Name: In situ Exploração de Murine Megacaryopoiesis usando Microscopia eletrônica de transmissão (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-08T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 15 s
Description: Aprenda a analisar a ultraestrutura de megacariócitos na medula óssea de camundongos usando microscopia eletrônica de transmissão. Este método permite quantificar estágios de maturação in situ com alta resolução.

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Os autores agradecem a Fabienne Proamer, Jean-Yves Rinckel, David Hoffmann, Monique Freund pela assistência técnica. Este trabalho foi apoiado pela ARMESA (Association de Recherche et Développement en Médecine et Santé Publique), pela União Europeia através do Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional (ERDF) e pelo Grant ANR-17-CE14-0001-01 ao H.d.S.

Todos os experimentos em animais foram realizados de acordo com as normas europeias 2010/63/UE e o Comitê de Ética dos Experimentos Animais da Universidade de Estrasburgo (Comité Régional d'Ethique en Matière d'Expérimentation Animale Strasbourg). O protocolo é mostrado esquematicamente na Figura 1.
1. Coleta e fixação da medula óssea (Figura 1A)
ATENÇÃO: Este procedimento inclui substâncias cancerígenas, mutagênicas e/ou tóxicas e é realizado sob uma capa de extração química. Use equipamentos de proteção adequados, como luvas e óculos de proteção.
<ol><li>Prepare a solução fixativa composta por 2,5% de glutaraldeído no tampão de cacodilato (ver Arquivo Suplementar).</li>
	<li>Coleta de medula óssea<ol>
<li>Use camundongos adultos C57BL/6 de ambos os sexos de 12 a 18 semanas de idade. Eutanize os camundongos por asfixia de CO2 e luxação cervical.</li>
		<li>Com um par de tesouras finas, corte a pele ao redor da coxa e use pinças para descascar a pele. Retire a extremidade da pata e corte entre o quadril e a coxa. Desprender a tíbia do fêmur cortando a articulação do joelho e removendo tecido aderente nas tíbias e fêmures usando um bisturi.</li>
		<li>Remova as epífitas com uma lâmina afiada. Enquanto segura o fêmur com pinças, use uma seringa de 5 mL cheia de tampão de cacodilato com uma agulha de 21 G para lavar a medula óssea em um tubo de 15 mL preenchido com tampão de cacodilato de 2 mL. Para isso, insira o bisel da agulha na abertura da medula óssea e pressione lentamente o êmbolo até que a medula seja expelida.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fixação da medula óssea por rápida imersão em fixação.<ol>
<li>Imediatamente após a descarga, use uma pipeta de plástico para transferir o cilindro de medula óssea para 1 mL de solução fixativa de glutaraldeído fresco (previamente preparado em 1,1) por 60 minutos à temperatura ambiente. NOTA: Para preservar o tecido, certifique-se de que todo o processo, desde a dissecção óssea até a etapa de fixação, seja concluído em menos de 10 minutos. Para a fixação, certifique-se de que a solução fixada esteja à temperatura ambiente para evitar choque térmico.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Incorporando medula óssea em agarose
NOTA: O tecido de medula não é suficientemente coeso para manter sua integridade durante as diferentes etapas de lavagem e o material pode ser facilmente perdido. Para superar esse problema, a medula é coberta por um gel de ágar antes da desidratação.
<ol><li>Prepare a solução agarose conforme descrito no Arquivo Suplementar.</li>
	<li>Lave a medula fixa da seção 1.3 no tampão de cacodilato e transfira-a cuidadosamente para um slide de vidro usando uma pipeta de plástico. Usando uma pipeta quente, aplique rapidamente uma gota de ágar líquido de 2% no cilindro de medula óssea. NOTA: O ágar se solidifica rapidamente durante o resfriamento. Para garantir uma cobertura homogênea da medula óssea, a solução de ágar deve ser mantida aquecida até que seja depositada no slide.</li>
