Name: Detecção e Análise Automatizada de Exocistose (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-11T14:30:00.000+00:00
Duration: 13 min 28 s
Description: Aprenda a detectar e analisar eventos de exocitose em células cultivadas usando microscopia TIRF e algoritmos de visão computacional em MATLAB. Este pipeline automatizado classifica fusões vesiculares e avalia padrões espaciais com a função K de Ripley.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Agradecemos a Dustin Revell e Reginald Edwards por testarem o código e a GUI. O financiamento foi fornecido pelos Institutos Nacionais de Saúde apoiados nesta pesquisa: incluindo R01NS112326 (SLG), R35GM135160 (SLG) e F31NS103586 (FLU).

1. Escolha conjuntos de dados e diretórios
<ol><li>Para selecionar conjuntos de dados para análise, clique no botão Encontrar Conjuntos de dados (Figura 2A, caixa vermelha 1) para navegar até a pasta onde os dados são depositados (por exemplo, pasta RawData). Os datafiles preencherão automaticamente os Arquivos de Dados como uma lista. Pode haver mais de um conjunto de dados na pasta.</li>
	<li>Clique no botão Escolher Diretório e selecione o diretório (por exemplo, Teste) onde os arquivos analisados serão depositados(Figura 2A, caixa vermelha 2) . Um conjunto de pastas e arquivos de análise acabados, bem como imagens temporárias intermediárias serão criados neste diretório quando o botão Análise for pressionado. Erros serão produzidos se um diretório não for escolhido.</li>
</ol>2. Defina o tamanho do pixel e a taxa de quadro
<ol><li>Preencha a taxa de quadros e o tamanho dos pixels apropriados na caixa apropriada "Framerate" ou "pixel size"(Figura 2A,caixa verde). Se não forem fornecidos valores (eles estão definidos como "0" padrão), o programa procurará os metadados associados ao arquivo para o framerate e o tamanho do pixel. Se esses valores não puderem ser encontrados, o programa será padrão para por pixel para medição e por período para pontos de tempo. NOTA: No exemplo fornecido, o framerate é de 100, e o tamanho do pixel é de 0,08.</li>
</ol>3. Escolha ou faça máscaras
<ol><li>Use o botão Fabricante de máscaras para criar automaticamente máscaras celulares para os dados na lista de dataset do arquivo(Figura 2A, caixa azul). Ao usar o botão Mask Maker, uma nova pasta no diretório escolhido será criada chamada MaskFiles. O "indicador executar" ficará amarelo durante a corrida e voltará ao verde quando concluído. NOTA: Uma máscara para cada arquivo na lista arquivos de dados será criada a partir dos primeiros 10 quadros do arquivo de imagem (ou de todos os quadros se menos de 10 estiverem no arquivo de imagem) e depositada na pasta MaskFiles usando o esquema de nomeação adequado (descrito abaixo).</li>
	<li>Certifique-se de que os arquivos da máscara presiram automaticamente a lista Arquivos de máscara. O usuário pode proceder diretamente à análise. NOTA: Verifique sempre os arquivos da máscara e confirme que eles capturam toda a região de interesse. O primeiro quadro do arquivo de dados e o arquivo da máscara são exibidos na interface do usuário quando selecionados. (Figura 2B). O Fabricante de Máscaras pode produzir erros no caso de baixo sinal para ruído, por isso a validação de que os arquivos de máscara são apropriados é fundamental para o controle de qualidade.</li>
	<li>Como alternativa ao uso do Mask Maker, se o sinal de ruído de imagens for insuficiente, crie máscaras manualmente no ImageJ.<ol>
<li>Primeiro, abra o arquivo de imagem bruta em ImageJ (Figura 3A).</li>
		<li>Clique no botão Seleção de Polígono e clique para desenhar uma máscara ao redor da célula. Uma vez terminado, clique duas vezes no último ponto para completar o polígono.</li>
		<li>Uma vez terminado, navegue até Editar | | de seleção Criar máscara (Figura 3B). Uma nova máscara invertida será criada com base no desenho do polígono. Salve máscaras em uma pasta designada MaskFiles no diretório escolhido. O esquema de nomeação de arquivos de máscara deve corresponder aos arquivos de dados individuais correspondentes seguidos de "_mask_file". Por exemplo, se um arquivo de dados for chamado de "VAMP2_488_WT_1.tif", o arquivo de máscara correspondente deve ser chamado de "VAMP2_488_WT_1_mask_file.tif".</li>
