Name: Isolamento de Progenitores de Megacaiócitos de Rato (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 30 s
Description: Aprenda a isolar progenitores de megacariócitos (MEP e MKp) de medula óssea de rato usando depleção magnética e citometria de fluxo. Este protocolo aumenta o rendimento celular e reduz o uso de animais.

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Os autores agradecem Monique Freund, Catherine Ziessel e Ketty pela assistência técnica. Este trabalho foi apoiado pela ARMESA (Association de Recherche et Développement en Médecine et Santé Publique), e por Grant ANR-17-CE14-0001-01 a Henri.de la. Salle.

Os protocolos envolvendo animais foram realizados de acordo com o Comitê de Ética em Experimentos Animais da Universidade de Estrasburgo (Comité Régional d'Ethique en Matière d'Expérimentation Animale Strasbourg. Número de licença: E67-482-10).
1. Coleção de ossos de rato
<ol><li>Sacrifique o animal em conformidade com as diretrizes institucionais. NOTA: Os dados apresentados neste manuscrito foram obtidos de camundongos C57Bl/6 de 8 a 12 semanas de idade. O número de células obtidas, e a frequência das populações citadas podem variar de acordo com a idade e a cepa do rato.</li>
	<li>Pulverize o corpo com 70% de etanol.</li>
	<li>Com a tesoura, faça uma incisão de 0,5-1 cm da pele perpendicular à coluna vertebral e rasgue a pele ao redor de todo o corpo. Puxe a pele da parte inferior do corpo e remova a pele.</li>
	<li>Coloque o animal na almofada de dissecção, de frente para baixo. Localize os ossos pélvicos deslizando os dedos ao longo da coluna exposta de cima para baixo. Para localizar a crista ilíaca, identifique a pequena colisão na região lombar próxima às barras traseiras (região anterosuperiora do osso pélvico). Figura 1A, B apresenta uma representação esquemática da anatomia do rato.</li>
</ol><img alt="Raio-X e diagrama do osso pélvico, fêmur e anatomia da tíbia do camundongo para pesquisa e análise esquelética." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62498/62498fig01.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> Figura 1: Anatomia do rato. (A) Raio-X do rato mostrando os ossos de cetameira. Observe o espaço entre o osso pélvico e a coluna vertebral (seta amarela), onde a tesoura deve ser inserida para separar adequadamente os espinhos traseiros do corpo do mouse (linha pontilhada amarela). (B) Representação esquemática dos ossos de interesse ricos em medula óssea. Os ossos pélvicos são retratados em vermelho, os fêmures em roxo, e as tíbias em verde. (C) Representação esquemática do osso pélvico do camundongo. O ísio corresponde à parte rica em medula do osso pélvico e é destacado em vermelho. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62498/62498fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<ol start="5"><li>Coloque a tesoura paralela à coluna vertebral contra as vértebras e perto da colisão da crista ilíaca. Vá cortar os músculos ao longo da lateral da coluna acima do osso pélvico deslizando a tesoura ao longo das vértebras até a cauda. NOTA: Esta primeira seção de músculos também pode ser realizada usando uma lâmina de bisturi.</li>
	<li>Coloque a tesoura paralela à coluna vertebral e proceda ao corte entre as vértebras e a crista ilíaca, conforme indicado pela linha pontilhada amarela na Figura 1A. Certifique-se de permanecer o mais perto possível das vértebras. Corte os músculos restantes para separar o membro do corpo. NOTA: Deve haver pouca ou nenhuma resistência.</li>
	<li>Repita do outro lado para desprender o segundo membro.</li>
	<li>Transfira os membros em uma superfície limpa e descarte o resto do corpo em conformidade com as diretrizes institucionais.</li>
	<li>Exponha os ossos pélvicos, femorais e tibiais removendo o máximo possível de tecido circundante com os fórceps e os bisturis.</li>
	<li>Desloque cuidadosamente a cabeça femoral do osso pélvico segurando a extremidade distal do fêmur com os fórceps enquanto corta suavemente os músculos ao redor da articulação com os bisturis. Mexa os ossos para facilitar a luxação.</li>
	<li>Raspe o músculo restante do osso pélvico e corte com um bisturi no meio da cavidade que segurou a cabeça do fêmur. O ípio é mantido como rico em progenitores hematopoiéticos, enquanto o lado triangular muito fino do osso é descartado, como mostrado na Figura 1C.</li>
	<li>Remova os tecidos residuais ao redor do ípio com o bisturi e coloque o osso limpo em PBS estéril complementado com 2% de soro de bezerro recém-nascido (PBS-2%NBCS).</li>
	<li>Usando uma tesoura, corte o pé da perna no tornozelo.</li>
	<li>Segure a parte inferior da tíbia com os fórceps e raspe o músculo em direção ao joelho. Descarte a fíbula e corte pelo planalto tibial com o bisturi. Coloque a tíbia em PBS-2%NBCS estérei.</li>
	<li>Remova os tecidos residuais ao redor do fêmur com bisturis.</li>
	<li>Segure o lado superior do fêmur com fórceps; coloque a lâmina do bisturi na base da rótula. Aplique uma força em direção à rótula paralela ao fêmur até o descolamento da rótula. Coloque o fêmur em PBS-2%NBCS estéril. A remoção da rótula proporciona um acesso limpo para a inserção da agulha para a lavagem da medula.</li>
</ol>2. Esgotamento magnético das células positivas da linhagem
<ol><li>Em um armário de fluxo laminar, transfira os ossos em uma placa de Petri estéril cheia de PBS-2% NBCS estéril.</li>
	<li>Com um bisturi cortado na cabeça dos fêmures.</li>
	<li>Encha uma seringa de 1 mL com PBS-2%NBCS e anexe uma agulha de 21 G à tomada.</li>
	<li>Encha um tubo de polipropileno de 5 mL com 2 mL de PBS-2% NBCS estéreis.</li>
	<li>Segure o fêmur com os fórceps; insira suavemente a agulha na ranhura esquerda após a remoção da rótula. Aplique rotação na agulha ao inserir para evitar a conexão da agulha. Certifique-se de que a agulha está completamente inserida no osso até o bisel.</li>
	<li>Transfira o osso com a agulha para o tubo contendo 2 mL de PBS-2%NBCS. Dispense e aspire o PBS-2% NBCS da seringa até que o osso esteja limpo.</li>
	<li>Retire a agulha do fêmur e insira-a no orifício do lado oposto onde estava a cabeça do fêmur. Dispense e aspire novamente o tampão e descarte o osso.</li>
	<li>Para a crista ilíaca e tíbia, segure o osso com os fórceps; insira suavemente a agulha no lado aberto. Aplique rotação na agulha ao inserir para evitar a conexão da agulha. Certifique-se de que a agulha está completamente inserida no osso até o bisel. Transfira o osso com a agulha para o tubo contendo 2 mL de PBS-2%NBCS. Dispense e aspire o PBS-2% NBCS da seringa até que o osso esteja limpo. Descarte os ossos. NOTA: Ossos de até três ratos podem ser colocados no mesmo tubo. Acumule as suspensões de células.</li>
	<li>Passe a suspensão celular agrupada através de uma tampa de filtro de célula de 40 μm colocada em um tubo de poliestireno estéril de 5 mL.</li>
	<li>Vá para a contagem das células. NOTA: A contagem de células pode ser realizada com qualquer hemótmetro, usando o Trypan Blue para avaliação de viabilidade ou com qualquer contador automatizado de células. Um rato normalmente rende 105 ± 7 x 106 células.</li>
	<li>Tire 100 μL da suspensão celular como Medula Óssea Total, adicione 500 μL de PBS-2% NBCS e guarde-o no gelo para o procedimento de coloração.</li>
	<li>Pelota a suspensão filtrada por centrifugação a 400 x g por 5 min a 4 °C e descarte o supernatante. NOTA: Os glóbulos vermelhos podem ser reutilizados ressumando a pelota em solução de lise recém-preparada (1/10 em dH2O). Incubar por 5 minutos até que a suspensão fique clara e vermelha brilhante e adicione 10 volumes de PBS estéreis. Prossiga para lavar as células em PBS-2%NBCS por centrifugação a 400 x g para 5 minutos a 4 °C. Tenha cuidado ao remover o supernatante, pois a pelota celular está muito solta. Realize uma segunda lavagem com PBS-2%NBCS por centrifugação a 400 x g por 5 min a 4 °C e prossiga para a etapa 2.13.</li>
	<li>Resuspend a pelota celular em coquetel de anticorpos primários recém-preparado com uma razão de 100 μL por 1 x 107 células. Incubar no gelo por 30-45 min.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Anticorpo</td>
			<td>Diluição</td>
