddH2O, substrato, ligadura E3.</li>
		<li>Antes de iniciar a reação de ubiquização por adição do mix mestre, configure um cicloviário térmico PCR com o seguinte programa: 2 h, 37 °C seguido de 4 °C, infinitamente.</li>
		<li>Adicione a mistura mestre a cada tubo e incuba as amostras no ciclo-de-tempo térmico PCR pelo período de tempo indicado.</li>
		<li>Depois de 2 h, adicione 2x tampão de amostra SDS a cada reação, e misture por pipetar para cima e para baixo várias vezes.</li>
		<li>Após a corrida, ferva as amostras imediatamente a 95 °C por 5 minutos e continue com PAGE. Alternativamente, armazene as proteínas desnaturadas a -20 °C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Eletroforese de gel e mancha ocidental<ol>
<li>Realize eletroforese de gel e mancha ocidental conforme descrito na seção 2.2. Utilize anticorpos específicos para a detecção do substrato e da ligadura E3, respectivamente. NOTA: Aqui, o UNC-45B é fundido a uma etiqueta de proteína de polipeptídeo derivada do produto genético c-myc que permite o uso de um anticorpo anti-MYC de camundongo monoclonal. O Anti-MYC é usado em 1:10.000.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Análise de dados<ol>
<li>Realizar análise de dados conforme descrito na seção 2.3 (Figura 2).</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Ensaio de descarga de lysina
<ol><li>Preparação e execução de ensaios<ol><li>Carregamento da enzima E2 com Ub by E1<ol>
<li>Calcule o volume de cada reagente necessário por reação com base nas molaridades dadas das proteínas e nas concentrações proteicas das soluções proteicas. Por reação de carregamento, use 2 μM E1, 4 μM E2 e 4 μM sem ubiquitina (Ub K0). Use 10x ATP e 10x ubiquitylation buffer em 1x. Ajuste o volume da reação de carregamento para 20 μL com ddH20. NOTA: O mutante Ub K0 semlise semlise é usado para impor a produção exclusiva do E2 mono-ubinciítulado. Ub tipo selvagem também pode ser usado; no entanto, isso pode levar a diversas modificações de E2~Ub (por exemplo,poli-ubiquidade do E2), que são mais difíceis de analisar. Para uso pela primeira vez ou ao usar uma nova enzima E2, determine o nível de carregamento ub no E2 que pode ser alcançado pelo E1. Para determinar o rendimento do carregamento, visualize o E2 não carregado via coloração Coomassie. Aqui, aproximadamente metade do Ub K0 foi convertido de forma confiável para UBE2D2~Ub ao usar relações equimolar de UBE2D2 e Ub K0(Figura Suplementar S2A).</li>
			<li>Prepare um esquema de pipetação para a reação de carregamento. Ajuste o volume da reação de carregamento às reações de descarga subsequentes de escolha, por exemplo,use CHIP e CHIP(H260Q) em reações individuais de descarga. Assim, prepare o dobro do volume de uma reação de carregamento. NOTA: Para uso pela primeira vez, teste diferentes concentrações da ligadura E3 de escolha para monitorar as condições ideais de descarga e analise-as por manchas ocidentais. Em uma condição ideal, a descarga de Ub a partir de E2 aumentará com o tempo até que a respectiva banda de proteína E2~Ub desapareça.</li>
			<li>Incubar a reação de carregamento por 15 min a 37 °C.</li>
		</ol></li>
		<li>Término da reação de cobrança<ol>