	<li>Coloque rapidamente o deslizamento no gelo até que o ágar se solidifique (1-2 min).</li>
	<li>Sob um microscópio, use uma lâmina afiada para cortar e descartar as extremidades do cilindro de medula óssea devido a uma possível compressão tecidual nessas áreas. Transfira os blocos de medula em tubos de microcentrifuus de 1,5 mL contendo 1 mL de tampão de cacodilato.</li>
</ol>3. Incorporando medula óssea em resina
ATENÇÃO: Os componentes da resina são tóxicos; alguns são cancerígenos e devem ser tratados com cuidado sob uma capa de extração química. Use equipamentos de proteção adequados, como luvas e óculos de proteção. O tetroxida de ósmio é altamente volátil à temperatura ambiente e seus vapores são muito prejudiciais aos olhos, nariz e garganta. Antes de ser descartado, 2% de tetroxida de ósmio deve ser neutralizado adicionando o dobro do volume de óleo vegetal.
<ol><li>Prepare a resina epóxi conforme descrito no Arquivo Suplementar.</li>
	<li>Incorporação de resina NOTA: Mantenha as amostras nos mesmos tubos de microcentrifuuuge durante incubações em banhos sucessivos de ósmio, acetato de urânyl e etanol. Aspire os supernantes com uma pipeta Pasteur. O volume de solução utilizado para cada banho deve ser igual a pelo menos 10x o volume da amostra.<ol>
<li>Corrija os blocos com 1% de osmium no tampão de cacodilato por 1h a 4 °C, lave uma vez no tampão de cacodilato e, em seguida, uma vez em água destilada.</li>
		<li>Colora com acetato de 4% de urano em água destilada por 1h, lave duas vezes em água destilada.</li>
		<li>Desidratar através de uma série classificada de etanol em água destilada: 4 vezes em 75% de etanol por 5 min, seguido por 3 vezes em 95% etanol por 20 min e depois 3 vezes em 100% etanol por 20 min. Nesta etapa, retire uma seringa de resina epóxi do congelador. NOTA: O protocolo pode ser pausado em 100% de etanol por 1h.</li>
		<li>Para obter infiltração uniforme e polimerização de resina epóxi dentro da medula, incubar primeiro os blocos em 2 banhos sucessivos de óxido de propileno por 15 minutos.</li>
		<li>Adicione uma mistura de 1:1 de óxido de propileno 100% e resina epóxi e incubar por 1h. Coloque as amostras em um agitador rotativo lento à temperatura ambiente.</li>
		<li>Adicionar resina 100% epóxi deixe a amostra para incubação durante a noite sob agitação.</li>
		<li>Adicione resina 100% epóxi para incubação de 2 h, ainda sob agitação.</li>
		<li>Sob um microscópio, coloque os blocos de medula em moldes planos de silicone. Orientar amostras para permitir a secção transversal subsequente de toda a medula óssea. Encha os moldes com resina epóxi e coloque-os a 60 °C por 48 h. NOTA: Todas as soluções (exceto etanol e óxido de propileno) são filtradas através de filtro de 0,22 μm para evitar a contaminação das amostras. Para garantir a polimerização adequada da resina, evite bolhas enquanto encha os moldes.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Secção ultrathin(Figura 1B)
NOTA: A transmissão EM requer seções de tecido fino através das quais os elétrons podem passar gerando uma imagem de projeção do interior das células, estrutura e organização de organelas internas (grânulos, órticulum endoplasmático, Golgi) e o arranjo de membranas celulares intracelulares.
<ol><li>Monte o bloco de amostra em um suporte ultra-microtóm mestom. Coloque no suporte da amostra. Corte as amostras em 45° para remover o excesso de resina ao redor do tecido com um cortador de fresagem de diamante rotativo ou tungstênio.</li>