		</tr>
<tr>
<td>Gr-1-biotina</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
<tr>
<td>B220-biotina</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
<tr>
<td>Mac-1-biotina</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD3-biotina</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD4-biotina</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD5-biotina</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD8-biotina</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
<tr>
<td>TER119-biotina</td>
			<td>1:1000</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD127-biotina</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
</tbody></table>Mesa 1.
<ol start="14"><li>Despocalá-lo 10 μL da suspensão celular em um tubo de poliestireno estéril de 5 mL rotulado fração lin-pos. Adicione 90 μL de PBS-2% NBCS e guarde-o no gelo para o procedimento de coloração.</li>
	<li>Prossiga para lavar as células duas vezes com PBS-2%NBCS estéreis por centrifugação a 400 x g por 5 min a 4 °C. Certifique-se de fazer a última lavagem em um tubo de polipropileno de 5 mL estéril.</li>
	<li>Durante as etapas de lavagem, prepare as contas para o esgotamento magnético.<ol>
<li>Resuspenda as contas no frasco por um vórtice completamente para 30 s.</li>
		<li>Transfira um volume de contas correspondente a duas contas por célula alvo em um tubo de polipropileno de 5 mL.</li>
		<li>Lave as contas duas vezes com PBS-2%NBCS colocando o tubo no ímã e removendo o tampão de lavagem usando uma pipeta pasteur de vidro estéril.</li>
		<li>Resuspenda as contas em 500 μL de PBS-2NBCS estéreis.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Resuspenque a pelota de células rotuladas em 250 μL de contas e misture suavemente por 5 minutos no gelo. Adicione 2 mL de PBS-2%NBCS e misture suavemente. Não agite o tubo.</li>
	<li>Coloque o tubo sobre o ímã por 2 minutos.</li>
	<li>Prosssiga para coletar a fração não magnética com uma pipeta pasteur de vidro estéril e adicioná-la aos 250 μL restantes de contas magnéticas. Sele o tubo com parafilme.</li>
	<li>Coloque o tubo em um rolo de tubo por 20 minutos a 4 °C.</li>
	<li>Adicione 2 mL de PBS-2%NBCS e misture suavemente. Não agite o tubo.</li>
	<li>Coloque o tubo no ímã por 2 minutos.</li>
	<li>Prossiga para coletar a fração não magnética em um tubo de polipropileno de 5 mL estéril rotulado Fração Lin-Neg com uma pipeta pasteur de vidro estéril.</li>
	<li>Pelotar as células por centrifugação a 400 x g por 5 min a 4 °C e remover o sobrenatante.</li>
	<li>Resuspende as células não magnéticas em 500 μL de PBS-2% NBCS estéreis.</li>
	<li>Vá para a contagem das células. NOTA: Um rato normalmente rende 3,9 ± 1,1 x 106 células. A coloração típica de linhagem pré e pós-esgotamento são apresentadas na Figura 2B.</li>
</ol>3. Classificação celular de progenitores de megacaiócitos por citometria de fluxo
<ol><li>Pegue os tubos rotulados de Medula Óssea Total, Fração de Lin-Pos e Fração Lin-Neg.</li>
	<li>Prossiga para dividir o conteúdo do tubo Total Medula Óssea igualmente em seis tubos estéreis de 5 mL de poliestireno. Rotule os tubos com os números 1-6.</li>
	<li>Proceda para rotular o tubo Fração Lin-Pos com o número 7.</li>
	<li>Prossiga para dividir o conteúdo do tubo Fração Lin-Neg da seguinte forma.<ol>
<li>Transfira 50 μL para um tubo de poliestireno estéril de 5 mL contendo 250 μL de PBS-2%NBCS estéreis. Em seguida, divida seu conteúdo igualmente em tubos de poliestireno de 5 mL estéreis. Rotule esses tubos com os números 8-10.</li>
		<li>Os 450 μL restantes da suspensão celular da Fração Lin-Neg correspondem ao tubo com o número 11.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Adicione os anticorpos aos tubos conforme descrito na Tabela 2.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Tubo</td>
			<td>Etiqueta</td>
			<td>Coquetel de anticorpos</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">Medula Óssea Total</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>Controle não manchado</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>Controle único manchado</td>
			<td>CD45-FITC (1/200)</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>Controle único manchado</td>
			<td>CD45-PE (1/200)</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>Controle único manchado</td>
			<td>TER119-APC (1/200)</td>
		</tr>
<tr>
<td>5</td>
			<td>Controle único manchado</td>
			<td>CD45-PECy7 (1/200)</td>
		</tr>
<tr>
<td>6</td>
			<td>Controle único manchado</td>
			<td>Biotina CD45-APC-Cy7 (1/200)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">Fração de Lin-Pos</td>
		</tr>
<tr>
<td>7</td>
			<td>Controle único manchado</td>
			<td>Controle único manchado. Streptavidin-APC-Cy7 (1/500)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">Fração Lin-Neg</td>
		</tr>
<tr>
<td>8</td>
			<td>Controle FMO FITC</td>
			<td>c-kit-APC (1/200) + Sca-1-PE (1/200) + CD16/32-PE (1/200) + CD150-PECy7 (1/200) + Streptavidin-APC-Cy7 (1/500)</td>
		</tr>
<tr>
<td>9</td>
			<td>Controle do FMO PE</td>
			<td>CD9-FITC (1/200) + c-kit-APC (1/200) + CD150-PECy7 (1/200) + Streptavidin-APC-Cy7 (1/500)</td>
		</tr>
<tr>
<td>10</td>
			<td>Controle FMO PECy7</td>
			<td>CD9-FITC (1/200) + c-kit-APC (1/200) + Sca-1-PE (1/200) + CD16/32-PE (1/200) + Streptavidin-APC-Cy7 (1/500)</td>
		</tr>
<tr>
<td>11</td>
			<td>Tubo positivo para classificação</td>
			<td>CD9-FITC (1/200) + c-kit-APC (1/200) + Sca-1-PE (1/200) + CD16/32-PE (1/200) + CD150-PECy7 (1/200) + Streptavidin-APC-Cy7 (1/500)</td>
		</tr>
</tbody></table>Mesa 2.
<ol start="6"><li>Incubar no gelo por 30-45 min no escuro.</li>
	<li>Lave as células com PBS-2%NBCS estéreis por centrifugação a 400 x g por 5 min a 4 °C.</li>
	<li>Resuspende as pelotas de células da seguinte forma.<ol>
<li>Para os tubos de 1 a 10, resuspenque a pelota em 300 μL de PBS-2%NBCS estéril complementado com 7AAD (2,5 μg/mL final) (PBS-7AAD). ATENÇÃO: 7AAD é um intercalante de DNA e, portanto, deve ser manuseado com EPI (luvas) apropriados.</li>
		<li>Para tubo 11, resuspenque a pelota em PBS-7AAD estéril a uma concentração máxima de 5 x 106 células por mL e um volume mínimo de 1 mL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prepare dois tubos de coleta de polipropileno rotulados MEP e MKp contendo 2 mL de PBS-2%NBCS. NOTA: Alternativamente, as células podem ser coletadas em cultura média ou tampão de lise celular, dependendo da aplicação subsequente para as células classificadas. O uso de tubos de poliestireno não é recomendado devido a possível interferência com as gotículas carregadas que contêm as células de interesse.</li>
	<li>Mantenha todos os tubos no gelo no escuro.</li>
	<li>Vá para a configuração do classificador de células.<ol>
<li>Use os tubos 1-7 para configurar tensão e compensação, tubos 7-10 para determinar os portões de classificação para as populações celulares de interesse e tubo 11 para triagem celular.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Os primeiros passos da estratégia de gating visam excluir doublets e células mortas da análise, conforme descrito na Figura 3. Identifique células viáveis únicas e exiba o gráfico de pontos SSC-vs Lin-APC-Cy7 para confirmar a eficiência do esgotamento da linhagem. A partir do Lin- células um portão é definido para selecionar células positivas para c-kit e negativa ou fraca para Sca-1 e CD16/32. Um gráfico de ponto de expressão CD9 vs CD150 para as células selecionadas permite a identificação de quatro populações. NOTA: As células MEP e MKp são positivas para CD150. Três níveis de expressão para CD9 podem ser definidos (neg, dim e alto). MKp expressam alto nível de CD9 e MEP express CD9 em um nível intermediário de intensidade de fluorescência. A população de MEP corresponde a Lin- c-Kit+ Sca-1-CD16/32-/dim CD150+ POPULAÇÃO CD9dim e MKp corresponde a Lin- c-Kit+ Sca-1-CD16/32-/dim CD150+ CD9dim eCD9 brilhante . A discriminação entre as populações de cd9 alta e CD9 dim para as células positivas CD150 é definida com base no nível máximo de expressão CD9 na população negativa cd150. Um mouse normalmente rende 5,3 ± 0,6 x 103 MKp e 27,2 ± 2,4 x 103 MEP.</li>
</ol>

