Name: Uso da cultura de órgãos do tipo Trowell para estudar a regulação de células-tronco dentárias (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-08T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 22 s
Description: Aprenda a cultura de órgãos tipo Trowell para estudar células-tronco epiteliais do incisivo de camundongo. Este método permite manipulação in vitro, imagem em tempo real e triagem de moléculas reguladoras.

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Este estudo foi apoiado pela Fundação Jane e Aatos Erkko.

Este protocolo envolve o uso de animais e todos os procedimentos foram aprovados pelos Comitês de Ética sobre o Uso e Cuidado de Animais e o Animal Facility da Universidade de Helsinque.
1. Preparação do prato de cultura de órgãos
<ol><li>Realizar todos os procedimentos em um exaustor de fluxo laminar. Limpe as superfícies de trabalho com etanol a 70% e utilize instrumentos e soluções de vidro autoclavado. Esterilize tesouras e outros equipamentos de metal em um esterilizador de contas de vidro.</li>
	<li>Preparar filtros normalmente armazenados em etanol a 70%, lavando-os três vezes em 1x PBS para retirada do etanol (Figura 1). Corte os filtros em pedaços retangulares (3 x 3-5 x 5 mm). NOTA: As peças de filtro lavadas podem ser armazenadas por vários dias em 1x PBS a 4 °C.</li>
	<li>Preparar o meio de cultura (1:1 DMEM:F12 suplementado com 1% [v/v] 200 mM L-alanil-L-glutamina dipeptídeo em 0,85% de NaCl, 10% [v/v] FBS, 150 μg/mL de ácido ascórbico e 0,2% [v/v] de penicilina [10.000 UI/mL] e estreptomicina [10.000 μg/mL]). Conservar a 4 °C.</li>
	<li>Coloque as grades metálicas de 30 mm (com orifícios de 1-2 mm de diâmetro que permitam a imagem do tecido) em uma placa de Petri de 35 mm. Adicione meios suficientes para alcançar a superfície da grade sem produzir bolhas de ar. Pré-aqueça o prato de cultura preparado a 37 °C até que o tecido esteja isolado e pronto para a cultura (em incubadora padrão com 5% de CO2 e 90%-95% de umidade).</li>
</ol>2. Dissecção do incisivo e isolamento da extremidade proximal
<ol><li>Sacrificar os animais de acordo com um protocolo de cuidados com os animais aprovado.</li>
	<li>Decapitar o rato e dissecar a mandíbula. Para fazer isso, primeiro remova a pele para expor a mandíbula e corte os músculos masseteres para separá-la da maxila e do resto da cabeça.</li>
	<li>Uma vez que a mandíbula esteja isolada, remova a língua e o máximo de tecido mole possível.</li>
	<li>Colete todas as mandíbulas e mantenha-as em uma placa de Petri contendo PBS no gelo, pois isso aumenta a viabilidade dos tecidos.</li>
	<li>Transfira uma mandíbula para uma placa de Petri de vidro e use agulhas hipodérmicas descartáveis 20/26 G para dissecar o incisivo sob um estereomicroscópio. Divida a mandíbula na linha média, cortando a sínfise. Limpe o tecido mole e muscular longe da superfície óssea para uma melhor visualização. NOTA: Uma placa de Petri de vidro é essencial, pois isso não embotará as agulhas.</li>
	<li>As mandíbulas obtidas de animais com menos de 10 dias são mais macias e frágeis, portanto, use agulhas hipodérmicas descartáveis de 20/26 G para abrir cada metade da mandíbula longitudinalmente para expor o dente incisivo. Para ratos com mais de 10 dias, use uma pinça para segurar a mandíbula e quebrar o osso para expor o dente.</li>
	<li>Desprenda suavemente o incisivo do osso circundante e corte a extremidade proximal, que contém a alça cervical.</li>