<li>Pare a reação de carregamento por adição de apyrase em uma concentração final de 1,8 U/mL. Realizar a incubação com apiráse por 5 min na RT, seguido pela adição de EDTA em uma concentração final de 30 mM. Ajuste o volume da reação de carregamento para 30 μL com ddH2O. NOTA: A apyrase é usado para converter moléculas DE ATP em moléculas de ADP (difosfato de adenosina). Como a atividade da enzima E1 é dependente de ATP, o E1 não pode mais carregar o E2. O EDTA é adicionalmente usado para garantir que o E1 seja inibido pela extinção de íons Mg2+ que são cofatores necessários para o E1. O volume de apirase necessário para parar a reação pode variar entre as condições de ensaio. Embora a apyrase por si só já sacia as moléculas atp disponíveis, uma combinação de apyrase e EDTA foi mais eficaz em parar a reação de carregamento para o par E1-UBE2D2. Como parar a reação é um fator crítico para a reprodutibilidade do ensaio, uma parada eficiente deve ser testada para novos pares E1-E2. Para isso, configure uma reação de carregamento, pare-a e colete amostras em pontos de tempo específicos, por exemplo,depois de 2, 5, 10 e 15 minutos. Os níveis não alterados de E2~Ub indicam que a reação parou, e que o tioester ficou estável durante esse período de tempo(Figura Suplementar S2B).</li>
		</ol></li>
		<li>Descarregamento de E2~Ub por E3<ol>
<li>Prepare quatro tubos correspondentes aos diferentes pontos de tempo (t0, t1, t2, t3); adicionar tampão amostral não redutor (6,7 μL de tampão de sulfato de dodecyl de lítio 4x (LDS) a cada tubo. NOTA: Não utilize agente redutor no buffer de amostra.</li>
			<li>Remova 6 μL da reação de carregamento parado para t0e ajuste o volume para 20 μL com ddH2O.</li>
			<li>Incubar a amostra t0 por 10 min a 70 °C. NOTA: Não ferva a amostra estendendo o tempo de incubação, pois os tioestres são labile a temperaturas mais altas.</li>
			<li>Calcule o volume de cada reagente necessário por reação de descarga. Utilize os 24 μL restantes do E2 carregado e adicione 10 mM L-lysine, 1 mg/ml BSA e 500 nM da liga ligase E3. Use o tampão de ubiquização em 1x e ajuste o volume para 80 μL com ddH2O.</li>
			<li>Prepare um esquema de pipetagem para todas as reações de descarga e use CHIP(H260Q) como controle, além de CHIP(WT).</li>
			<li>Configure as reações de descarga no gelo adicionando os componentes necessários na seguinte ordem: ddH2O, tampão de ubiquidade, BSA, lise, ligadura E3 e o E2 carregado para iniciar a reação.</li>
			<li>Incubar a reação de descarga na RT.</li>
			<li>Pegue amostras após 5, 30 e 60 min transferindo 20 μL da reação de descarga para os respectivos tubos de amostra. NOTA: Os pontos de tempo adequados que permitem o monitoramento adequado da descarga podem variar entre os pares E2-E3.</li>
			<li>Vórtice a amostra imediatamente, e incuba-la a 70 °C por 10 min.</li>
			<li>Prossiga diretamente com page. NOTA: Os tiostontes E2~Ub podem ser labile mesmo após a desnaturação no buffer de amostra. Assim, a eletroforese gel deve ser realizada diretamente após a execução do ensaio.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Eletroforese de gel e mancha ocidental<ol>
<li>Realize a eletroforese do gel e a mancha ocidental conforme descrito na seção 2.2. Use um anticorpo específico ub e, se disponível, também use um anticorpo específico do E3 que foi criado em uma espécie diferente, permitindo a detecção simultânea do sinal ligase Ub e E3.</li>
	</ol></li>
	<li>Análise de dados<ol>
<li>Realizar análise de dados conforme descrito na seção 2.3 (Figura 3).</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