<ol><li>Kaushansky, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Historical+review%3A+megakaryopoiesis+and+thrombopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Historical review: megakaryopoiesis and thrombopoiesis.</a> Blood. 111 (3), 981-986 (2008).</li>
<li>Akashi, K., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+clonogenic+common+myeloid+progenitor+that+gives+rise+to+all+myeloid+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A clonogenic common myeloid progenitor that gives rise to all myeloid lineages.</a> Nature. 404 (6774), 193-197 (2000).</li>
<li>Debili, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+bipotent+erythro-megakaryocytic+progenitor+in+human+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Characterization of a bipotent erythro-megakaryocytic progenitor in human bone marrow.</a> Blood. 88 (4), 1284-1296 (1996).</li>
<li>Forsberg, E. C., Serwold, T., Kogan, S., Weissman, I. L., Passegué, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+evidence+supporting+megakaryocyte-erythrocyte+potential+of+flk2%2Fflt3%2B+multipotent+hematopoietic+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">New evidence supporting megakaryocyte-erythrocyte potential of flk2/flt3+ multipotent hematopoietic progenitors.</a> Cell. 126 (2), 415-426 (2006).</li>
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<li>Haas, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation-driven+fast-track+differentiation+of+HSCs+into+the+megakaryocytic+lineage%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Hematology%22%5BJournal%5D)">Inflammation-driven fast-track differentiation of HSCs into the megakaryocytic lineage.</a> Experimental Hematology. 42 (8), 14(2014).</li>
<li>Shin, J. Y., Hu, W., Naramura, M., Park, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+c-Kit+expression+identifies+hematopoietic+stem+cells+with+impaired+self-renewal+and+megakaryocytic+bias%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">High c-Kit expression identifies hematopoietic stem cells with impaired self-renewal and megakaryocytic bias.</a> The Journal of Experimental Medicine. 211 (2), 217-231 (2014).</li>
</ol>