	<li>Corte a extremidade proximal e remova o esmalte mineralizado e a matriz dentinária.</li>
	<li>Mantenha as extremidades proximais coletadas no PBS de Dulbecco no gelo até que estejam prontas para a cultura.</li>
</ol>3. Cultura
<ol><li>Coloque cuidadosamente um retângulo de filtro no topo de uma grade em um prato de cultura pré-aquecido.</li>
	<li>Use um estereomicroscópio para orientar adequadamente as peças de tecido.</li>
	<li>Colocar numa incubadora padrão a 37 °C com 5% de CO2 e 90%-95% de humidade.</li>
	<li>Troque o meio a cada dois dias e substitua por meio fresco, evitando cuidadosamente a formação de bolhas de ar. Monitore o crescimento do tecido e fotografe diariamente usando uma câmera conectada ao estereomicroscópio.</li>
</ol>4. Adição de fatores solúveis à cultura
<ol><li>Complementar o meio de cultura com fatores solúveis e moléculas de interesse para estudar seu efeito na regulação de SCs. NOTA: O protocolo de administração para qualquer molécula (fatores de crescimento, moléculas de sinalização, anticorpos bloqueadores, compostos farmacológicos, como inibidores ou ativadores, vetores, etc.) depende de sua meia-vida e solubilidade. Esses parâmetros também determinam o controle apropriado a ser usado.</li>
</ol>5. Análises moleculares e histológicas
<ol><li>Remova o meio de cultura.</li>
	<li>Adicione cuidadosamente metanol gelado aos tecidos para evitar o descolamento dos filtros.</li>
	<li>Deixe metanol por 5 min.</li>
	<li>Filtros de transferência que transportam explantes de tecidos para tubos de amostragem.</li>
	<li>Fixar os explantes em paraformaldeído a 4% em PBS durante 10-24 h a 4 °C.</li>
	<li>Prossiga com protocolos estabelecidos para processamento histológico (parafina, congelado, etc.) ou imunocolorações.</li>
</ol>6. Cultura de fatias de tecido
NOTA: Existem várias variações para este protocolo, que são todas igualmente bem sucedidas e são uma questão de escolha pessoal, dependendo da velocidade e da habilidade do usuário. Estes referem-se ao tampão usado para coletar e manter a viabilidade do tecido. Para este propósito, o tampão de Krebs, PBS suplementado com 2% de glicose e antibióticos, ou PBS pode ser usado. Se for utilizado tampão de Krebs, este deve ser fabricado com 1 dia de antecedência e mantido a 4 °C.
<ol><li>Antes do experimento, preparar agarose de baixo ponto de fusão a 4%-5% dissolvendo 2-2,5 g de agarose de baixo ponto de fusão em 50 mL de glicose a 2% de ebulição/PBS, após o que a solução deve ser colocada em banho-maria de 45 °C.</li>
	<li>Configure o vibratome, lave com etanol a 70% e encha com 2% de glicose/PBS gelado suplementado com antibióticos (100 U/mL de penicilina, 100 mg/mL de estreptomicina).</li>
	<li>Dissecar as extremidades proximais do incisivo e coletá-las no gelado 2% de glicose/PBS suplementado com antibióticos.</li>
	<li>Coloque uma extremidade proximal do incisivo no molde contendo 4% a 5% de agarose de baixo ponto de fusão. Sob um estereomicroscópio, oriente a peça na direção desejada e deixe no gelo para que a agarose endureça.</li>
	<li>Apare o bloco de agarose endurecido e coloque-o no vibratome. Corte fatias grossas (150-300 μm).</li>
	<li>Colete as fatias em uma placa de Petri contendo 2% de glicose gelada / PBS suplementada com antibióticos.</li>
	<li>Utilizar uma espátula para transferir as fatias grossas num rectângulo de filtro colocado na grelha pré-aquecida preparada como no ponto 1.3.</li>
	<li>Incubar os cortes espessos na incubadora e proceder à imagem (Figura 2).</li>
</ol>