		<li>Use o botão Find Maskfiles para navegar até a pasta escolhida de arquivos de máscara personalizados depositados. As máscaras preencherão os Arquivos de Máscaras como uma lista. NOTA: É importante ter uma máscara para cada arquivo de dados antes de executar a análise.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Análise e extração de recursos
<ol><li>Depois que o diretório for escolhido e a lista de arquivos de dados e a lista de arquivos máscaras forem preenchidas, clique no botão Análise (Figura 4A). Se for necessária a classificação dos eventos exocióticos, passe para a etapa 5. NOTA: O clique no botão Análise executará uma série de tarefas automatizadas para analisar os dados. Ele criará pastas individuais no diretório escolhido para depositar dados analisados. Durante a execução, o "indicador de execução" mudará de verde para amarelo(Figura 4A, caixa vermelha). Depois que a análise estiver concluída, isso mudará de volta para verde.</li>
	<li>Encontre uma pasta DataFiles (Figura 4B) com o conjunto completo de arquivos de análise (bem como arquivos de extração de recursos, a serem usados posteriormente) nomeados de acordo com cada arquivo de dados(Figura 4C). NOTA: A descrição desses arquivos de análise está incluída abaixo na seção Resultados Representativos.</li>
</ol>5. Classificação de eventos exocióticos
<ol><li>Para realizar a classificação simultânea de eventos exocióticos com detecção automatizada, verifique a caixa de seleção classificação antes de clicar no botão Análise. Para cada evento exociótico, atribua uma pontuação de probabilidade entre 0-1 para cada classe. Um evento exociótico é considerado classificado como uma das quatro classes se a pontuação de probabilidade para essa classe for > 0,5. NOTA: Uma vez concluída a análise, uma nova pasta de arquivo de dados aparecerá dentro do diretório escolhido. A pasta conterá arquivos de análise correspondentes a cada arquivo de imagem.</li>
</ol>6. Análise espococrânica da exocistose utilizando os valores K de Ripley
<ol><li>Crie um arquivo de máscara "neurite" e "soma" separados. Primeiro, segmentar a soma do neurite. Não há um método imparcial para segmentar a soma dos neurites, de modo que o usuário deve ficar cego ao experimento de condicionamento e usar o melhor julgamento; sugere-se um elipsoide sem extensões neuritas óbvias.</li>
	<li>Imagem AbertaJ/Fiji.</li>
	<li>Arraste e solte o arquivo da máscara ou use o Arquivo | Abra e selecione o arquivo da máscara.</li>
	<li>Use a ferramenta de coleta de cores e clique em qualquer um dos pixels pretos no fundo da máscara para definir a cor para preto.</li>
	<li>Use a ferramenta de seleção de polígonos ou à mão livre para desenhar um contorno em torno da soma, separando-a dos neurites. Isso requer tomadas de decisão manuais.</li>
	<li>Clique em Editar | | de seleção Faça máscara. Uma nova imagem será aberta com a soma circulada segmentada do resto da imagem. Isso criará um arquivo de máscara soma.</li>
	<li>Sem mover a região desenhada, clique no cabeçalho do arquivo de máscara original.</li>
	<li>Clique em Editar | Preencha para preencher a soma circulada para que apenas os neurites permaneçam a máscara.</li>
	<li>Uma vez obtidos arquivos de neurite e máscara separados, salve ambos os arquivos da máscara.</li>
	<li>Abra "neurite_2D_network" em Matlab.</li>
	<li>No MATLAB, navegue até o diretório com todos os dados de análise.</li>
	<li>Altere o caminho "nome da máscara" para o nome da máscara de neurite, ou seja, "MaskFiles/VAMP2pHluorin_488_wt_4_mask_file_neurite.tif"</li>
	<li>Altere o "csv_file_name" para onde está localizado fluorescent_traces.csv arquivo, ou seja, "MaskFiles/VAMP2pHluorin_488_wt_4_mask_file_neurite.csv".</li>
	<li>Clique em Executar para esqueletoizar o arquivo da máscara de neurite. Isso cria uma versão esqueletoizada do arquivo da máscara de neurite e deposita-o como um arquivo CSV sob a pasta maskfiles.</li>
	<li>Em seguida, gere um arquivo CSV para a soma. Abra "CSV_mask_creator.m" em Matlab.</li>