Os autores não declaram interesses financeiros concorrentes.

O método descrito neste artigo permite a extração e purificação do mouse MEP e MKp. Um parâmetro importante na otimização do protocolo foi a obtenção de número suficiente de células compatíveis com a maioria dos ensaios moleculares e celulares. A prática geral da coleta de ossos de camundongos para extração de células hematopoiéticas geralmente consiste na colheita dos fêmures e tíbias de cada rato. O osso pélvico, outra fonte de material hematopoiético, é, portanto, muitas vezes negligenciado. As razões para não coletar...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/t/62498">Isolation of Mouse Megakaryocyte Progenitors</a>. A figure was updated.
Figure 2 was updated from:
<img alt="Hematopoietic cell separation diagram with flow cytometry result, showing Lin+ and Lin- fractions." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62498/62498fig02.jpg" data-altupdatedat="1761830439000" data-alt="Figure 2"> 
Figure 2: Magnetic depletion of lineage committed (Lin) cells. (A) Schematic representation of the magnetic depletion protocol. First, unsorted bone marrow cells are labeled with the biotin-conjugated rat anti-mouse antibody cocktail. Cells are then incubated with anti-rat Ig coated magnetic beads and subsequently subjected to the magnetic depletion using a strong magnet. The magnet will retain the labeled magnetic Lin+ fraction against the tube walls, while the unlabeled non-magnetic Lin- negative fraction will be collected in a new tube. (B) Lineage committed cells can be identified using fluorescent conjugated streptavidin. Typical analysis of the lineage expression in cells prior to magnetic depletion (total bone marrow) and after magnetic depletion (Lin- Fraction) N = 21. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62498/62498fig02large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
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<img alt="Hematopoietic cell separation process diagram with antibody labeling and magnet use, flow cytometry results." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62498/62498fig2v2.jpg" data-altupdatedat="1761830439000" data-alt="Figure 2"> 
Figure 2: Magnetic depletion of lineage committed (Lin) cells. (A) Schematic representation of the magnetic depletion protocol. First, unsorted bone marrow cells are labeled with the biotin-conjugated rat anti-mouse antibody cocktail. Cells are then incubated with anti-rat Ig coated magnetic beads and subsequently subjected to the magnetic depletion using a strong magnet. The magnet will retain the labeled magnetic Lin+ fraction against the tube walls, while the unlabeled non-magnetic Lin- negative fraction will be collected in a new tube. (B) Lineage committed cells can be identified using fluorescent conjugated streptavidin. Typical analysis of the lineage expression in cells prior to magnetic depletion (total bone marrow) and after magnetic depletion (Lin- Fraction) N = 21. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62498/62498fig2v2large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62498">Isolation of Mouse Megakaryocyte Progenitors</a>. A figure was updated.