<ol><li>Balic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology+explaining+tooth+repair+and+regeneration%3A+A+mini-review%5BTitle%5D)+AND+%22Gerontology%22%5BJournal%5D)">Biology explaining tooth repair and regeneration: A mini-review.</a> Gerontology. 64 (4), 382-388 (2018).</li>
<li>Harada, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+putative+stem+cells+in+dental+epithelium+and+their+association+with+Notch+and+FGF+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Localization of putative stem cells in dental epithelium and their association with Notch and FGF signaling.</a> The Journal of Cell Biology. 147 (1), 105-120 (1999).</li>
<li>Smith, C. E., Warshawsky, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+renewal+in+the+enamel+organ+and+the+odontoblast+layer+of+the+rat+incisor+as+followed+by+radioautography+using+3H-thymidine%5BTitle%5D)+AND+%22The+Anatomical+Record%22%5BJournal%5D)">Cellular renewal in the enamel organ and the odontoblast layer of the rat incisor as followed by radioautography using 3H-thymidine.</a> The Anatomical Record. 183 (4), 523-561 (1975).</li>
<li>Balic, A., Thesleff, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+interactions+regulating+tooth+development+and+renewal%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Topics+in+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Tissue interactions regulating tooth development and renewal.</a> Current Topics in Developmental Biology. 115, 157-186 (2015).</li>
<li>Scadden, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+stem-cell+niche+as+an+entity+of+action%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The stem-cell niche as an entity of action.</a> Nature. 441 (7097), 1075-1079 (2006).</li>
<li>Juuri, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sox2+marks+epithelial+competence+to+generate+teeth+in+mammals+and+reptiles%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Sox2 marks epithelial competence to generate teeth in mammals and reptiles.</a> Development. 140 (7), 1424-1432 (2013).</li>
<li>Juuri, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sox2%2B+stem+cells+contribute+to+all+epithelial+lineages+of+the+tooth+via+Sfrp5%2B+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Sox2+ stem cells contribute to all epithelial lineages of the tooth via Sfrp5+ progenitors.</a> Developmental Cell. 23 (2), 317-328 (2012).</li>
<li>Feng, J., Mantesso, A., De Bari, C., Nishiyama, A., Sharpe, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+origin+of+mesenchymal+stem+cells+contributing+to+organ+growth+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Dual origin of mesenchymal stem cells contributing to organ growth and repair.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (16), 6503-6508 (2011).</li>
<li>Kaukua, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial+origin+of+mesenchymal+stem+cells+in+a+tooth+model+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Glial origin of mesenchymal stem cells in a tooth model system.</a> Nature. 513 (7519), 551-554 (2014).</li>
<li>Zhao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secretion+of+shh+by+a+neurovascular+bundle+niche+supports+mesenchymal+stem+cell+homeostasis+in+the+adult+mouse+incisor%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Secretion of shh by a neurovascular bundle niche supports mesenchymal stem cell homeostasis in the adult mouse incisor.</a> Cell Stem Cell. 14 (2), 160-173 (2014).</li>
<li>Vidovic, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((alphaSMA-expressing+perivascular+cells+represent+dental+pulp+progenitors+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Dental+Research%22%5BJournal%5D)">alphaSMA-expressing perivascular cells represent dental pulp progenitors in vivo.</a> Journal of Dental Research. 96 (3), 323-330 (2017).</li>
<li>Trowell, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+technique+for+organ+culture+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">A modified technique for organ culture in vitro.</a> Experimental Cell Research. 6 (1), 246-248 (1954).</li>
<li>Saxen, L., Vainio, T., Toivonen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+polyoma+virus+on+mouse+kidney+rudiment+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+National+Cancer+Institute%22%5BJournal%5D)">Effect of polyoma virus on mouse kidney rudiment in vitro.</a> Journal of the National Cancer Institute. 29, 597-631 (1962).</li>
<li>Thesleff, I., Sahlberg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ+culture+in+the+analysis+of+tissue+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Organ culture in the analysis of tissue interactions.</a> Methods in Molecular Biology. 461, 23-30 (2008).</li>