Os autores não têm conflitos de interesse.

Este artigo descreve métodos básicos de ubiquização in vitro para a análise da função ligase E3. Ao realizar ensaios de onipresençação in vitro, deve-se considerar que algumas enzimas E2 podem realizar auto-ubiquidade devido ao ataque de sua cisteína ativa em seus próprios resíduos de lisesina que estão localizados nas proximidades do local ativo30. Para contornar esse problema, recomenda-se o uso de um mutante E2 no qual o respectivo resíduo de lise é trocado por arginina, o que...

A ubiquização é o processo pelo qual a Ub está covalentemente ligada a uma proteína substrato1. A modificação da Ub é catalisada por sucessivas reações enzimáticas envolvendo a ação de três classes enzimáticas diferentes, ou seja,e ., enzimas ativantes de Ub (E1s), enzimas ub-conjugadoras (E2s), ligaduras ub (E3s) e possivelmente fatores de alongamento da cadeia Ub (E4s)2,3,4,5. Após a adenosina triphosfato (ATP)- e a ativação dependente de magnésio (Mg2+)-dependent da Ub by E1, o local ativo cisteína do E1 ataca a glicecina terminal C da Ub, formando um complexo de tioéster (Ub~E1). A energia extraída da hidrólise ATP faz com que o Ub atinja um estado de transição de alta energia, que é mantido em toda a seguinte cascata enzimávia. Em seguida, a enzima E2 transfere a Ub ativada para sua cisteína catalítica interna, formando assim um vínculo de tiaester Ub~E2 transitório. Posteriormente, Ub é transferido para a proteína do substrato.
Isso pode ser feito de duas maneiras. Ou a ligadura E3 pode primeiro ligar-se ao E2, ou a liga ligase E3 pode ligar diretamente ub. Esta última forma resulta na formação de um intermediário E3~Ub. Em ambos os casos, a Ub está ligada à proteína do substrato por formação de vínculo isopeptida entre o grupo carboxíl terminal C da Ub e o grupo lysine Ɛ-amino do substrato6. O genoma humano codifica dois E1s, aproximadamente 40 E2s, e mais de 600 ligaduras putativas de ubiquitina7. Com base no mecanismo de transferência ub do E3, as ligases Ub são divididas em três categorias envolvendo ligaduras homologous para E6AP C-Terminus (HECT)-type, Really Interesting New Gene (RING)/U-box-type, e RING entre ligases tipo RING (RBR)8. Neste estudo, a caixa U contendo ligase, Carboxyl Terminus of HSC70-interacting Protein (CHIP), é usada como enzima E3 representativa. Em contraste com as enzimas E3 do tipo HECT que formam thioesters Ub~E3, o domínio da caixa U do CHIP liga E2~Ub e promove a transferência subsequente de Ub/substrato diretamente da enzima E28,9. Com base na importância da caixa U para a função enzimática, um mutante de caixa U inativo, CHIP(H260Q), é utilizado como um controle. CHIP(H260Q) não se liga aos seus E2s cognatos, perdendo assim sua atividade de ligadura E310.
A ubiquidade proteica desempenha um papel crucial na regulação de uma infinidade de eventos celulares em células eucarióticas. A diversidade de desfechos celulares que são promovidos pelo apego reversível das moléculas ub às proteínas substratos pode ser atribuída às características moleculares da Ub. Como a própria Ub contém sete resíduos de liseina (K) para posterior ubiquização, há uma rica variedade de tipos de cadeia Ub com diferentes tamanhos e/ou topologias11. Por exemplo, substratos podem ser modificados por uma única molécula Ub em uma (mono-ubiquização) ou lises múltiplas (multi-ubiquidade), e até mesmo por cadeias ub (poli-ubiquização)11. As cadeias ub são formadas homo ou heterotipicamente através dos mesmos ou diferentes resíduos de ub, o que poderia até resultar em cadeias ub ramificadas9. Assim, a ubiquização proteica leva a diversos arranjos de moléculas ub que fornecem informações específicas, por exemplo,para degradação, ativação ou localização de proteínas conjugadas12,13. Esses diferentes sinais ub permitem a reprogramação rápida de vias de sinalização celular, o que é um requisito importante para a capacidade da célula de responder às mudanças nas necessidades ambientais.
Um aspecto central da ubiquização está relacionado ao controle da qualidade da proteína. Proteínas mal dobradas ou irreversivelmente danificadas devem ser degradadas e substituídas por proteínas recém-sintetizadas para manter a homeostase proteica ou proteostase14. O controle de qualidade E3 ligase, CHIP, colabora com acompanhantes moleculares na degradação dependente de Ub de proteínas danificadas9,15,16,17. Além disso, o CHIP regula a estabilidade do acompanhante dirigido por miosina, UNC-45B (Unc-45 Homolog B), que é fortemente coordenado com função muscular e desvios dos níveis ideais levam à miopatia humana18,19,20,21. A degradação do UNC-45B pelo proteasome 26S é mediada pelo apego de uma cadeia de9poly-Ub ligada a K48 . Na ausência de proteínas de substrato, o CHIP realiza a auto-ubiquização10,22,23, que é característica das ligaduras de ubiquitina RING/U E324,25 e considerada para regular a atividade ligadura26. A aplicação dos métodos de ensaio de onipresença in vitro descritos neste artigo ajudou a identificar sistematicamente enzimas E2 que se unem ao CHIP para promover a formação de cadeias poli-ub gratuitas e/ou auto-ubiquização do CHIP (seção de protocolo 2). Além disso, observou-se a ubiquização dependente do CHIP da UNC-45B, que é um substrato conhecido da ligadura E318,19 (seção de protocolo 3). Em última análise, a transferência dependente de CHIP de Ub ativado do tioester Ub~E2 foi monitorada (seção de protocolo 4).