	<li>Coloque no caminho para o "nome da máscara" para o nome da máscara soma, ou seja, "MaskFiles/VAMP2phLuorin_488_wt_4_mask_file_soma.tif</li>
	<li>Altere o "writematrix" para csv filename a ser criado, ou seja, "MaskFiles/VAMP2pHluorin_488_wt_4_mask_file_soma.csv"</li>
	<li>Clique em Executar. Isso cria o novo arquivo VAMP2pHluorin_488_wt_4_mask_file_soma.csv.</li>
	<li>Repita 6.14 para cada arquivo de máscara.</li>
</ol>7. Configuração rstudio
<ol><li>Abra rstudio e abra ripleys_k_analysis. Arquivo R.</li>
	<li>Instale o pacote "spatstat" no RStudio indo para Ferramentas | Instalar pacotes e digitar em "spatstat" seguido de clique em Instalar. NOTA: Isso só precisa ser realizado uma vez por instalação de Rstudio.</li>
	<li>Execute a biblioteca no início de cada sessão.</li>
	<li>Preste atenção a duas variáveis principais neste caso: "neuron_mask" e "neuron_datapoints". A Máscara de Neurônio aponta para o conjunto de arquivos de máscara para executar, ou seja, arquivos de máscara soma." NOTA: Execute todos os arquivos de máscara soma juntos, separadamente dos arquivos da máscara de Neurite, e vice-versa.</li>
	<li>Leia na .csv dos arquivos da máscara para que cada um dos neurônios seja analisado.</li>
	<li>Execute vários arquivos ao mesmo tempo copiando neuron_mask_n+1 adicionais. Isso permitirá agregar a análise de Ripley, usando o script descrito na seção 8.</li>
	<li>Agora verifique a segunda variável, "neuron_datapoints".</li>
	<li>Leia no." X_fluorescent_traces.csv" arquivo gerado pelo programa de análise (por recursos todos os extracted_R arquivo) com as posições x,y,t dos eventos exocióticos, bem como o arquivo específico de neurite das posições x,y para a rede 2D. Isso vai na posição "neuron_datapoints".</li>
	<li>Em RStudio Select Code | | da Região Run Corra tudo. Isso gera várias tramas, incluindo os valores K agrupados de Ripley, bem como parcelas de densidade.</li>
	<li>Salve parcelas indo para exportar | Salvar imagem como | Selecione o formato e o diretório de imagem apropriados e insira o nome do arquivo apropriado e clique em Salvar. NOTA: A função de plotagem para os heatmaps é chamada no script usando "plot (densidade (soma_data,0,4)". O número "0.4" aqui representa o quão suavizada deve ser a função de densidade. Ele pode ser alterado para se adequar aos dados do usuário de forma significativa, mas se as comparações forem realizadas entre diferentes mapas de calor, o número deve ser o mesmo entre eles.</li>
	<li>
Exportar ou Salvar imagem do Rstudio. Se um mapa de calor exigir uma edição mais aprofundada, escolha um tipo de arquivo apropriado (SVG ou EPS).</li>
</ol>8. Análise de Ripley
NOTA: O Ripleys_k_analysis. O arquivo R também gerou automaticamente as parcelas de valor k da Ripley. A execução de todo o script executará automaticamente as funções mencionadas abaixo, mas está incluída em detalhes se desejar executar cada parte do script individualmente ou fazer alterações na análise.
<ol><li>Primeiro, execute a função envelope para cada célula. Esta função simulou aleatoriedade espacial completa (RSE) para testar o valor K do Ripley do padrão de ponto de evento exociótico contra. Data_envelope_1 = envelope (soma_data_1, Kest, nsim = 19, savefuns = TRUE) Data_envelope_2 = envelope (soma_data_2, Kest, nsim = 19, savefuns = TRUE)</li>
	<li>Em seguida, unindo esses envelopes e criar uma estimativa de RSE para o grupo: Pool_csr = piscina (Data_envelope_1, Data_envelop_2,...) Em seguida, execute a função K do Ripley para todos os pontos de dados. Data_ripleys_k_1 = Kest(soma_data_1, razão = TRUE) Data_ripleys_k_2 = Kest(soma_data_2, razão = TRUE)</li>
	<li>Uma vez concluído, misture os valores K do Ripley e bootstrap seus intervalos de confiança com o seguinte comando: Pool de dados = pool (Data_ripleys_k_1, Data_ripleys_k_2,...)</li>
	<li>Bootstrap com o seguinte comando: Final_Ripleys_K = varblock (fun = Kest, Data_pool)</li>
	<li>Trace os dados.</li>
	<li>Se for necessária uma diferença estatística, o Teste de Permutação Studentizada é incluído no pacote spatstat para testar uma diferença entre grupos de padrões de ponto: Test_difference = studpermu.test(all_points_to_test, exocytic_events ~ grupo, nperm = np).</li>
</ol>