<li>Jarvinen, E., Shimomura-Kuroki, J., Balic, A., Jussila, M., Thesleff, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+Wnt%2Fbeta-catenin+signaling+limits+tooth+number%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal Wnt/beta-catenin signaling limits tooth number.</a> Development. 145 (4), (2018).</li>
<li>Ahtiainen, L., Uski, I., Thesleff, I., Mikkola, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+epithelial+signaling+center+governs+tooth+budding+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Early epithelial signaling center governs tooth budding morphogenesis.</a> The Journal of Cell Biology. 214 (6), 753-767 (2016).</li>
<li>Narhi, K., Thesleff, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Explant+culture+of+embryonic+craniofacial+tissues%3A+analyzing+effects+of+signaling+molecules+on+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Explant culture of embryonic craniofacial tissues: analyzing effects of signaling molecules on gene expression.</a> Methods in Molecular Biology. 666, 253-267 (2010).</li>
<li>Yang, Z., Balic, A., Michon, F., Juuri, E., Thesleff, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+Wnt%2Fbeta-Catenin+signaling+controls+epithelial+stem+cell+homeostasis+in+teeth+by+inhibiting+the+antiapoptotic+effect+of+Fgf10%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal Wnt/beta-Catenin signaling controls epithelial stem cell homeostasis in teeth by inhibiting the antiapoptotic effect of Fgf10.</a> Stem Cells. 33 (5), 1670-1681 (2015).</li>
<li>Binder, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functionally+distinctive+Ptch+receptors+establish+multimodal+hedgehog+signaling+in+the+tooth+epithelial+stem+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Functionally distinctive Ptch receptors establish multimodal hedgehog signaling in the tooth epithelial stem cell niche.</a> Stem Cells. 37 (9), 1238-1248 (2019).</li>
<li>Harada, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+putative+stem+cells+in+dental+epithelium+and+their+association+with+Notch+and+FGF+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Localization of putative stem cells in dental epithelium and their association with Notch and FGF signaling.</a> The Journal of Cell Biology. 147 (1), 105-120 (1999).</li>
<li>Seidel, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hedgehog+signaling+regulates+the+generation+of+ameloblast+progenitors+in+the+continuously+growing+mouse+incisor%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Hedgehog signaling regulates the generation of ameloblast progenitors in the continuously growing mouse incisor.</a> Development. 137 (22), 3753-3761 (2010).</li>
<li>Hadjantonakis, A. K., Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FACS+for+the+isolation+of+individual+cells+from+transgenic+mice+harboring+a+fluorescent+protein+reporter%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">FACS for the isolation of individual cells from transgenic mice harboring a fluorescent protein reporter.</a> Genesis. 27 (3), 95-98 (2000).</li>
<li>Yu, Y. A., Szalay, A. A., Wang, G., Oberg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+molecular+and+cellular+events+with+green+fluorescent+proteins+in+developing+embryos%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Luminescence%22%5BJournal%5D)">Visualization of molecular and cellular events with green fluorescent proteins in developing embryos: a review.</a> Luminescence. 18 (1), 1-18 (2003).</li>
<li>D'Amour, K. A., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+and+functional+differences+between+multipotent+neural+and+pluripotent+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Genetic and functional differences between multipotent neural and pluripotent embryonic stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, Suppl 1 11866-11872 (2003).</li>
<li>Chavez, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+dental+epithelial+stem+cells+from+the+adult+mouse+incisor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of dental epithelial stem cells from the adult mouse incisor.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (87), (2014).</li>
<li>Binder, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+strategies+for+expansion+of+tooth+epithelial+stem+cells+and+ameloblast+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Reports%22%5BJournal%5D)">Novel strategies for expansion of tooth epithelial stem cells and ameloblast generation.</a> Science Reports. 10 (1), 4963(2020).</li>
</ol>

Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

A cultura de órgãos in vitro tem sido amplamente utilizada para estudar o potencial indutivo e as interações epitelial-mesenquimais que governam o crescimento e a morfogênese dos órgãos. O laboratório Thesleff demonstrou como adaptar a modificação de Saxén da cultura de órgãos do tipo Trowell e usá-la para estudar o desenvolvimento dentário14. As condições reprodutíveis e os avanços nos repórteres fluorescentes tornaram este um método útil para monitorar a morfogênese dentária e as distin...

Os incisivos de camundongos crescem continuamente devido à preservação ao longo da vida das células-tronco (SC) que suportam a produção incessante de componentes dentários. Estes incluem SCs epiteliais, que geram ameloblastos produtores de esmalte, e células-tronco mesenquimais (MSCs), que geram odontoblastos produtores de dentina, entre outras células1. Os SCs epiteliais nos incisivos de crescimento contínuo foram inicialmente identificados como células de retenção de rótulo2,3 e, desde então, demonstraram expressar uma série de genes de caule bem conhecidos, incluindo Sox24. Essas células compartilham características comuns com SCs epiteliais em outros órgãos e residem dentro do nicho SC chamado alça cervical localizado no lado labial do incisivo. O nicho é uma entidade dinâmica composta por células e matriz extracelular que controlam a atividade da SC5. Estudos de traçado de linhagem demonstraram que os SCs epiteliais Sox2+ podem regenerar todo o compartimento epitelial do dente e que são cruciais para a formação sucessional do dente 6,7. As CTMs com potencial reparador ou regenerativo dentinário são em grande parte recrutadas de fora do órgão através de vasos sanguíneos e nervos 8,9,10,11, fornecendo, portanto, um modelo adequado para estudar o recrutamento, a migração e o alojamento da população de CTM.
Estudar SCs in vivo nem sempre é viável, uma vez que muitas das manipulações genéticas e/ou farmacológicas podem afetar a homeostase dos órgãos e/ou ter consequências letais. Portanto, a cultura de órgãos fornece uma excelente ferramenta para estudar a regulação das SCs e seus nichos in vitro. O sistema de cultura de órgãos que utiliza uma grade de metal foi inicialmente desenvolvido por Trowell12 para estudar o desenvolvimento de órgãos e foi modificado por Saxen13 para estudar sinais indutivos no desenvolvimento renal. Desde então, este método in vitro de cultura da totalidade ou parte do órgão tem sido aplicado com sucesso em diferentes campos. No campo do desenvolvimento dentário, esse método tem sido amplamente utilizado para estudar as interações epitelial-mesenquimais que regem o desenvolvimento dentário14 e a formação sucessional dentária15. O trabalho do laboratório Thesleff demonstrou a utilidade desse sistema para a análise temporal do crescimento e morfogênese dentária, para a análise do efeito de várias moléculas e fatores de crescimento no crescimento dentário e para a imagem ao vivo em tempo de lapso temporal do desenvolvimento dentário16,17. Mais recentemente, esse método tem sido utilizado para estudar a regulação de SCs incisivos e seu nicho18,19, o que é descrito em detalhes aqui.

<table><tbody><tr><td>Seringas de plástico de 1 mL Agulhas</td> hipodérmicas <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>descartáveis de calibre 20/26</td><td>Terumo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>61965-026</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco</td><td>Gibco</td><td>14287</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura Bonn extra fina</td><td>FST</td><td>14084-08</td><td></td></tr><tr><td>F-12</td><td>Gibco</td><td>31765-027</td><td></td></tr><tr><td>FBS América do Sul (CE)</td><td>LifeTechn.</td><td>10270106</td><td>dividir em aliquotes, armazenar a -20&deg; C</td></tr><tr><td>Esterilizador de esferas de vidro, Esterilizador Steri 250 Seconds-Sterilizer</td><td>Simon Keller Ltd</td><td>4AJ-6285884</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX-1 (200 mM L-alanil-L-glutamina dipeptídeo)</td><td>Gibco</td><td>35050-038</td><td></td></tr><tr><td>Isopore Polycarb.Filters, 0,1 um 25 mm de diâmetro</td><td>MerckMillipore</td><td>VCTP02500</td><td>Armazene em etanol a 70% à temperatura ambiente.</td></tr><tr><td>L-Ácido Ascobic</td><td>Sigma</td><td>A4544-25g</td><td>diluído 100 mg/ml em MilliQ, filtro estretilado e dividido em 20&mu; l aliquotes, armazenar no escuro, -20&deg; C</td></tr><tr><td>Agarose de baixo ponto de fusão</td><td>TopVision</td><td>R0801</td><td></td></tr><tr><td>Grelhas metálicas</td><td></td><td></td><td>Comercialmente disponível, ou fabricado em malha de aço inoxidável (resistente à corrosão, tamanho da malha 0,7 mm). Corte o disco de aproximadamente 30 mm de diâmetro e dobre as bordas para obter 3 mm de altura. Use pregos para fazer furos.</td></tr><tr><td>Micro fórceps</td><td>Medicon</td><td>07.60.03</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeído</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina (10.000U/ml) sol.</td><td>Gibco</td><td>15140-148</td><td></td></tr><tr><td>Placas de Petri, Vidro Soda-Cal</td><td>DWK Life Sciences</td><td>9170442</td><td></td></tr><tr><td>Petridish 35 mm, com ventilação</td><td>Duran</td><td>237554008</td><td></td></tr><tr><td>Petridish 90 mm, sem ventilação clássico</td><td>Thermo Fisher</td><td>101RT/C</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura pequena</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

uso da cultura de órgãos do tipo trowell para estudar a regulação de células-tronco dentárias