Erratum: Isolation of Mouse Megakaryocyte Progenitors

Plaquetas de sangue são produzidas por megacariócitos. Estas grandes células poliploides estão localizadas na medula óssea e, como em todas as células sanguíneas, elas são derivadas de Células-Tronco Hematopoiéticas (HSC)1. O caminho clássico de produção de megacaiócitos na medula óssea tem origem no HSC e envolve a geração de diferentes progenitores que restringem progressivamente seu potencial de diferenciação2. O primeiro progenitor a assinar o compromisso com a linhagem megacariocítica é o Progenitor megacarito-eritrócito (MEP), um progenitor bipotente capaz de produzir células eritrógradas e megacariócitos3,4,5. O MEP então produz um progenitor/precursor unipotente (MKp) que se diferenciará em um megacaiócito maduro capaz de produzir plaquetas. Os mecanismos envolvidos na geração desses progenitores, bem como sua diferenciação e maturação em megacaitos são complexos e apenas parcialmente compreendidos. Além disso, ainda não está clara a heterogeneidade da população do MEP em termos de potencial de diferenciação e de comprometimento intrínseco dessas células. Para decifrar esses processos, é essencial obter (ou ter acesso) a populações purificadas de MEP e MKp para análises moleculares e celulares únicas.
Vários estudos demonstraram combinações particulares de marcadores de superfície celular para a identificação de progenitores comprometidos com a linhagem megacariocítica no mouse6,7,8. A partir destes, foi elaborado um método que permite a purificação de MEP e MKp de camundongos. Este método foi otimizado para a obtenção de células em número e qualidade adequados para um grande número de ensaios. Com considerações éticas em mente, e a fim de minimizar o número de animais envolvidos nos experimentos, nós provocamos para colher a medula óssea do fêmur e tíbia, e também da crista ilíaca. Este osso contém uma alta frequência e número de progenitores hematopoiéticos e é a maior parte do tempo danificado durante a longa colheita óssea. Apresentado aqui é um método detalhado para a coleta confiável deste osso.
O segundo critério de otimização é produzir populações celulares altamente purificadas. A Classificação celular ativada fluorescente (FACS) é um método de escolha para obter populações purificadas de células de interesse. No entanto, os baixos rendimentos são alcançados quando a população celular de interesse é muito rara. Assim, são necessários procedimentos de enriquecimento. Neste protocolo, optou-se por um procedimento de seleção negativa usando contas magnéticas.

<table><tbody><tr><td>agulhas de calibre 21</td><td>BD Microlance</td><td>301155</td><td></td></tr><tr><td>7AAD</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9400</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo Gr-1-biotina</td><td>eBioscience</td><td>13-5931-85</td><td>Depleção magnética</td></tr><tr><td>Anticorpo B220-biotina</td><td>eBioscience</td><td>13-0452-85</td><td>Depleção magnética</td></tr><tr><td>Anticorpo Mac-1-biotina</td><td>eBioscience</td><td>13-0112-85</td><td>Magnético depleção</td></tr><tr><td>Anticorpo CD3e-biotina</td><td>eBioscience</td><td>13-0031-85</td><td>Depleção magnética</td></tr><tr><td>Anticorpo CD4-biotina</td><td>eBioscience</td><td>13-9766-82</td><td>Depleção magnética</td></tr><tr><td>Anticorpo CD5-biotina</td><td>eBioscience</td><td>13-0051-85</td><td>Depleção magnética</td></tr><tr><td>Anticorpo CD8a-biotina</td><td>eBioscience</td><td>13-0081-85</td><td>Anticorpo de depleção magnética</td></tr><tr><td> TER119-biotina</td><td>eBioscience</td><td>13-5921-85</td><td>Anticorpo de depleção magnética</td></tr><tr><td>CD127-biotina</td><td>eBioscience</td><td>13-1271-85</td><td>Anticorpo de depleção magnética</td></tr><tr><td>CD45-FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-0451-85</td><td>Anticorpo de classificação de células</td></tr><tr><td>CD45-PE</td><td>eBioscience</td><td>12-0451-83</td><td>Anticorpo de classificação de células</td></tr><tr><td>TER119-APC</td><td>eBioscience</td><td>17-5921-83</td><td>Classificação de células</td></tr><tr><td>Anticorpo CD45-PECy7</td><td>eBioscience</td><td>25-0451-82</td><td>Anticorpo de classificação de células</td></tr><tr><td>CD45-biotina</td><td>eBioscience</td><td>13-0451-85</td><td>Anticorpo de classificação de células</td></tr><tr><td>CD9-FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-0091-82</td><td>Anticorpo de classificação de células</td></tr><tr><td>&nbsp; c-kit-APC</td><td>eBioscience</td><td>17-1171-83</td><td>Anticorpo de classificação de células</td></tr><tr><td>Sca-1-PE</td><td>eBioscience</td><td>12-5981-83</td><td>Anticorpo de classificação de células</td></tr><tr><td>CD16 / 32-PE</td><td>eBioscience</td><td>12-0161-83</td><td>Anticorpo de classificação de células</td></tr><tr><td>CD150-PECy7</td><td>eBioscience</td><td>25-1502-82</td><td>Classificação de células</td></tr><tr><td>Meio de cultura StemSpan-SFEM</td><td>Stemcell technologies</td><td>#09650</td><td></td></tr><tr><td>Almofada de dissecção</td><td>Fisher Scientific</td><td>10452395</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>vWR Chemicals</td><td>83813.360</td><td></td></tr><tr><td>Fórceps</td><td>Euronexia</td><td>P-120-AS</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta de pasteur de vidro</td><td>Dutscher</td><td>42011</td><td></td></tr><tr><td>Ímã :&nbsp; DynaMag-5</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12303D</td><td></td></tr><tr><td>Contas magnéticas: Dynabeads Sheep Anti-Rat IgG</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11035</td><td></td></tr><tr><td>Megacult</td><td>Stemcell technologies</td><td>#04970</td><td></td></tr><tr><td>MethoCult SF M3436</td><td>Stemcell technologies</td><td>#03436</td><td></td></tr><tr><td>Newborn Calf Serum</td><td>Dutscher</td><td>50750-500</td><td></td></tr><tr><td>Red Cell Lysis solução</td><td>BD Bioscience</td><td>555899</td><td></td></tr><tr><td>Bisturis</td><td>Fisher Scientific 12308009</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tesoura</td><td>Euronexia</td><td>C-165-ASB</td><td></td></tr><tr><td>Seringas estéreis de 1 mL</td><td>BD Bioscience</td><td>303172</td><td></td></tr><tr><td>Tubos estéreis de 15mL</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.502</td><td></td></tr><tr><td>Tubos estéreis de polipropileno de 5mL</td><td>Falcon</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>Tubos estéreis de poliestireno 5mL</td><td>Falcon</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>Tubos estéreis com 70&micro; tampão do filtro da pilha de m</td><td>Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>placa de Petri estéril</td><td>Falcon</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin-APC-Cy7</td><td>BD Biosciences</td><td>554063</td><td>Cell sorting</td></tr><tr><td>Rolo do tubo</td><td>Benchmark Scientific</td><td>R3005</td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento de progenitores de megacaiócitos de rato