<ol><li>Miesenböck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+secretion+and+synaptic+transmission+with+pH-sensitive+green+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins.</a> Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).</li>
<li>Urbina, F. L., Gomez, S. M., Gupton, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+organization+of+exocytosis+emerges+during+neuronal+shape+change%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal organization of exocytosis emerges during neuronal shape change.</a> Journal of Cell Biology. 217 (3), 1113-1128 (2018).</li>
<li>Urbina, F. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRIM67+regulates+exocytic+mode+and+neuronal+morphogenesis+via+SNAP47%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">TRIM67 regulates exocytic mode and neuronal morphogenesis via SNAP47.</a> Cell Reports. 34 (6), 108743(2021).</li>
<li>Alabi, A. A., Tsien, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perspectives+on+kiss-and-run%3A+Role+in+exocytosis%2C+endocytosis%2C+and+neurotransmission%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Perspectives on kiss-and-run: Role in exocytosis, endocytosis, and neurotransmission.</a> Annual Review of Physiology. 75, 393-422 (2013).</li>
<li>Albillos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+exocytotic+event+in+chromaffin+cells+revealed+by+patch+amperometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The exocytotic event in chromaffin cells revealed by patch amperometry.</a> Nature. 389 (6650), 509-512 (1997).</li>
<li>He, L., Wu, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+debate+on+the+kiss-and-run+fusion+at+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The debate on the kiss-and-run fusion at synapses.</a> Trends in Neuroscience. 30 (9), 447-455 (2007).</li>
<li>Elhamdani, A., Azizi, F., Artalejo, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double+patch+clamp+reveals+that+transient+fusion+%28kiss-and-run%29+is+a+major+mechanism+of+secretion+in+calf+adrenal+chromaffin+cells%3A+high+calcium+shifts+the+mechanism+from+kiss-and-run+to+complete+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Double patch clamp reveals that transient fusion (kiss-and-run) is a major mechanism of secretion in calf adrenal chromaffin cells: high calcium shifts the mechanism from kiss-and-run to complete fusion.</a> Journal of Neuroscience. 26 (11), 3030(2006).</li>
<li>Bowser, D. N., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+forms+of+single-vesicle+astrocyte+exocytosis+imaged+with+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Two forms of single-vesicle astrocyte exocytosis imaged with total internal reflection fluorescence microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (10), 4212-4217 (2007).</li>
<li>Holroyd, P., Lang, T., Wenzel, D., De Camilli, P., Jahn, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+direct%2C+dynamin-dependent+recapture+of+fusing+secretory+granules+on+plasma+membrane+lawns+from+PC12+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Imaging direct, dynamin-dependent recapture of fusing secretory granules on plasma membrane lawns from PC12 cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (26), 16806-16811 (2002).</li>
<li>Wang, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+domains+of+synaptotagmin+control+the+choice+between+kiss-and-run+and+full+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Different domains of synaptotagmin control the choice between kiss-and-run and full fusion.</a> Nature. 424 (6951), 943-947 (2003).</li>
<li>Winkle, C. C., Hanlin, C. C., Gupton, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utilizing+combined+methodologies+to+define+the+role+of+plasma+membrane+delivery+during+axon+branching+and+neuronal+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Utilizing combined methodologies to define the role of plasma membrane delivery during axon branching and neuronal morphogenesis.</a> Journal of Visualized Experiments. (109), e53743(2016).</li>
<li>Viesselmann, C., Ballweg, J., Lumbard, D., Dent, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleofection+and+primary+culture+of+embryonic+mouse+hippocampal+and+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Nucleofection and primary culture of embryonic mouse hippocampal and cortical neurons.</a> Journal of Visualized Experiments. (47), e2373(2011).</li>
<li>Plooster, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRIM9-dependent+ubiquitination+of+DCC+constrains+kinase+signaling%2C+exocytosis%2C+and+axon+branching%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">TRIM9-dependent ubiquitination of DCC constrains kinase signaling, exocytosis, and axon branching.</a> Molecular Biology of the Cell. 28 (18), 2374-2385 (2017).</li>
<li>Urbina, F. L., Gupton, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SNARE-mediated+exocytosis+in+neuronal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">SNARE-mediated exocytosis in neuronal development.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 13, 133(2020).</li>
<li>Ripley, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+second-order+analysis+of+stationary+point+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Probability%22%5BJournal%5D)">The second-order analysis of stationary point processes.</a> Journal of Applied Probability. 13 (2), 255-266 (1976).</li>
<li>Liu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pHmScarlet+is+a+pH-sensitive+red+fluorescent+protein+to+monitor+exocytosis+docking+and+fusion+steps%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">pHmScarlet is a pH-sensitive red fluorescent protein to monitor exocytosis docking and fusion steps.</a> Nature Communication. 12 (1), 1413(2021).</li>
</ol>