	<li>Monte as amostras no ultramicroome com uma lâmina de faca de diamante equipada com um tanque de água. Corte seções transversais de 500 nm e 100 nm de espessura para análises histológicas e TEM, respectivamente. Colete seções flutuantes na superfície da água com um laço.</li>
	<li>Deposite a seção de 500 nm de espessura em um escorregador de vidro e seções de 100 nm de espessura em 200 grades de cobre de malha fina com um filtro de papel por baixo. Prepare cinco grades para uma condição: manche duas grades primeiro e mantenha as três grades restantes como backup, se necessário.</li>
</ol>5. Mancha azul toluidina para histologia
NOTA: As seções de coloração para histologia são importantes por três razões: 1) para garantir que o tecido seja realmente cortado e não a resina, 2) para verificar a qualidade da inclusão, e 3) para avaliar rapidamente a amostra de medula. Se isso não estiver correto, corte mais fundo no bloco.
<ol><li>Seque as seções semifinas deslizem sobre uma placa de calor (60 °C).</li>
	<li>Adicione 1% de toluidina azul/1 % de borato de sódio em água destilada nas lâminas e aqueça em uma placa quente (60 °C) por 1-2 min. Lave os slides com água destilada e deixe secar na placa de calor.</li>
	<li>Monte seções em tampas com uma gota de poli (methacrilato-co-metil metacrilato de butil) meio de montagem e examine sob um microscópio leve.</li>
</ol>6. Manchas de metais pesados para observação TEM(Figura 1C)
NOTA: Para o contraste, o lado superior das grades são invertidos em gotas de 100 μL de cada banho sucessivo com um laço. Antes de ser utilizado, cada solução é filtrada por 0,22 μm. Remova o excesso de líquido entre cada banho, entre em contato suavemente com o lado da grade em um papel filtro.
<ol><li>Mancha com acetato de 4% de uranyl em água destilada por 5 min.</li>
	<li>Lave 3 vezes em água destilada por 5 minutos.</li>
	<li>Mancha com citrato de chumbo por 3 minutos.</li>
	<li>Lave 3 vezes em água destilada por 5 minutos.</li>
	<li>Deposite as grades pelo lado inferior em contato com o papel do filtro para deixá-las secar. NOTA: Metais pesados reagem na presença de dióxido de carbono. Para minimizar os precipitados, evite o deslocamento do ar durante o contraste, não fale, mantenha o ambiente calmo e desligue o ar-condicionado.</li>
</ol>7. TEM (Figura 1E)
NOTA: As seções são introduzidas em um microscópio TEM e examinadas a 120 kV.
<ol><li>Primeiro examine as seções em baixa ampliação (< 500x) para apreciar o aspecto geral da preparação (ausência de orifício na resina, dobras/compressão nas seções, precipita devido à coloração).</li>
	<li>Em seguida, examine as seções em maior ampliação (~ 2000x permitindo distinguir o estágio de maturação). Conte manualmente os megacaiócitos de cada etapa de maturação sobre seções transversais inteiras (consulte Resultados Representativos sobre como identificar visualmente cada estágio). NOTA: Cada quadrado das grades é definido como uma área para exame (o que equivale a 16000 μm2 para 200 grades de cobre de malha).</li>
	<li>Para avaliar o número de megacaiócitos, quantifique apenas os quadrados que estão totalmente cobertos com uma seção. Para isso, use um modelo baseado na triagem de faixas. Observe uma primeira gama de quadrados de uma extremidade da seção para outra, depois outra faixa da mesma forma, etc. Usando este procedimento, tela total e sistematicamente toda a seção transversal da medula quadrada por quadrado.</li>
	<li>Para cada quadrado, marque o número de megacaiócitos estágio I, II ou III. NOTA: Ampliações mais elevadas são necessárias para analisar os grânulos, a organização DMS, o tamanho dos territórios citoplasmáticos e o núcleo polilobulado.</li>
</ol>