<table><tbody><tr><td>Amershan Protran 0.1 &micro; m NC</td><td>GE Healthcare</td><td>10600000</td><td>membrana de nitrocelulose</td></tr><tr><td>Anti-CHIP</td><td>Cell Signaling</td><td>2080</td><td>Anticorpo monoclonal anti-CHIP de coelho, clone C3B6</td></tr><tr><td>Anti-MYC</td><td>Roche</td><td>OP10</td><td>Anticorpo monoclonal anti-MYC de camundongo, clone 9E10</td></tr><tr><td>Anti-ubiquitina</td><td>Upstate</td><td>05-944</td><td>Anticorpo monoclonal anti-Ub de camundongo, clone P4D1-A11</td></tr><tr><td>Apirase</td><td>Sigma</td><td>A6535-100UN</td><td></td></tr><tr><td>ATP (10x)</td> <td>Enzo</td><td>12091903</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A6003-10G</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Roth</td><td>8043.2</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Roth</td><td>6781.1</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Roth</td><td>P749.2</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Roth</td><td>3904.1</td><td></td></tr><tr><td>LDS tampão de amostra (4x)</td> <td>novex</td><td>B0007</td><td></td></tr><tr><td>L-lisina</td><td>Sigma</td><td>L5501-5G</td><td></td></tr><tr><td>MES</td><td>Roth</td><td>4256.4</td><td></td></tr><tr><td>MeOH</td><td>VWR Chemicals</td><td>2,08,47,307</td><td>100%</td></tr> <tr><td>Milchpulver</td><td>Roth</td><td>T145.3</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Roth</td><td>P029.3</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE Antioxidante</td><td>invitrogen</td><td>NP0005</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE Transfer tampão (20x)</td><td>novex</td><td>NP0006-1</td><td></td></tr><tr><td>Régua de página mais</td><td>Thermo Fisher</td><td>26619</td><td>Escada de proteína</td></tr><tr><td>RotiBlock</td><td>Roth</td><td>A151.1</td><td>Reagente bloqueador</td></tr><tr><td>SDS (20%)</td><td>Roth</td><td>1057.1</td><td></td></tr><tr><td>S1000 Termociclador</td><td>Bio Rad</td><td>1852196</td><td></td></tr><tr><td>Trans-Blot Turbo</td><td>Bio Rad</td><td>1704150EDU</td><td>Sistema de transferência</td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Roth</td><td>4855.3</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Roth</td><td>9127.2</td><td></td></tr><tr><td>UbcH Conjunto de Enzimas</td><td>BostonBiochem</td><td>K-980B</td><td>E2</td></tr><tr><td>enzimas Ubiquitina</td><td>BostonBiochem</td><td>U-100H</td><td></td></tr><tr><td>Enzima ativadora de ubiquitina E1</td><td>Enzo</td><td>BML-UW941U-0050</td><td></td></tr><tr><td>Tampão de ubiquitilação (10x)</td><td>Enzo</td><td>BML-KW9885-001</td><td></td></tr><tr><td>Whatman papel mata-borrão</td><td>Bio Rad</td><td>1703969</td><td>Papel de filtro extra grosso</td></tr></tbody></table>