Os autores não declaram nada para revelar.

Ao usar o software de detecção e análise exocítico, considere que o programa só aceita compactação sem perdas .tif arquivos como entrada. Os arquivos de imagem .tif podem ser imagens de 8 bits, 16 bits ou 32 bits em escala de cinza (canal único). Outros formatos de imagem devem ser convertidos em um desses tipos antes da entrada. Para referência, exemplos usados aqui são imagens em escala de cinza de 16 bits.
Inerentes ao processo de detecção automatizada, os conjuntos de imagens timelapse são...

Construções VAMP-pHluorin ou receptor de transferrina (TfR)-pHuji construções são excelentes marcadores de eventos exocióticos, pois estes fluoroforos sensíveis ao pH são extintos dentro do lúmen vesícula ácido e fluoresce imediatamente após a abertura do poro de fusão entre a vesícula e a membrana plasmática1. Após a abertura dos poros de fusão, a fluorescência decai exponencialmente, com alguma heterogeneidade que revela informações sobre o evento de fusão. Aqui, um aplicativo de interface de usuário gráfico (GUI) é descrito que detecta e analisa automaticamente eventos exocióticos. Este aplicativo permite que o usuário detecte automaticamente eventos exocióticos revelados pelos marcadores sensíveis ao pH2 e gere recursos de cada evento que podem ser usados para fins de classificação3 (Figura 1A). Além disso, a análise do agrupamento de eventos exocióticos usando a função K de Ripley é descrita.
A classificação automatizada de eventos exocióticos em diferentes modos exocióticos foi relatada recentemente3. Dois modos de exocistose, fusão de vesícula completa (FVF) e excitose de fusão de beijo e fuga (KNR) foram descritos anteriormente4,5,6,7. Durante a FVF, o poro de fusão dilata, e a vesícula é incorporada na membrana plasmática. Durante o KNR, o poro de fusão abre transitoriamente e depois seeals4,5,8,9,10. Foram identificados quatro modos de exocitose no desenvolvimento de neurônios, dois relacionados à FVF e dois relacionados à KNR. Este trabalho demonstra que tanto fvf quanto KNR podem ser subdivididos em eventos de fusão que procedem imediatamente à decadência de fluorescência (FVFi e KNRi) após abertura de poros de fusão ou eventos exocióticos que exibem um atraso após a abertura do poros de fusão antes da decadência da fluorescência (FVFd e KNRd)(Figura 1B). O classificador identifica o modo de exocitose para cada evento de fusão. Aqui esta análise foi incorporada em uma GUI que pode ser instalada em sistemas operacionais baseados em MATLAB em Windows e Mac. Todos os arquivos de análise podem ser encontrados em https://drive.google.com/drive/folders/1VCiO-thMEd4jz-tYEL8I4N1Rf_zjnOgB?usp=sharing ou https://github.com/GuptonLab.

<table><tbody><tr><td></td><td>Equipe</td><td></td> principal <td></td></tr><tr><td>do MATLAB</td><td>MathWorks</td><td></td><td>https://www.mathworks.com/products/matlab.html</td></tr> RR https://www.r-project.org/ <tr><td>Rstudio</td><td>Rstudio, PBC</td><td></td><td>https://rstudio.com/</td></tr></tbody></table>

detecção e análise automatizada de exocistose

Automated Detection and Analysis of Exocytosis

A microscopia timelapse TIRF de GFP sensível ao pH (pHluorin) anexada às proteínas SNARE vesículas é um método eficaz para visualizar eventos exocióticos vesículas únicos na cultura celular. Para realizar uma identificação e análise imparcial e eficiente de tais eventos, uma abordagem baseada em visão computacional foi desenvolvida e implementada no MATLAB. O pipeline de análise consiste em um algoritmo de segmentação celular e identificação de eventos exocióticos. A abordagem da visão computacional inclui ferramentas para investigar múltiplos parâmetros de eventos únicos, incluindo a meia-vida da decadência da fluorescência e do pico ΔF/F, bem como a análise de células inteiras da frequência da exocitese. Estes e outros parâmetros de fusão são usados em uma abordagem de classificação para distinguir modos de fusão distintos. Aqui uma GUI recém-construída realiza o pipeline de análise do início ao fim. Uma adaptação adicional da função K de Ripley no R Studio é usada para distinguir entre eventos de fusão agrupados, dispersos ou aleatórios no espaço e no tempo.

Aqui a GUI (Figura 2A) foi utilizada para analisar eventos exocióticos de três neurônios vamp2-pHluorin expressando neurônios a 3 DIV utilizando microscopia DE TIRF (fluorescência de reflexão interna total). Os neurônios corticais E15,5 foram isolados, seguidos de transfecção com VAMP2-pHluorin e chapeamento utilizando os protocolos descritos em Winkle et al., 2016 e Viesselmann et al., 201111,12. A metodologia dos parâmetros de imag...

Desenvolvemos um software automatizado de visão computacional para detectar eventos exocióticos marcados por sondas fluorescentes sensíveis ao pH. Aqui, demonstramos o uso de uma interface gráfica de usuário e RStudio para detectar eventos de fusão, analisar e exibir parâmetros espátulais de fusão e classificar eventos em modos de fusão distintos.

Detecção e Análise Automatizada de Exocistose

Timelapse TIRF microscopy of pH-sensitive GFP (pHluorin) attached to vesicle SNARE proteins is an effective method to visualize single vesicle exocytic ...