Isolation of Mouse Megakaryocyte Progenitors

Megacariócitos de medula óssea são grandes células poliploides que garantem a produção de plaquetas sanguíneas. Elas surgem de células-tronco hematopoiéticas através de megacaripoiesis. As etapas finais deste processo são complexas e classicamente envolvem os progenitores megacariócitos bipotentes -Eritrócitos (MEP) e os progenitores megacayócitos unipotentes (MKp). Essas populações precedem a formação de megacaiócitos de boa fé e, como tal, seu isolamento e caracterização poderiam permitir a análise robusta e imparcial da formação de megacaiócitos. Este protocolo apresenta em detalhes o procedimento para coletar células hematopoiéticas da medula óssea do rato, o enriquecimento de progenitores hematopoiéticos através do esgotamento magnético e, finalmente, uma estratégia de classificação celular que produz populações altamente purificadas de MEP e MKp. Primeiro, as células de medula óssea são coletadas do fêmur, da tíbia, e também da crista ilíaca, um osso que contém um alto número de progenitores hematopoiéticos. O uso de ossos de crista ilíaca aumenta drasticamente o número total de células obtidas por camundongo e, portanto, contribui para um uso mais ético dos animais. Um esgotamento da linhagem magnética foi otimizado usando contas magnéticas de 450 nm permitindo uma classificação celular muito eficiente por citometria de fluxo. Por fim, o protocolo apresenta a estratégia de rotulagem e gating para a classificação das duas populações progenitoras megacarióficas altamente purificadas: MEP (Lin-Sca-1-c-Kit+CD16/32-CD150+CD9dim) e MKp (Lin- Sca-1-c-Kit+CD16/32-CD150+CD9bright ). Esta técnica é fácil de implementar e fornece material celular suficiente para realizar i) caracterização molecular para um conhecimento mais profundo de sua identidade e biologia, ii) ensaios de diferenciação in vitro, que proporcionarão uma melhor compreensão dos mecanismos de maturação de megacaiócitos, ou iii) modelos in vitro de interação com seu microambiente.

A análise fenotípica das células identificadas como MEP e MKp foram realizadas por citometria de fluxo. As células foram rotuladas com anticorpos conjugados de fluorescência para CD41a e CD42c, marcadores clássicos das linhagens megacariocíticas e plaquetas. Ambos os marcadores foram expressos pelas células da população de MKp, enquanto esses marcadores ainda não foram detectados na superfície das células da população do MEP(Figura 4Ai,4Aii). Poliploidia é uma marca registra...

Este método descreve a purificação por citometria de fluxo de MEP e MKp de fêmures, tíbias e ossos pélvicos.

Isolamento de Progenitores de Megacaiócitos de Rato

Bone marrow megakaryocytes are large polyploid cells that ensure the production of blood platelets. They arise from hematopoietic stem cells through ...