<ol><li>Machlus, K. R., Italiano, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+incredible+journey%3A+From+megakaryocyte+development+to+platelet+formation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The incredible journey: From megakaryocyte development to platelet formation.</a> The Journal of Cell Biology. 201 (6), 785-796 (2013).</li>
<li>Zucker-Franklin, D., Termin, C. S., Cooper, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+changes+in+the+megakaryocytes+of+patients+infected+with+the+human+immune+deficiency+virus+%28HIV-1%29%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Structural changes in the megakaryocytes of patients infected with the human immune deficiency virus (HIV-1).</a> American Journal of Pathology. 134 (6), 9(1989).</li>
<li>Eckly, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biogenesis+of+the+demarcation+membrane+system+%28DMS%29+in+megakaryocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Biogenesis of the demarcation membrane system (DMS) in megakaryocytes.</a> Blood. 123 (6), 921-930 (2014).</li>
<li>Scandola, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+electron+microscopy+to+study+megakaryocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Platelets%22%5BJournal%5D)">Use of electron microscopy to study megakaryocytes.</a> Platelets. , 1-10 (2020).</li>
<li>Behnke, O., Forer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+megakaryocytes+to+platelets%3A+platelet+morphogenesis+takes+place+in+the+bloodstream%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Haematology%22%5BJournal%5D)">From megakaryocytes to platelets: platelet morphogenesis takes place in the bloodstream.</a> European Journal of Haematology. 60, 3-23 (2009).</li>
<li>Eckly, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+megakaryocyte+development+in+the+native+bone+marrow+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Platelets+and+Megakaryocytes%22%5BJournal%5D)">Characterization of megakaryocyte development in the native bone marrow environment.</a> Platelets and Megakaryocytes. 788, 175-192 (2012).</li>
<li>Brown, E., Carlin, L. M., Nerlov, C., Lo Celso, C., Poole, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+membrane+extrusion+sites+drive+megakaryocyte+migration+into+bone+marrow+blood+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Science+Alliance%22%5BJournal%5D)">Multiple membrane extrusion sites drive megakaryocyte migration into bone marrow blood vessels.</a> Life Science Alliance. 1 (2), 201800061(2018).</li>
<li>Eckly, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Megakaryocytes+use+in+vivo+podosome-like+structures+working+collectively+to+penetrate+the+endothelial+barrier+of+bone+marrow+sinusoids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">Megakaryocytes use in vivo podosome-like structures working collectively to penetrate the endothelial barrier of bone marrow sinusoids.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. , 15024(2020).</li>
<li>Cramer, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructure+of+platelet+formation+by+human+megakaryocytes+cultured+with+the+Mpl+ligand%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Ultrastructure of platelet formation by human megakaryocytes cultured with the Mpl ligand.</a> Blood. 89 (7), 2336-2346 (1997).</li>
<li>Heijnen, H. F. G., Debili, N., Vainchencker, W., Breton-Gorius, J., Geuze, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multivesicular+Bodies+Are+an+Intermediate+Stage+in+the+Formation+of+Platelet+%CE%B1-Granules%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Multivesicular Bodies Are an Intermediate Stage in the Formation of Platelet α-Granules.</a> Blood. 7 (7), 2313-2325 (1998).</li>
<li>Gupta, N., Jadhav, K., Shah, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emperipolesis%2C+entosis+and+cell+cannibalism%3A+Demystifying+the+cloud%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Oral+and+Maxillofacial+Pathology%22%5BJournal%5D)">Emperipolesis, entosis and cell cannibalism: Demystifying the cloud.</a> Journal of Oral and Maxillofacial Pathology. 21 (1), 92(2017).</li>
<li>Centurione, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+and+pathologic+emperipolesis+of+neutrophils+within+megakaryocytes+associated+with+marrow+fibrosis+in+GATA-1low+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Increased and pathologic emperipolesis of neutrophils within megakaryocytes associated with marrow fibrosis in GATA-1low mice.</a> Blood. 104 (12), 3573-3580 (2004).</li>
<li>Ellis, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+relationship+between+bone%2C+hemopoietic+stem+cells%2C+and+vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The relationship between bone, hemopoietic stem cells, and vasculature.</a> Blood. 118 (6), 1516-1524 (2011).</li>
<li>Bornert, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoskeletal-based+mechanisms+differently+regulate+in+vivo+and+in+vitro+proplatelet+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">Cytoskeletal-based mechanisms differently regulate in vivo and in vitro proplatelet formation.</a> Haematologica. , (2020).</li>
</ol>