O software automatizado de detecção e análise da Exocitosis permitirá que o usuário detecte automaticamente eventos exocíticos e sequências de imagem TIRF de fluoroforos sensíveis ao pH. Também irá produzir automaticamente características de exocitose, como a distribuição espacial ou a frequência, bem como propriedades individuais de eventos exocióticos, como a meia-vida ou a mudança na fluorescência sobre o fundo. Além disso, uma opção está incluída para classificar eventos exocióticos em quatro modos de exocitose, descritos anteriormente na literatura.Para usar o software de detecção e análise automatizada do software Exocytosis, primeiro você clicará no botão encontrar conjunto de dados e navegará até onde seus dados são depositados e você vai querer colocar em uma pasta chamada dados brutos. Seus arquivos de dados preencherão automaticamente a lista aqui, e você pode ter qualquer número de arquivos de dados nesta pasta. Em seguida, você vai querer escolher um diretório para o qual seus arquivos de análise serão depositados.Aqui, eu escolhi um diretório chamado teste. Você também vai querer preencher a taxa de quadros de suas imagens, bem como o tamanho do pixel. Aqui minhas taxas de quadro são de cem milissegundos por quadro, meu tamanho de pixel é de oito nanômetros.Finalmente, você precisará de arquivos de máscara para executar o software de Detecção e Análise Automatizada de Exocistosis. Você pode usar o botão de fabricante de máscaras incluído para gerar automaticamente arquivos de máscara a partir de seus arquivos de dados. O indicador de execução ficará amarelo e depois voltará para o verde quando o fabricante da máscara terminar de funcionar.Sua máscara será depositada em uma nova pasta chamada arquivos de máscara em seu diretório escolhido. E note, arquivos de máscara preencherão automaticamente a lista aqui. Você vai querer verificar se seus arquivos de máscara são feitos apropriadamente para seus arquivos de dados, e você pode fazer isso destacando qualquer um dos arquivos de dados da lista, bem como o arquivo de máscara correspondente.O primeiro quadro do seu arquivo de dados aparecerá e o arquivo da máscara selecionado também aparecerá. Aqui. Podemos ver que nossos arquivos de máscara são apropriados para a análise em mãos. Os arquivos da máscara também podem ser fornecidos pelo usuário separadamente.Quando se deseja fazer um arquivo de máscara a partir de um arquivo de dados atual, recomendamos usar a Imagem J.In ordem para fazê-lo, primeiro abra a imagem na Imagem J da qual você deseja fazer um arquivo de máscara. Em seguida, você pode usar a ferramenta de seleção de polígonos para começar a criar um arquivo de máscara ao redor clicando ao redor da borda da célula. Quando você tiver completado a máscara, clique duas vezes para se conectar a todo o polígono.Uma vez que isso esteja concluído, você irá editar, seleção e criar máscara. Uma máscara invertida será criada. Você vai querer salvar este arquivo de máscara usando o mesmo nome do arquivo de dados seguido por _mask_file.Agora, se você fornecer seus próprios arquivos de máscara personalizados, é importante deixar o software de detecção automatizado saber onde esses arquivos de máscara estão localizados. Para isso, você clicará no botão encontrar arquivos de máscara e navegará até o diretório com seus arquivos de máscara. Os novos arquivos de máscaras preencherão a lista aqui.É importante que você tenha uma máscara para cada arquivo de dados antes que a análise possa ser executada. Agora, uma vez que você tenha seu conjunto de dados carregado, seus arquivos de máscara, sua taxa de quadro e tamanho de pixel ajustado corretamente, e um diretório escolhido, você pode finalmente decidir se você quer incluir classificação como parte de sua análise. Se você alternar o botão de classificação, além de detectar eventos exocióticos, cada evento exocítico será classificado em uma das quatro classes.Depois de decidir como sua análise será executada, você pode então começar a análise clicando no botão de análise. O indicador de execução se transformará em amarelo para indicar que a análise está em andamento e voltará a ficar verde quando sua análise estiver concluída. Uma vez que a análise esteja concluída, como indicado pelo indicador de execução mudando de amarelo para verde, você notará que uma nova pasta de arquivos de dados apareceu dentro do diretório escolhido.Dentro da pasta de arquivos de dados, você encontrará arquivos de análise correspondentes a cada imagem definida em sua execução de análise. Além disso, um arquivo de estatísticas de células contendo informações sumárias, como a frequência de exocitese para cada um dos conjuntos de imagens, está aqui. Para cada conjunto de imagens, você tem um arquivo de traços fluorescentes, que contém informações sobre a posição X, posição Y e número do quadro para onde ocorrem eventos exocióticos.Além disso, a fluorescência média em uma região de interesse em torno de cada evento exocítico é apresentada antes, durante e após a exocitose. Além disso, há também um arquivo de rastreamento, que contém informações semelhantes das posições X, Y e temporal. No entanto, se a caixa de seleção de classificação for verificada, além disso, haverá quatro colunas extras, que indicam a probabilidade do evento exocítico pertencer a uma das quatro classes.Ou a fusão completa de vesículas instantânea, a fusão completa da vesícula atrasada, o beijo e a execução instantâneos, ou o beijo-e-fuga atrasaram. Um evento exociótico pertence a uma das quatro classes se for maior que 0,5 e for a maior probabilidade dentro das quatro classes regidas. Neste caso, o primeiro evento exocítico aqui pertence à classe instantânea de fusão vesícula completa, pois é o número mais alto acima das quatro classes e é maior que 0,5.Além disso, há uma série de outros arquivos de recurso para cada conjunto de imagens, que são usados durante a classificação de exocitese e podem ser de interesse para