Use of Trowell-Type Organ Culture to Study Regulation of Dental Stem Cells

O desenvolvimento, a função e a regeneração dos órgãos dependem das células-tronco, que residem em espaços anatômicos discretos chamados nichos de células-tronco. O incisivo de camundongo em crescimento contínuo fornece um excelente modelo para estudar células-tronco específicas de tecidos. As células-tronco específicas do tecido epitelial do incisivo estão localizadas na extremidade proximal do dente em um nicho chamado alça cervical. Eles fornecem um influxo contínuo de células para contrabalançar a abrasão constante da ponta auto-afiada do dente. Apresenta-se aqui um protocolo detalhado para o isolamento e cultura da extremidade proximal do incisivo de camundongo que abriga células-tronco e seu nicho. Este é um protocolo de cultura de órgãos do tipo Trowell modificado que permite a cultura in vitro de pedaços de tecido (explantes), bem como as fatias de tecido espesso na interface líquido/ar em um filtro suportado por uma grade metálica. O protocolo de cultura de órgãos descrito aqui permite manipulações teciduais inviáveis in vivo e, quando combinado com o uso de um repórter fluorescente, fornece uma plataforma para a identificação e rastreamento de populações de células discretas em tecidos vivos ao longo do tempo, incluindo células-tronco. Várias moléculas reguladoras e compostos farmacológicos podem ser testados neste sistema quanto ao seu efeito sobre as células-tronco e seus nichos. Isso, em última análise, fornece uma ferramenta valiosa para estudar a regulação e a manutenção das células-tronco.

Os SCs epiteliais residem em um nicho denominado alça cervical, que se localiza na extremidade proximal do incisivo (Figura 3A). As alças cervicais são estruturas morfologicamente distintas compostas de epitélio interno e externo do esmalte que envolvem o retículo estrelado, um núcleo de células epiteliais frouxamente dispostas (Figura 3B,C). Existem duas alças cervicais em cada incisivo (Figura 3A), mas apenas a al...

O método de cultura de órgãos do tipo Trowell tem sido usado para desvendar redes de sinalização complexas que governam o desenvolvimento dentário e, mais recentemente, para estudar a regulação envolvida nas células-tronco do incisivo de camundongos em crescimento contínuo. Modelos animais fluorescentes-repórteres e métodos de imagem ao vivo facilitam análises aprofundadas de células-tronco dentárias e seu microambiente de nicho específico.

Uso da cultura de órgãos do tipo Trowell para estudar a regulação de células-tronco dentárias

Organ development, function, and regeneration depend on stem cells, which reside within discrete anatomical spaces called stem cell niches. The ...

A cultura de órgãos do tipo Trowell é usada para cultivar explantes de tecidos. Aqui, mostramos como usar esse método para estudar as células-tronco em dentes de crescimento contínuo. Com esta técnica, podemos estudar as células-tronco e seu comportamento no nicho e rastrear o efeito de várias moléculas na sobrevivência e manutenção das células-tronco.Este método pode ser aplicado para estudar as células-tronco de outros órgãos também, como a pele ou a glândula mamária. Comece colocando grades metálicas de 30 milímetros com orifícios de um a dois milímetros de diâmetro em uma placa de Petri de 35 milímetros. Preencha o local com mídia até que a mídia atinja a superfície da grade.Em seguida, incube a placa a 37 graus Celsius até que o tecido esteja isolado e pronto para a cultura. Depois de decapitar o rato, remova a pele para expor a mandíbula e corte os músculos masseteres para separar a mandíbula da maxila e do resto da cabeça. Uma vez que a mandíbula esteja isolada, remova a língua e o máximo de tecidos moles.Divida a mandíbula na linha média, cortando a sínfise. Coloque a mandíbula na placa de Petri contendo PBS no gelo. Use uma agulha hipodérmica descartável de calibre 20 por

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

O método descrito o isolamento e caracterização de células pulpares humanas estaminais (hDPSCs)...

Isolamento, caracterização e comparativa Diferenciação de células-tronco da polpa dentária Derivado de dentes permanentes usando dois métodos diferentes

O contínuo crescimento incisivo do rato é um modelo para o estudo de renovação dos tecidos dentários a partir de células-tronco do epitélio dental (DESCs). Um sistema robusto para consistente e confiável a obtenção destas células a partir do incisivo e expandi-las in vitro é relatado aqui.