Os autores não têm conflitos de interesses para declarar.

O exame direto dos megacaitos em seu ambiente nativo é essencial para entender a megacariopoiese e a formação de plaquetas. Neste manuscrito, fornecemos um método de microscopia eletrônica de transmissão combinando descarga e fixação da medula óssea por imersão, permitindo dissecar in situ as características de morfologia de todo o processo de morfogênese de megacaiócito ocorrendo na medula óssea.
A lavagem da medula óssea é um passo crítico desse método, pois o sucesso de uma descarg...

Os megacariócitos são grandes células poliploides especializadas, localizadas na medula óssea, responsáveis pela produção deplaquetas 1. Elas se originam de células-tronco hematopoiéticas através de um intrincado processo de maturação, durante o qual os precursores de megacaitos aumentam progressivamente de tamanho, enquanto passam por extensas alterações morfológicas concomitantes no citoplasma e núcleo2. Durante o amadurecimento, os megacaitos desenvolvem uma série de elementos estruturais distintos, incluindo: um núcleo polilobulado, invaginações da membrana superficial que formam o sistema de membrana de demarcação (DMS), uma zona periférica desprovida de organelas cercadas pela rede citoesqueletal baseada em actina, e inúmeras organelas, incluindo α-granulos, granulos densoss, lysosomes, e múltiplos complexos de Gol. No nível ultraestrutural, uma grande modificação observada é a compartimentação citoplasmática em regiões discretas delimitadas pelo DMS3. Esse extenso fornecimento de membranas alimentará a extensão de longos processos citoplasmados na fase inicial de produção de plaquetas, que depois se remodelará em plaquetas dentro da circulação. Qualquer defeito durante a diferenciação e maturação do megacaito pode afetar a produção de plaquetas em termos de contagem de plaquetas e/ou função plaqueta. 
A microscopia eletrônica de transmissão de camada fina (TEM) tem sido a abordagem de imagem escolhida há décadas fornecendo ultraestrutura de alta qualidade de megacaiócitos que moldaram nossa compreensão da fisiologia da trombopoiese4,5. Este artigo se concentra em um método TEM padronizado que permite capturar o processo de biogênese plaquetária que ocorre in situ dentro do microambiente nativo da medula óssea, que também poderia servir de base para analisar qualquer tipo de célula de medula óssea. Fornecemos exemplos ultraestruturais do desenvolvimento de megacaiócitos de imaturos a totalmente maduros, que estendem processos citoplasmicos à microcirculação dos sinusoides6. Descrevemos também um procedimento fácil para quantificar os diferentes estágios de maturação de megacariote, instruindo sobre a capacidade de regeneração e produção de plaquetas da medula óssea.

<table><tbody><tr><td>2,4,6-Tri (dimetilaminometil) fenol (DMP-30)</td> <td>Ladd Research Industries, EUA</td><td>21310</td><td></td></tr><tr><td>Agarose tipo LM-3 Low Melting Point Agar</td><td>Electron Microscopy Sciences, EUA</td><td>1670-B</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2 Cloreto de cálcio hexahidratado</td><td>Merck, Alemanha</td><td>2083</td><td></td></tr><tr><td>Grades de cobre 200 mesh thin-bar</td><td>Oxford Instrument, Agar Scientifics, Inglaterra</td><td>T200-</td><td></td></tr><tr><td>Sal de sódio de ácido dimetilarsínico trihidratado</td><td>Merck, Alemanha</td><td>8.20670.0250</td><td></td></tr><tr><td>Anidrido dodecenil succínico (DDSA)</td><td>Ladd Research Industries, EUA</td><td>21340</td><td></td></tr><tr><td>Lâmina de barbear de aço inoxidável de dupla borda</td><td>Microscopia eletrônica Sciences-EMS, EUA</td><td>EM-72000</td><td></td></tr><tr><td>Etanol absolut</td><td>VWR International, França</td><td>20821296</td><td></td></tr><tr><td>Filter papel, 90 mm de diâmetro</td><td>Whatman, Inglaterra</td><td>512-0326</td><td></td></tr><tr><td>Molde de silicone embutido plano</td><td>Oxford Instrument, Agar Scientific, Inglaterra</td><td>G3533</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldeído 25%</td><td>Microscopia Eletrônica Sciences-EMS, EUA</td><td>16210</td><td></td></tr><tr><td>Placa de aquecimento Leica EMMP</td><td>Leica Microsystems GmbH, Áustria</td><td>705402</td><td></td></tr><tr><td>Faca de diamante Histo 45&deg;</td><td>Diatome, Suíça</td><td>1044797</td><td></td></tr><tr><td>microscópio JEOL 2100 Plus TEM</td><td>JEOL, Japão</td><td>EM-21001BU</td><td></td></tr><tr><td>Citrato de chumbo - Ultrostain 2</td><td>Leica Microsystems GmbH, Áustria</td><td>70 55 30 22</td><td></td></tr><tr><td>LX-112 resina</td><td>Ladd Research Industries, EUA</td><td>21310</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2 Cloreto de magnésio hexahidratado</td><td>Sigma, França</td><td>M2393-100g</td><td></td></tr><tr><td>Meio de montagem - Poli (metacrilato de butila-co-metacrilato de metila)</td> <td>Microscopia Eletrônica Sciences-EMS, EUA</td><td>15320</td><td></td></tr><tr><td>Anidrido de Metila Nadic (NMA)</td> <td>Ladd Research Industries, EUA</td><td>21350</td><td></td></tr><tr><td>Tetróxido de ósmio 2%</td> <td>Merck, Alemanha</td><td>19172</td><td></td></tr><tr><td>Óxido de propileno (1,2-epoxipropano)</td> <td>Sigma, França</td><td>82320-250ML</td><td></td></tr><tr><td>Solução injetável salina 0.9% NaCl</td><td>C.D.M Lavoisier, França</td><td>MA 575 420 6</td><td></td></tr><tr><td>Bisturi Lâmina de aço cirúrgico</td><td>Swann-Morton,</td> <td>Inglaterra.0508</td><td></td></tr><tr><td>Tetraborato de sódio - Borax</td><td>Sigma, França</td><td>B-9876</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Merck, Alemanha</td><td>84100-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de seringa 0.2&micro; m</td><td>Pall Corporation, EUA</td><td>514-4126</td><td></td></tr><tr><td>Azul de toluidina</td><td>Ladd Research Industries, EUA</td><td>N10-70975</td><td></td></tr><tr><td>Aparador EM TRIM2</td><td>Leica Microsystems GmbH, Áustria</td><td>702801</td><td></td></tr><tr><td>Ultramicrótomo Ultracut UCT</td><td>Leica Microsystems GmbH, Áustria</td><td>656201</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de uranilo</td><td>Ladd Research Industries, EUA</td><td>23620</td><td></td></tr></tbody></table>