análise suplementar. Finalmente, se quisermos usar a análise K de Ripley para detectar a organização espaço-temporal da exocisose, começaremos dividindo nosso arquivo de máscara em um arquivo de máscara de neurite e um arquivo de máscara soma. Faremos isso primeiro abrindo nossa máscara na Imagem J.Vamos querer usar o seletor de cores para selecionar um pixel de fundo.E assim, quando preenchemos o arquivo da máscara, é o valor correto. Em seguida, usaremos a ferramenta de seleção de polígonos e delinearemos a região somática. Isso requer um pouco de tomada de decisão manual subjetiva.sugerimos uma elipse áspera. Depois de completar isso, você irá editar, seleção e criar máscara. Finalmente, você voltará ao nosso arquivo de máscara original e usará editar e preencher para preencher a soma, e agora temos um arquivo separado de máscara de neurite e soma, que você salvará.Uma vez que você tenha salvo o seu arquivo separado neurite e máscara soma, aqui, eu tenho-o como arquivo de máscara sublinhar neur para neurite e sublinha soma, vamos vir para MATLAB e abrir o arquivo matlab rede neurite 2D. Aqui, navegaremos a pasta atual até nosso diretório onde depositamos todos os nossos dados de análise. Uma vez feito isso, então teremos mudado o caminho do nome da máscara para o nosso novo arquivo de máscara que é o neurite.Então, neste caso, eu tenho o meu arquivo máscara neurite sob a pasta arquivos de máscara. Em seguida, mudaremos o nome do arquivo CSV para onde nosso arquivo de rastreamento fluorescente está localizado. Neste caso, ele ainda está na pasta de arquivos de dados, e assim os arquivos de dados cortam e o nome do arquivo CSV de traços fluorescentes.Uma vez que isso tenha sido concluído, você pode então bater run. Isso criará então uma versão esqueletoizada do arquivo da máscara de neurite e depositá-lo como um arquivo CSV sob a pasta de arquivos de máscara, que podemos ver aqui. Em seguida, vamos gerar um arquivo CSV para o soma também.Para isso, abra o arquivo criador da máscara CSV. Você vai querer colocar no caminho para sua máscara soma e um nome para o arquivo CSV a ser criado. Aqui eu só fui em frente e usei o mesmo nome do arquivo exato, apenas com ponto CSV anexado.Aperte a execução, e você verá que um novo arquivo soma CSV foi criado ao lado do neurite. Uma vez que tenhamos criado os arquivos CSV para a máscara de neurite e a máscara soma, podemos executar a análise K de Ripley. Para isso, navegaremos até o R Studio e abriremos o arquivo R de análise K da Ripley.Existem duas variáveis principais aqui para prestar atenção, máscara de neurônio e pontos de dados de neurônios. A máscara de neurônios apontará para qualquer arquivo de máscara que você deseja executar. Neste caso, eu estou primeiro executando os arquivos da máscara soma.Você vai querer executar todos os seus arquivos de máscara soma separadamente de todos os seus arquivos de máscara de neurite. Aqui, eu tenho dois neurônios, que eu vou usar para esta análise. No entanto, você pode usar quantos quiser para a análise K do Ripley, você só vai querer copiar e colar este código para máscara de neurônio e alterar a variável para três, e em diante.A segunda variável são os pontos de dados dos neurônios. Aqui você quer apontá-lo para o arquivo que foi gerado por seus recursos todos os arquivos R extraídos. Agora o meu foi nomeado estatísticas de fusão, e é isso que está lendo aqui.Como mencionado, eu tenho um segundo arquivo de máscara soma e neurônio, que está sendo analisado junto para que possamos agregar o Ripley's K juntos. Depois de mudar esses caminhos para o caminho correto, você usará código, executará região e executará todos. Após a execução ser concluída, várias parcelas serão geradas, incluindo os valores K agrupados de Ripley, bem como as parcelas de densidade.Estes podem ser salvos indo para exportar, salvar imagem como e escolhendo o formato de imagem apropriado, o diretório, o nome do arquivo e, finalmente, batendo salvar. Aqui vemos resultados representativos de 12 neurônios cortical murinas expressando ventilação para flúor imagem em dois dias in vitro usando microscopia TIRF. Em A, vemos a frequência da exocistose dividida por classe.Aqui podemos ver que a fusão completa de vesículas instantânea ocorre com mais frequência do que as outras classes. Em B, podemos ver a distribuição do modo, confirmando que a fusão completa de vesículas instantânea compõe mais da metade de todos os eventos. Em C determinamos a distribuição espacial da exocitose como mapa de calor.Podemos ver que a maioria dos eventos exocióticos estão agrupados em um hotspot perto da soma, bem como nas extremidades distais dos neurites. Em D podemos determinar que os eventos exocióticos são estatisticamente significativamente agrupados, e que o tamanho desses clusters variam de meio míctico a um mícente de tamanho. O uso de um programa de análise automatizado para identificar e analisar corretamente eventos exocíticos de forma imparcial aumenta a eficiência da análise e melhora a reprodutibilidade e o rigor.Para garantir a precisão da detecção, é importante manter um sinal alto para ruído durante a imagem. Capturar eventos exocióticos ou outros eventos transitórios sensíveis ao pH requer uma frequência de imagem rápida o suficiente para capturar todos os eventos e melhorar estimativas como a meia-vida ou a mudança de pico na fluorescência. Demonstramos que este programa não só funciona para capturar com precisão a fluorescência sensível ao pH no desenvolvimento de neurônios, mas também outros tipos de células.No entanto, se usar outro tipo de célula, é importante verificar se há diferenças de precisão, devido aos distintos comportamentos de eventos transitórios em outros tipos de células. Esta classificação só tem sido usada no desenvolvimento de neurônios até o momento. E, de fato, não sabemos se esses processos existem em outros tipos de células ou em pontos de tempo de desenvolvimento posteriores em neurônios.