O isolamento das principais populações progenitoras de Megacaitos, permite a análise fina da hierarquia de linhagem na cultura celular em ensaios moleculares, até o nível celular único. Este protocolo combina uma prática mais ética, minimizando o número de animais necessários, em um processo eficiente para a triagem celular das populações de MEP e MKP. Para osso, a coleta pulveriza o corpo de um rato C57 preto C57 de oito a 12 semanas, com 70% de etanol.Use uma tesoura para fazer uma incisão de cinco a um centímetro da pele, perpendicular à coluna. E rasgar a pele ao redor de todo o corpo, puxando-a para baixo. Coloque o mouse de frente para baixo na almofada de dissecção e localize os ossos pélvicos deslizando dedos ou tesouras, ao longo da coluna exposta, de cima a baixo.Para localizar a crista ilíaca, identifique a pequena colisão na região lombar perto dos membros traseiros. Depois de colocar a tesoura paralela à coluna vertebral, contra as vértebras, e perto da colisão da crista ilíaca, proceda ao corte dos músculos ao longo da lateral da coluna acima do osso pélvico, deslizando a tesoura ao longo das vértebras, até a cauda. Em seguida, corte entre as vértebras e a crista ilíaca, ficando o mais perto possível das vértebras.E corte os músculos restantes para separar o membro do corpo. Transfira os membros separados para uma superfície limpa. Depois de descartar o resto do corpo em conformidade com as diretrizes institucionais, use fórceps e bisturis para expor os ossos pélvicos, femorais e tibiais, removendo tecido circundante.Use fórceps para segurar a extremidade distal do fêmur, e deslocar cuidadosamente a cabeça femoral do osso pélvico, cortando suavemente os músculos ao redor da articulação com um bisturi. Raspe o músculo restante do osso pélvico, e corte no meio da cavidade que segurou a cabeça femoral. Mantenha o ípio e descarte o lado fino triangular do osso.Usando um bisturi, remova os tecidos residuais ao redor do ílio, e coloque o osso limpo em PBS estéril complementado com soro de bezerro recém-nascido de 2%. Em seguida, use uma tesoura para cortar o pé da perna no tornozelo. Segurando a parte inferior da tíbia com os fórceps, raspe o músculo em direção ao joelho.Descarte a fíbula. Em seguida, faça um corte através do planalto tibial com o bisturi, e coloque a tíbia em PBS estéril 2%NBCS. Depois de remover os tecidos residuais ao redor do fêmur, segure a parte superior do fêmur com fórceps, e coloque a lâmina do bisturi na base da rótula.Aplique uma força em direção à rótula, paralelamente ao fêmur para desprender a rótula. Em seguida, coloque o fêmur, em PBS estéril 2%NBCS. Em um armário de fluxo laminar, transfira os ossos para uma placa de Petri estéril cheia de PBS estéril 2%NBCS.Use um bisturi para cortar a cabeça dos fêmures. Encha uma seringa de um mililitro com PBS 2% NBCS estéril, e conecte uma agulha calibre 21, à tomada. Em seguida, encha um tubo de polipropileno de cinco mililitros com dois mililitros de PBS estéril 2%NBCS.Segurando o fêmur com fórceps, insira a agulha na ranhura esquerda, após a remoção da rótula, aplicando rotação, garantindo que a agulha esteja completamente inserida no osso, até o bisel. Após a inserção da agulha, transfira o osso com a agulha para o tubo contendo dois mililitros de PBS 2%NBCS. Em seguida, dispense e aspire o PBS 2%NBCS, da seringa até que o osso esteja limpo.Retire a agulha do fêmur e insira-a no orifício do lado oposto, onde estava a cabeça do fêmur. Depois de dispensar e aspirar o tampão, descarte o osso. Para a crista ilíaca e a tíbia, use fórceps para segurar o osso e insira delicadamente a agulha no lado aberto, aplicando rotação.Assegurando que a agulha esteja completamente inserida no osso, até o bisel. Em seguida, transfira o osso com a agulha para o tubo contendo dois mililitros de PBS 2%NBCS. Dispense e aspire o PBS 2% NBCS da seringa até que o osso esteja limpo.Passe toda a suspensão celular através de uma tampa de coador de células de 40 mícrons, colocada em um tubo de poliestireno de cinco mililitros estéril, e adicione 500 microliters de PBS 2%NBCS. Reserve 100 microlitres da suspensão celular como medula óssea total. Em seguida, armazene-o no gelo para o procedimento de coloração.Pelota a suspensão filtrada por centrifugação. Depois de descartar o supernaspe, resuspenque a pelota em um coquetel de anticorpos primários recém-preparado, com a incubação no gelo, por 30 a 45 minutos. Reserve 10 microliters da suspensão celular em um tubo de poliestireno de cinco mililitros estéreis, rotulado fração de poros lin, e adicione 90 microliters de PBS 2%NBCS.Enquanto isso, prepare uma conta para esgotamento magnético, ressusundo-as no frasco, com vórtice completo por 30 segundos. Transfira um volume de contas correspondente a duas contas por célula alvo, em um tubo de polipropileno de cinco mililitros, e lave as contas duas vezes, com PBS 2%NBCS, colocando tubo no ímã. Depois de remover o tampão de lavagem com uma pipeta de pasteur de vidro estéril, resuspenque as contas em 500 microliters de PBS estéril 2%NBCS.Para o primeiro passo de esgotamento magnético, adicione 250 microliters de contas na pelota de células lavadas, e incubar com mistura suave por cinco minutos no gelo. Em seguida, adicione dois mililitros de PBS 2%NBCS estéreis, com mistura suave, e coloque o tubo no ímã por dois minutos. Prossiga para coletar a fração não magnética com uma pipeta de pasta de vidro estéril.E para o segundo passo do esgotamento magnético, adicione-o aos 250 microliters restantes de contas magnéticas. Coloque o tubo selado com parafina em um rolo de tubo, por 20 minutos a quatro graus Celsius. Em seguida, adicione dois mililitros de PBS 2%NBCS estéreis com mistura suave.E coloque o tubo com o ímã por dois minutos. Colete a fração não magnética em um tubo de polipropileno de cinco mililitros estéreis, rotulado, não magnético Fração Lin Neg, com uma pipeta de pastreur de vidro estéril, e prossiga com progenitores de megacariócitos de triagem celular, como descrito no manuscrito do texto. Para a estratégia de gating para classificação celular, na população de Lin Neg, são selecionadas as células que expressam c-kit, e uma expressão baixa ou nenhuma de antígeno Sca-1 ou CD16/32.Nessa população, o MEP é identificado como células cd150 positivas e CD9 dim. O MKP como CD150 positivo, e células brilhantes CD9. Na análise representativa da Citometria de Fluxo, as células identificadas como MPE e Mkp, foram rotuladas com anticorpos conjugados de fluorescência para CD41a, e marcadores clássicos CD42c, das linhagens megacariocíticas e plaquetas.Ambos os marcadores foram expressos pelas células da população de MKp, e não foram detectados na superfície das células da população do MEP. O conteúdo de DNA dos megacaiócitos classificados, demonstrou que as células são em sua maioria 2n para a população do MEP. E uma pequena parte das células MKp são estrangeiras.Células ploidy mais elevadas não foram significativamente detectadas nessas populações. Em ensaios clonogênicos semissólidos, a CFU-MK foi detectada em populações de MEP e MKp. O BFU-E não foi detectado na população de MKp, mas detectado no MEP e, na população de células progenitoras CD150 negativas CD9 dim.A observação microscópica no terceiro dia de diferenciação, mostra que o MEP e o MKp produziram principalmente megacaiócitos, identificados como células grandes. Os megacariócitos obtidos após três dias de cultura, foram identificados por meio da expressão CD41 e CD42c, representando 54, e 82% das células produzidas a partir de populações de células MEP e MKp, respectivamente. A ploidia dos megacaitos produzidos, foi maior a partir do megacaito derivado da população MKp, comparando-o com a população do MPE.Apenas as células derivadas da população de MKp, eram capazes de emissão de proplatelet, sugerindo um estágio de maturação mais avançado para a população de MKp. O uso do osso pélvico aumenta drasticamente para o número de células, enquanto o esgotamento magnético de duas etapas melhora a eficácia do esgotamento da linhagem. Este protocolo permite a cultura subsequente da população de células únicas e mep e MKp, que, juntamente com a análise transcriômica e proteômica, certamente terá de decifrar os mecanismos envolvidos, implementadas biogênese.