in situ exploração de murine megacaryopoiesis usando microscopia eletrônica de transmissão

In Situ Exploration of Murine Megakaryopoiesis using Transmission Electron Microscopy

A diferenciação e a maturação dos megacaiócitos ocorrem em estreita associação com os componentes celulares e extracelulares da medula óssea. Esses processos são caracterizados pelo aparecimento gradual de estruturas essenciais no citoplasma de megacaitosto, como um núcleo poliploide e polilobulado, uma rede interna de membrana chamada sistema de membrana demarcação (DMS) e os grânulos densos e alfa que serão encontrados em plaquetas circulantes. Neste artigo, descrevemos um protocolo padronizado para o estudo ultraestrutural in situ de megacariócitos murinas utilizando microscopia eletrônica de transmissão (TEM), permitindo a identificação de características-chave que definem seu estágio de maturação e densidade celular na medula óssea. As medulas ósseas são lavadas, fixas, desidratadas no etanol, embutidas em resina plástica e montadas para geração de seções transversais. Seções semifinas e finas são preparadas para observações histológicas e TEM, respectivamente. Este método pode ser usado para qualquer célula de medula óssea, em qualquer instalação EM e tem a vantagem de usar pequenos tamanhos de amostra permitindo a combinação de várias abordagens de imagem no mesmo mouse.

Histologia da medula óssea A observação da histologia azul toluidina da medula óssea sob um microscópio leve é fundamental para analisar rapidamente a arquitetura geral do tecido em termos de, por exemplo, compactação tecidual, continuidade de microvasos e o tamanho e forma de megacaiócitos (Figura 1D). É realizado antes de seções ultrathin para determinar a necessidade de corte mais profundo no bloco de medula óssea. Devido ao seu tamanho gigante e lobul...

Aqui, apresentamos um protocolo para analisar a ultraestrutura dos megacaiócitos in situ usando microscopia eletrônica de transmissão (TEM). As medulas ósseas murinas são coletadas, fixas, embutidas em resina epóxi e cortadas em seções ultrafinas. Após a coloração de contraste, a medula óssea é observada sob um microscópio TEM a 120 kV.

In situ Exploração de Murine Megacaryopoiesis usando Microscopia eletrônica de transmissão

Differentiation and maturation of megakaryocytes occur in close association with the cellular and extracellular components of the bone marrow. These ...