Isolamento e Cultura da Dental epiteliais células-tronco do Adulto Rato Incisivo

As coculturas representam um método valioso para estudar as interações entre os nervos e os tecidos e órgãos-alvo. Os sistemas microfluídicos permitem a co-cultura de gânglios e órgãos ou tecidos inteiros em desenvolvimento em diferentes meios de cultura, representando assim uma ferramenta valiosa para o estudo in vitro da interferência entre neurônios e seus alvos.

Análise de Desenvolvimento de dente Germ Innervation Utilizar dispositivos microfluídicos Co-cultura

Este protocolo descreve a transiente engenharia genética de células-tronco dentárias extraídas do folículo dental humano. A estratégia de modificação não-virais aplicada pode tornar-se uma base para a melhoria dos produtos terapêuticos células-tronco.

Isolamento, caracterização e baseada em MicroRNA modificação genética de células-tronco humanas folículo Dental

Nós fornecemos os protocolos para avaliação de células-tronco mesenquimais isoladas de polpa dentária e interações de células de câncer de próstata baseadas em métodos diretos e indiretos co-cultura. Médio de condição e membranas de trans-bem são apropriadas analisar a atividade indireta parácrina. Semeando diferencialmente manchado células juntos é um modelo adequado para a interação célula-célula direto.

Isolamento de células-tronco mesenquimais de tecido pulpar e co-cultura com células cancerosas para estudar suas interações

Descrevemos o isolamento, dispersão e revestimento de células primárias de polpa dentária (DP) com neurônios trigêmeos (TG) cultivados no topo de filtros transwell overover. As respostas celulares das células DP podem ser analisadas com imunofluorescência ou análise de RNA/proteína. A imunofluorescência dos marcadores neuronais com microscopia confocal permite a análise de respostas de crescimento neurite.

Um método de co-cultura para estudar o crescimento da neurita em resposta aos sinais de paracrina da polpa dentária

Este protocolo apresenta um método para a cultura e crescimento 3D de células semelhantes a ameloblastos em microgravidade para manter sua forma alongada e polarizada, bem como a expressão de proteínas específicas do esmalte. Condições de cultura para a cultura de construções de engenharia periodontal e órgãos pulmonares em microgravidade também são descritas.

Propagação de Células e Órgãos Dentários e Respiratórios em Microgravidade

Apresentamos um protocolo para desenvolver culturas organoides epiteliais a partir do dente humano. Os organoides são robustamente expansíveis e recapitulam as células-tronco epiteliais do dente, incluindo sua capacidade de diferenciação de ameloblast. O modelo organoide único fornece uma ferramenta promissora para estudar a biologia dentário humano (células-tronco) com perspectivas para abordagens regenerativas dentárias.

Estabelecendo organoides do dente humano como uma poderosa ferramenta para pesquisa mecanicista e terapia regenerativa

Este artigo fornece um guia passo a passo para estabelecer uma cultura primária de células-tronco de polpa dentária usando o método de cultura de explante e caracterização dessas células com base nas diretrizes do ICSCRT. As células isoladas por este protocolo podem ser consideradas como células-tronco mesenquimais para futuras aplicações.

Cultura Primária de Células-Tronco da Polpa Dentária

Este protocolo enfatiza a extração, cultura e preservação de células-tronco multipotentes da polpa dentária por meio da digestão enzimática. Além disso, demonstra seu potencial de diferenciação em osteoblastos, adipócitos e condrócitos, destacando a importância da precisão e consistência no processo.

Isolamento, Cultura e Caracterização de Células-Tronco da Polpa Dentária de Dentes Humanos Decíduos e Permanentes

A imagem ao vivo ex vivo é uma técnica poderosa para estudar os processos dinâmicos de movimentos celulares e interações em tecidos vivos. Aqui, apresentamos um protocolo que implementa microscopia de dois fótons para rastrear células epiteliais dentárias vivas em incisivos adultos inteiros cultivados.

Usando imagens ao vivo ex vivo para investigar divisões celulares e movimentos durante a renovação dentária de camundongos

Aprenda a cultura de órgãos tipo Trowell para estudar células-tronco epiteliais do incisivo de camundongo. Este método permite manipulação in vitro, imagem em tempo real e triagem de moléculas reguladoras.

Uso da cultura de órgãos do tipo Trowell para estudar a regulação de células-tronco dentárias

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