in vitro análise da função ligase e3 ubiquitin

In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function

A ligação covalente da ubiquitina (Ub) com resíduos de lisemina interna de uma proteína substrato, um processo denominado ubiquidade, representa uma das modificações pós-translacionais mais importantes em organismos eucarióticos. A ubiquização é mediada por uma cascata sequencial de três classes enzimes, incluindo enzimas ativadoras de ubiquitina (enzimas E1), enzimas conjugadoras de ubiquitina (enzimas E2) e ligaduras de ubiquitina (enzimas E3), e às vezes, fatores de alongamento da cadeia de ubiquitina (enzimas E4). Aqui, são fornecidos protocolos in vitro para ensaios de ubiquização, que permitem a avaliação da atividade ligase de ubiquitina E3, a cooperação entre pares E2-E3 e seleção de substratos. Os pares E2-E3 cooperantes podem ser rastreados monitorando a geração de cadeias gratuitas de poli-ubiquínea e/ou auto-ubiquização da ligase E3. A ubiquização do substrato é definida por ligação seletiva da liga ligase E3 e pode ser detectada por manchas ocidentais da reação in vitro. Além disso, é descrito um ensaio de descarga E2~Ub, que é uma ferramenta útil para a avaliação direta da cooperação funcional do E2-E3. Aqui, a transferência de ubiqutina dependente do E3 é seguida da enzima E2 correspondente para aminoácidos de lisina livre (imitando ubiquidades substratos) ou lisinas internas da própria Ligase E3 (auto-ubiquização). Em conclusão, são fornecidos três protocolos in vitro diferentes que são rápidos e fáceis de executar para abordar a funcionalidade catalítica do E3 ligase.

Para identificar enzimas E2 que cooperam com o CHIP ligase ubiquitin, um conjunto de candidatos E2 foi testado em reações individuais de ubiquização in vitro. Os pares E2-E3 cooperantes foram monitorados pela formação de produtos de ubiquização dependentes do E3, ou seja,auto-ubiquidade da ligadura E3 e formação de polímeros Ub livres. Os produtos de ubiquização foram analisados por manchas ocidentais. A interpretação dos dados baseia-se na comparação de tamanho das faixas proteicas resultantes com marc...

O presente estudo fornece protocolos de ensaio de on-lona in vitro detalhados para a análise da atividade catalítica da ubiquitina E3. Proteínas recombinantes foram expressas usando sistemas procarióticos como a cultura Escherichia coli.

In vitro Análise da Função Ligase E3 Ubiquitin

The covalent attachment of ubiquitin (Ub) to internal lysine residue(s) of a substrate protein, a process termed ubiquitylation, represents one of the ...