O objetivo geral deste procedimento é observar a ultra estrutura de megacaiócitos localizados dentro da medula óssea do rato, e quantificar os diferentes estágios de maturação usando microscopia eletrônica de transmissão de alta resolução. A principal vantagem é o exame direto dos megacaiócitos no ambiente nativo, que difere dos megacariócitos in vitro cultivados que, como sabemos, não atingem o nível completo de maturação. Depois de colher a tíbia e os fêmures de 12 a 18 semanas de idade C57BL/6 camundongos de acordo com os protocolos padrão, use uma lâmina afiada para remover as epífitas de cada osso.Segurando cada osso com pinças, insira uma agulha de calibre 21 presa a uma seringa de cinco mililitros preenchida com tampão de cacodilato em uma extremidade do osso e coloque a medula óssea em um tubo de coleta de 15 mililitros contendo dois mililitros de tampão de cacodilato fresco. Imediatamente após a descarga, use uma pipeta de plástico para transferir os cilindros de medula óssea em um mililitro de solução fixativa de glutaraldeído fresco para uma incubação de 60 minutos à temperatura ambiente. Para incorporar a medula óssea em agarose, lave as amostras fixas em tampão de cacodilato fresco e use uma pipeta plástica para transferir cuidadosamente a medula óssea para um slide de vidro.Usando uma pipeta quente, aplique rapidamente uma gota de ágar líquido de 2% nos cilindros de medula óssea e coloque imediatamente o deslizamento no gelo por um a dois minutos. Quando o ágar se solidificar, use um microscópio estéreo e uma lâmina afiada para descartar as extremidades de cada cilindro de medula óssea e transfira os blocos de medula aparados para um tubo de microcentrifuuge de 1,5 mililitro contendo um mililitro de tampão de cacodilato. Para a incorporação de resina, fixar os blocos com 1%de tetroxida de ósmio em tampão de cacodilato em uma capa química por uma hora a quatro graus Celsius antes de lavar os blocos uma vez com tampão de cacodilato e uma vez com água destilada.Após a lavagem da água, manche os blocos com acetato de 4%uranyl em água destilada por uma hora seguido de duas lavagens em água destilada como demonstrado. Após a última lavagem, desidrate os blocos através de uma série ascendente de imersões de etanol e água destilada como indicado. Para obter uma infiltração uniforme e polimerização da resina epóxi dentro da medula, incubar os blocos em dois banhos sucessivos de óxido de propileno por 15 minutos antes de incubar as amostras em uma mistura de óxido de propileno 100% e resina epóxi por uma hora em um agitador rotativo lento à temperatura ambiente.Ao final da incubação, adicione resina 100% epóxi aos blocos de medula para uma incubação durante a noite sob as mesmas condições e adicione resina de 100% epóxi para outra incubação de duas horas. No final da incubação, use um microscópio para orientar os blocos de medula em moldes planos de silicone para permitir sua secção transversal subsequente e encher os moldes com resina epóxi antes de colocá-los a 60 graus Celsius por 48 horas. Para seção ultra fina, monte o bloco de amostra em um suporte de ultra microtome e monte o suporte no suporte da amostra.Use um cortador de fresagem de diamante para cortar as amostras em um ângulo de 45 graus para remover o excesso de resina ao redor do tecido antes de usar uma lâmina de faca de diamante equipada com um tanque de água para cortar seções transversais de 500 e 100 nanômetros de espessura para análise histológica e TEM, respectivamente, use um laço para transferir as seções de 500 nanômetros de espessura flutuando na superfície da água em um toboágua de vidro e para depositar os 100 nanômetros de espessura. seções em 200 grades de cobre de barra fina de malha com um filtro de papel por baixo. Para coloração azul toluidina, depois de desenhar as seções de 500 nanômetros de espessura em uma placa quente de 60 graus, adicione 1% de azul toluidina filtrado em água destilada às seções para uma incubação de um a dois minutos. No final da incubação, lave as amostras com água destilada.Quando os slides secarem, use o meio de montagem para montar as amostras com um deslizamento de cobertura e visualizar as amostras por microscopia leve. Para coloração de contraste, rotule as seções de 100 nanômetros com acetato de 4% de urânyl por cinco minutos seguido de três lavagens de cinco minutos com água destilada. Após a última lavagem, manche as seções com citrato de chumbo por três minutos, seguidas por três lavagens de cinco minutos em água destilada como demonstrado.Após a última lavagem, coloque o lado inferior de cada grade em contato com um pedaço de papel filtro primeiro para permitir que as grades sejam colocadas no papel do filtro para secar. Para examinar as seções por TEM, quando as grades secarem, selecione uma baixa ampliação para avaliar a qualidade geral dos preparos. Para determinar o número de megacaiócitos de cada estágio de maturação em cada seção transversal, selecione uma ampliação maior e quantifique o número de megacaiócitos estágio I, II ou III apenas em quadrados totalmente cobertos por tecido.Nesta análise histológica representativa, a continuidade da microápcula de compactação e tamanho e forma dos megacaiócitos podem ser claramente observados. Os megacaitos murinos são divididos em quatro estágios de maturação. Os megacaiócitos estágio I têm um grande núcleo.A presença do estágio detectável mais antigo do sistema de membrana de demarcação também é um critério fundamental desta etapa. No estágio II, começa a formação do grânulo e iniciado o desenvolvimento do sistema de membrana de demarcação. Os megacaitos estágio III são células gigantes com sistemas de membrana de demarcação bem desenvolvidos, territórios citoplasmados claramente definidos e zonas periféricas desprovidas de organelas, e núcleos excêntricos localizados.O estágio pirenocito da maturação do megacaito é caracterizado por um núcleo nu. Como ilustrado, megacariócitos são frequentemente observados em contato com células endoteliais. Na ocasião, os megacaitos formam breves saliências invasivas que penetram no endotélio ou estendem proplatelets para o lúmen sinusoidal.O TEM também permite a visualização de detalhes ultraestruturais, bem como a presença de células hematopoiéticas que foram engolidas pelos megacaiócitos. A lavagem da medula óssea deve ser realizada com cuidado e imediatamente após a dissecação óssea. Para maximizar a integridade do tecido, a medula é cercada com um gel de ágar antes da desidratação.Após este procedimento, os blocos de medula óssea podem ser imagens em diferentes ampliações ou podem ser usados para outras análises de microscopia eletrônica 3D, como microscopia eletrônica de feixe de íons focalizado.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