isolation-of-mouse-megakaryocyte-progenitors

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Método para a dissociação enzimática, rotulagem superfície e purificação por citometria de fluxo de fibro / adipogénicos e progenitores miogênica de músculo esquelético murino.

Purificação de Progenitores do músculo esquelético

Um método para analisar a distribuição de células progenitoras hematopoiéticas da medula óssea em citometria de fluxo, bem como para isolar eficazmente altamente purificados de células estaminais hematopoiéticas (HSCs) é descrito. O processo de isolamento é essencialmente baseado no enriquecimento de células magnética c-kit + e classificação celular para purificar HSCs para estudos celulares e moleculares.

Análise fenotípica e Isolamento de Células-Tronco Hematopoéticas Murino e Lineage comprometidos Progenitores

Aqui apresentamos um protocolo que gera grandes quantidades de monócitos murinos a partir de medula óssea heterogênea para aplicações translacionais. Em comparação com outros, esse novo método ajuda a reduzir o número de animais sacrificados e reduz os custos, evitando métodos caros, como a separação de células magnéticas de alto gradiente (MACS).

Isolamento e injecção intravenosa de Murino de Medula Óssea Derivado monócitos

células-tronco e progenitoras hematopoiéticas (HSPC) derivam de células endoteliais especializadas (hegemônicos) durante o desenvolvimento, mas pouco se sabe sobre o processo pelo qual algumas células endoteliais especificar a tornar-se sangue formando. Nós demonstramos um método baseado citometria de fluxo que permite o isolamento de células endoteliais em simultâneo hegemônicos e HSPC de tecidos embrionários de murídeo.

Isolamento de células embrionárias de murino hegemônicos endoteliais

Aqui descrevemos um protocolo otimizado e altamente reprodutível para isolar células progenitoras mesodérmicas (MPCs) da medula óssea humana (hBM). As MPCs foram caracterizadas por citometria de fluxo e expressão de nestina. Eles mostraram a capacidade de dar origem a culturas de células semelhantes a MSC de crescimento exponencial, mantendo seu potencial angiogênico.

Isolamento de células progenitoras Mesangiogenic (PPM) de humano Medula Óssea

Descrevemos o isolamento de Fima de oligodendrócitos mouse principal, que permite o isolamento das células para cultura em vitro rápido e específico.

Isolamento de Fima rápida e específica de oligodendrócitos primário de Mouse

Demonstramos como identificar e isolar 6 subconjuntos de progenitores mieloides de murino medula óssea usando uma combinação de magnética e fluorescência classificação (MACS e FACS). Este protocolo pode ser usado para ensaios em vitro cultura (culturas metilcelulose ou líquido), na vivo experiências de transferência adotiva e análises de RNA/proteína.

Identificação e isolamento de oligopotentes e confirmada por linhagem mieloides progenitores da medula óssea de rato

Aqui, detalhamos o método de explanta da medula óssea, desde a preparação da amostra até a análise de slides microscópicas, para avaliar a capacidade de megacaiócitos que se diferenciaram em seu ambiente fisiológico para formar proplatelets.

Dinâmica de formação de propulato de plantas de medula óssea fresca

Reconhece-se agora que o ambiente tridimensional das células pode desempenhar um papel importante em seu comportamento, maturação e/ou diferenciação. Este protocolo descreve um modelo de cultura celular tridimensional projetado para estudar o impacto da contenção física e restrições mecânicas em megacaiócitos.

Cultura de megacariócito em hidrogel baseado em metilcelulose 3D para melhorar a maturação celular e estudar o impacto da rigidez e confinamento

Aqui, apresentamos um protocolo para isolar e purificar a microglia primária em modelos animais de doenças desmielinizantes, utilizando a triagem celular ativada por colunas magnéticas.

Isolamento da Microglia Primária do Rato por Triagem celular ativada por magnético em modelos animais de desmielinização

Este estudo estabeleceu um método estável e eficiente para o isolamento, cultura e determinação funcional de células-tronco CD34+ residentes na parede vascular (CD34+ VW-SCs). Este método de isolamento fácil de seguir e eficaz em termos de tempo pode ser utilizado por outros investigadores para estudar os mecanismos potenciais envolvidos nas doenças cardiovasculares.

Isolamento imunomagnético das células-tronco CD34+ residentes na parede vascular de camundongos

Aprenda a isolar progenitores de megacariócitos (MEP e MKp) de medula óssea de rato usando depleção magnética e citometria de fluxo. Este protocolo aumenta o rendimento celular e reduz o uso de animais.

Isolamento de Progenitores de Megacaiócitos de Rato

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