O objetivo geral deste protocolo é analisar aspectos-chave importantes da função ligase E3, incluindo especificidade da enzima E2, seleção de substratos e transferência de ubiquitina. A principal vantagem desta técnica é sua ampla aplicabilidade, uma vez que proteínas de todas as fontes eucarióticas podem ser recombinantemente expressas e estudadas in vitro sem a necessidade de equipamentos especiais. Ao utilizar pela primeira vez a técnica de descarga de liseina, é importante otimizar parâmetros de ensaio, como concentrações de enzimas, para identificar as condições ideais de descarga para a ligadura E3 de escolha.Para realizar um ensaio de auto-ubinciabilidade in vitro, configure um esquema de pipetação para testar a capacidade funcional de diferentes enzimas E2 e preparar uma mistura mestre no gelo para todas as reações de ubiquização mais uma reação adicional. Em seguida, adicione um micromolar de enzimas E2 aos tubos apropriados e incuba as amostras em um ciclo térmico PCR por duas horas sob as condições indicadas. Após a incubação, adicione o tampão de amostra SDS a cada reação e misture por pipetação várias vezes.Em seguida, ferva imediatamente as amostras a 95 graus Celsius por cinco minutos e armazene as proteínas desnaturadas a 20 graus Celsius. Para realizar um ensaio de ubiquização substrato in vitro, prepare o esquema de pipetação para todas as reações. Depois de calcular a quantidade de mistura mestre necessária para uma reação, prepare a mistura mestre para todas as reações no gelo e adicione a mistura mestre a cada tubo.Adicione as respectivas ligaduras E3 individualmente. Em seguida, incubar as amostras no ciclo térmico PCR por duas horas, como demonstrado. No final da incubação, adicione duas vezes o tampão de amostra SDS a cada reação, misture várias vezes por pipetação e ferva as amostras por cinco minutos a 95 graus Celsius.Para realizar um ensaio de descarga de lise, configure o esquema de pipetação para a reação de carregamento e incubar as reações de carregamento por 15 minutos a 37 graus Celsius. Para parar a reação de carregamento, adicione apirase a uma concentração final de 1,8 unidades por mililitro e incubar a reação por cinco minutos à temperatura ambiente. No final da incubação, adicione EDTA a uma concentração final de 30 mililitros e use água duplamente destilada para ajustar o volume da reação a 30 microliters.Para descarregar a ubiquização E2 por E3, configure cinco tubos correspondentes aos pontos de tempo para o experimento, adicione 6,7 microliters de tampão amostral não redutor a cada tubo, remova seis microlitradores da reação de carregamento parado do tubo ponto de tempo zero e ajuste o volume total para 26,7 microliters. Para configurar as reações de descarga, adicione água duplamente destilada, tampão de ubiquização, BSA, lise, ligadura E3 e o E2 carregado a cada reação. Após os períodos de tempo selecionados, transfira amostras de 20 microliter de cada reação de descarga para o tubo amostral correspondente.Em seguida, imediatamente vórtice as amostras, e colocá-las a 70 graus Celsius por 10 minutos. Nesta análise representativa da mancha ocidental, o CHIP inativo não foi auto-ubiquílado. No entanto, os produtos de ubiquitina independentes da E3 foram formados na presença de CHIP inativos e na ausência de CHIP.O CHIP do tipo selvagem foi auto-ubiquídeo quando combinado com as proteínas do UBE2D e das famílias UBE2E, enquanto as cadeias gratuitas de poliuubiquitina foram produzidas em cooperação com as proteínas da família UBE2D, mas não com as proteínas da família UBE2E. A vinculação da ubiquitina pela UBE2N/V1 direcionou a formação de cadeias de ubiquitina livre. A auto-ubiquidade e a ubiquização do UNC-45B foram observadas com CHIP tipo selvagem, mas não com o mutante inativos do CHIP, indicando que o UNC-45B atua como um substrato conservado para CHIP.Quando a atividade catalítica do CHIP foi analisada utilizando um ensaio de descarga de liseina, a enzima UBE2D2 não carregada tinha um peso molecular de 17 kilodaltons e o UBE2D2 carregado com uma única molécula de ubiquitina tinha um peso molecular de aproximadamente 26 kilodaltons. Na hora 0, foi observado todo o rendimento do E2 carregado. Na presença de CHIP inativo, foi detectada uma descarga fraca e3 ligase independente do UBE2D2, mas não a auto-ubiquidade do CHIP.Na presença de CHIP tipo selvagem, a descarga de UBE2D2 foi rápida e concluída em 60 minutos, e a auto-ubiquidade do CHIP indicou uma transferência de ubiquitina em seus próprios resíduos de lisesina. Devido à capacidade limitada do E2, trabalhe o mais rápido possível e prossiga imediatamente com a reação de descarga seguida por SDS-PAGE e mancha ocidental. Seguindo esses protocolos de onipresença in vitro, os tipos específicos de ligação de ubiquização podem ser identificados sondando as manchas ocidentais com anticorpos específicos de ligação.

in-vitro-analysis-of-e3-ubiquitin-ligase-function

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Ao contrário da ubiquitina ligases, foram identificados alguns ligases E3 sumô. Este modificado em vitro protocolo SUMOylation é capaz de identificar o romance sumô E3 ligases por um ensaio de reconstituição em vitro .

In Vitro Ensaio de SUMOylation para estudar a atividade de Ligase E3 sumô

A ubiquitinação é uma modificação pós-translacional que desempenha papéis importantes em processos celulares e é fortemente coordenada pela deubiquitinação. Os defeitos em ambas as reações fundamentam patologias humanas. Nós fornecemos protocolos para a realização de ubiquitinação e reação de deubiquitinação in vitro usando componentes purificados.