O presente protocolo descreve um novo método para a identificação de uma população de enuclear eritroblastos ortocromaticos pelo fluxo de imagem multi-espectral citometria, proporcionando uma visualização do processo de enucleação dos eritroblastos.

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Combinatória 5 proteínas fluorescentes marcação de células-tronco e progenitoras hematopoiéticas permite in vivo de rastreamento via clonal confocal e microscopia de dois fótons, fornecendo insights sobre medula óssea hematopoiética arquitetura durante a regeneração. Este método permite o mapeamento destino não-invasivo de espectro codificados células hspCs derivados em tecidos intactos por longos períodos de tempo após o transplante.

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Os monócitos são os principais reguladores da imunidade inata e desempenham um papel crítico na renovação do sistema fagocítico mononuclear periférico e em caso de inflamação. Este manuscrito descreve o procedimento de imagem em tempo real da medula óssea da calvária de camundongos para estudar o mecanismo de mobilização de monócitos.

Acompanhando Rato Medula Óssea monócitos<em&gt; In Vivo</em

Detalhamos um protocolo para monitorar o comportamento de neutrófilos e monócitos em veias mesentéricas em estado estacionário e condições inflamatórias usando microscopia confocal intravital em camundongos anestesiados.

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Microscopia de fluorescência intravital (IVFM) da calvária é aplicada em combinação com modelos de animais geneticamente para estudar o homing e enxertia das células hematopoiéticas em nichos de medula óssea (BM).

Combinando a microscopia Intravital fluorescente (IVFM) com modelos genéticos para estudar a dinâmica de enxertia das células hematopoiéticas para nichos de medula óssea

Os monócitos são importantes mediadores de arteriogenesis no contexto da doença arterial periférica. Usando uma membrana basal, como matriz e microscopia intravital, este protocolo investiga monócito homing e relacionados ao tumor angiogênese após injeção de monócitos no modelo murino de ligadura de artéria femoral.

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Nós apresentamos um protocolo para estudar a distribuição das mitocôndria e do retículo endoplasmático em pilhas inteiras após a modificação genética usando a luz correlativa e a microscopia de elétron do volume que incluem a peroxidase 2 do ascorbato e a mancha do peroxidase do rábano, seccionamento serial de células com e sem o gene alvo na mesma seção, e imagens seriadas via microscopia eletrônica.

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Descrevemos aqui o método para imagem de megacaiócitos e proplatelets na medula do osso do crânio de ratos vivos usando microscopia de dois fótons.

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Aqui, apresentamos uma estratégia de imunofenofoteping para a caracterização da diferenciação de megacaitos, e mostramos como essa estratégia permite a classificação de megacaiócitos em diferentes estágios com um classificador celular ativado pela fluorescência. A metodologia pode ser aplicada aos tecidos primários humanos, mas também aos megacaitos gerados na cultura in vitro.

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In situ Exploração de Murine Megacaryopoiesis usando Microscopia eletrônica de transmissão

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