automated-detection-and-analysis-of-exocytosis

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Este vídeo demonstra uma técnica para visualizar a exocitose em mastócitos. As células são incubadas com FITC-dextrano - um repórter fluorescente - que é absorvido pelas células dentro de grânulos secretores (SGs), onde o pH ácido extingue sua fluorescência. Após a estimulação da exocitose do grânulo, o pH mais alto do meio induz a fluorescência do repórter dentro dos SGs fundidos, que é visualizada usando um microscópio de fluorescência.

Uma técnica in vitro para visualizar a exocitose de grânulos secretores em mastócitos

endocitose mediada por clatrina, um processo rápido e altamente dinâmico internaliza muitas proteínas, incluindo receptores de sinalização. O protocolo descrito aqui visualiza diretamente a cinética de eventos endocíticos individuais. Isso é essencial para entender como os membros centrais da maquinaria endocítica se coordenam entre si e como a carga de proteínas influencia esse processo.

Visualizando Endocitose clatrina mediada por receptores acoplados à proteína a resolução de evento único através de microscopia TIRF

Existem muitos métodos diferentes para a medição de vesículas extracelulares (SVE) utilizando citometria de fluxo (FCM). Vários aspectos devem ser considerados para determinar o método mais adequado para usar. Dois protocolos de VE de medição são apresentadas, usando detecção individual ou uma abordagem baseada no talão.

Técnicas de Análise de vesículas extracelulares utilizando citometria de fluxo

O objectivo do presente protocolo foi o de desenvolver um método que permita análises genómicas funcionais da secreção de mastócitos. O protocolo baseia-se na avaliação quantitativa da libertação de um gene repórter fluorescente cotrasfected com o gene de interesse e análises em tempo real da morfologia do grânulo secretor.

Investigando Mastócito Secretory grânulos; de Biossíntese de Exocytosis

Endocitose da vesícula sináptica é detectada pela microscopia de luz de pHluorin fundido com proteínas de vesículas sinápticas e por microscopia eletrônica de absorção da vesícula.

Medindo a endocitose da vesícula sináptica nos neurônios Hippocampal culturas

Estresse osmótico afeta a exocitose e a quantidade de neurotransmissor liberado durante este processo. Demonstramos como combinando métodos eletroquímicos juntamente com microscopia eletrônica de transmissão pode ser usado para estudar o efeito da pressão osmótica extracelular na atividade de exocitose, vesículas quantal tamanho e a quantidade de neurotransmissor liberado durante a exocitose.

O efeito do estresse osmótico em vesículas secretoras e exocitose de monitoramento

Aqui detalhamos um método para a imagem latente de célula viva de exocitose regulada. Este método utiliza FITC-dextrano, que acumula em organelas lisossoma-relacionados, como repórter. Este método simples também permite distinguir entre diferentes modos de exocitose regulada em células que são difíceis de manipular geneticamente.

Imagem latente FITC-dextrano como repórter por exocitose regulada

Efferocytosis, a remoção fagocitária das células apoptóticas, é necessário para manter a homeostase e é facilitado por receptores e vias de sinalização que permitem o reconhecimento, a duração e internalização de pilhas apoptotic. Neste documento, apresentamos um protocolo de microscopia de fluorescência para a quantificação dos efferocytosis e a atividade das vias de sinalização de efferocytic.

Quantificação de Efferocytosis por microscopia de fluorescência de célula única

A imagem viva da excitose lisosômica em células micropatteradas permite uma quantificação espacial desse processo. A normalização da morfologia usando micropatterns é uma excelente ferramenta para descobrir regras gerais sobre a distribuição espacial dos processos celulares.

Quantificando parâmetros espáteris de exocitose celular em células micropatteradas

Este protocolo descreve abordagens para detecção e quantitação de grandes extrusões agregadas e/ou organelas (~4 μm) produzidas por células C. elegans na forma de exóferas ligadas à membrana. Descrevemos tensões, condições de crescimento, critérios de pontuação, considerações de tempo e microscopia necessárias para facilitar a dissecção desse mecanismo de expulsão de detritos.

Abordagens Quantitativas para Pontuação in vivo Neuronal Aggregate e Extrusão organela em Grandes Vesículas Exofer em C. elegans

Aprenda a detectar e analisar eventos de exocitose em células cultivadas usando microscopia TIRF e algoritmos de visão computacional em MATLAB. Este pipeline automatizado classifica fusões vesiculares e avalia padrões espaciais com a função K de Ripley.

Detecção e Análise Automatizada de Exocistose

Explorar mais vídeos