Ensaios de Ubiquitinação e Deubiquitinação in vitro de histonas Nucleossomal

Este protocolo visa estabelecer proteomas específicos de ubiquitina (Ub) e ubiquitina (Ubls), a fim de identificar alterações desse tipo de modificações pós-translacional (PTMs), associadas a uma condição específica, como tratamento ou fenótipo.

Perfil de Ubiquitin e Ubiquitin-like Modificações pós-translacionais dependentes e identificação de alterações significativas

O objetivo deste manuscrito é apresentar um esboço para os estudos bioquímicos e funcionais abrangentes das ligaduras de ubiquitina ring-tipo E3. Este pipeline multipasso, com protocolos detalhados, valida uma atividade enzimática da proteína testada e demonstra como vincular a atividade à função.

Caracterização funcional do RING-Tipo E3 Ubiquitin Ligases In Vitro e In Planta

Este método descreve a avaliação das mudanças globais na topologia da cadeia de ubiquitina. A avaliação é realizada pela aplicação de uma abordagem de proteômica direcionada baseada em espectrometria de massa.

Análise da cadeia de Ubiquitin por monitoramento de reação paralela

A ubiquização é uma modificação pós-translacional de proteínas críticas, que tem sido implicada em inúmeras doenças humanas. Este protocolo detalha como o display phage pode ser utilizado para isolar novas variantes de ubiquitina que podem ligar e modular a atividade de ligaduras E3 que controlam a especificidade, eficiência e padrões de ubiquização.

Usando o Phage Display para desenvolver moduladores variantes de Ubiquitin para Ligases E3

Fornecemos um protocolo detalhado para um ensaio de ubiquização de um substrato específico e uma ubiquitina-ligase E3 em células mamíferas. As linhas celulares HEK293T foram utilizadas para superexpressão de proteínas, o substrato poliubiquizado foi purificado a partir de lisestês celulares por imunoprecipitação, e resolvido em SDS-PAGE. A imunoblotação foi usada para visualizar esta modificação pós-translacional.

Avaliação da Ubiquização substrato por E3 Ubiquitin-ligase em Lysates de Células Mamárias

Um método simples e escalável foi desenvolvido para avaliar o significado funcional de variantes missense em Ube3a, um gene cuja perda e ganho de função estão ligados à síndrome de Angelman e ao transtorno do espectro do autismo.

Um método escalável baseado em células para a avaliação funcional de variantes do Ube3a

Este protocolo explica como medir o efeito da variação genética associada a distúrbios do neurodesenvolvimento na atividade da enzima desubiquitilante, combinando a purificação de proteínas recombinantes com ensaios de clivagem da cadeia de ubiquitina.

Medindo a atividade enzimática de enzimas desubiquitilantes associadas a distúrbios do neurodesenvolvimento por meio de um ensaio de clivagem da cadeia de ubiquitina in vitro

A ubiquitinação é um regulador crítico das funções intracelulares das proteínas. Aqui, descrevemos dois métodos de lise celular para detectar os níveis de ubiquitinação de proteínas do substrato em células de mamíferos e comparamos sua eficácia na análise dos níveis de ubiquitinação. A superexpressão proteica em células HEK293T foi induzida por transfecção transitória, e proteínas ubiquitinadas foram detectadas por análise western blot.

Estratégias comparativas para detecção de ubiquitinação em lisados celulares de mamíferos usando SMAD2/SMURF2 como modelo

Este protocolo descreve um método para ubiquitinar Streptococcus pneumoniae usando lisado celular de mamífero ou complexo enzimático puro de ubiquitina, seguido de tratamento com complexo proteico purificado VCP/p97-UFD1-NPLOC4 para avaliar sua atividade bacteriolítica, possibilitando o estudo de efetores imunes dependentes de ubiquitina.

In vitro Reconstituição da Ubiquitinação Bacteriana e Eliminação Mediada por VCP/p97

Aprenda a analisar a função da ligase E3 ubiquitina in vitro, incluindo especificidade de E2, seleção de substratos e transferência de ubiquitina. Este método permite avaliar a atividade catalítica de ligases E3 usando proteínas recombinantes.

In vitro Análise da Função Ligase E3 Ubiquitin

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