Name: Cultura de megacariócito em hidrogel baseado em metilcelulose 3D para melhorar a maturação celular e estudar o impacto da rigidez e confinamento (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-26T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 53 s
Description: Aprenda a cultivar megacariócitos em hidrogel de metilcelulose 3D para estudar rigidez e confinamento mecânico. Este método melhora a maturação celular e a formação de proplaquetas em células-tronco hematopoéticas de camundongo.

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Os autores gostariam de agradecer a Fabien Pertuy e Alicia Aguilar que inicialmente desenvolveram essa técnica no laboratório, bem como Dominique Collin (Institut Charles Sadron - Estrasburgo) que caracterizaram as propriedades viscoelasticas do hidrogel de metilcelulose. Este trabalho foi apoiado pela ARMESA (Association de Recherche et Développement en Médecine et Santé Publique) e por uma bolsa ARN (ANR-18-CE14-0037 PlatForMechanics). Julie Boscher é beneficiária da Fondation pour la Recherche Médicale (número de subvenção da FRM FDT202012010422).

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<li>Wang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+Stiffness+Modulates+Patient-Derived+Glioblastoma+Cell+Fates+in+Three-Dimensional+Hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+A%22%5BJournal%5D)">Matrix Stiffness Modulates Patient-Derived Glioblastoma Cell Fates in Three-Dimensional Hydrogels.</a> Tissue Engineering Part A. , (2020).</li>
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<li>Leiva, O., Leon, C., Kah Ng, S., Mangin, P., Gachet, C., Ravid, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+extracellular+matrix+stiffness+in+megakaryocyte+and+platelet+development+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Hematology%22%5BJournal%5D)">The role of extracellular matrix stiffness in megakaryocyte and platelet development and function.</a> American Journal of Hematology. 93 (3), 430-441 (2018).</li>
<li>Jansen, L. E., Birch, N. P., Schiffman, J. D., Crosby, A. J., Peyton, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanics+of+intact+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Mechanical+Behavior+of+Biomedical+Materials%22%5BJournal%5D)">Mechanics of intact bone marrow.</a> Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 50, 299-307 (2015).</li>
<li>Eckly, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abnormal+megakaryocyte+morphology+and+proplatelet+formation+in+mice+with+megakaryocyte-restricted+MYH9+inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Abnormal megakaryocyte morphology and proplatelet formation in mice with megakaryocyte-restricted MYH9 inactivation.</a> Blood. 113 (14), 3182-3189 (2009).</li>
<li>Eckly, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proplatelet+formation+deficit+and+megakaryocyte+death+contribute+to+thrombocytopenia+in+Myh9+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">Proplatelet formation deficit and megakaryocyte death contribute to thrombocytopenia in Myh9 knockout mice.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 8 (10), 2243-2251 (2010).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Na década anterior, a mecanobiologia tem levantado cada vez mais interesse em muitas áreas da biologia. É comumente reconhecido que o ambiente mecânico ao redor das células desempenha um papel em seu comportamento, enfatizando a importância de estudar como os megacaiócitos sentem e respondem a sinais mecânicos extracelulares. É desafiador medir com precisão a rigidez do tecido da medula óssea no situ11, especialmente se considerarmos a medula vermelha hematopoiética, pois está localizada ...

As células do corpo experimentam um complexo microambiente 3D e são submetidas à interação entre pistas químicas e mecanofísicas, incluindo rigidez do tecido e confinamento devido às células vizinhas e matriz circundante 1,2,3. A importância da rigidez e confinamento para o comportamento celular só foi reconhecida nas últimas décadas. Em 2006, o trabalho seminal da Engler et al. 4 destacou a importância do ambiente mecânico para a diferenciação celular. Os autores demonstraram que a variação da rigidez do substrato celular resultou na orientação das células-tronco para várias linhagens de diferenciação. Desde então, o impacto das pistas mecânicas sobre o destino e o comportamento celular tornou-se cada vez mais reconhecido eestudado. Apesar de ser um dos tecidos mais moles do organismo, a medula óssea tem uma organização estrutural 3D que está confinada dentro do osso. A rigidez da medula, embora tecnicamente difícil de medir com precisão, é estimada entre 15 e 300 Pa 5,6. Dentro do estroma, as células estão bem confinadas umas às outras. Além disso, a maioria deles está migrando em direção aos vasos sinusoides para entrar na circulação sanguínea. Essas condições criam restrições mecânicas adicionais em células adjacentes, que têm que se adaptar a essas forças. As pistas mecânicas representam um parâmetro importante cujas consequências sobre a diferenciação de megacariote e a formação de proplatelets foram recentemente exploradas. Embora os megacaiócitos possam diferenciar in vitro na cultura líquida tradicional, eles não atingem o grau de maturação observado in vivo,em parte devido à ausência das pistas mecânicas do ambiente 3D 7. Progenitores em crescimento embutidos em hidrogel traz pistas mecânicas 3D que estão faltando em meio líquido.
Hidrogéis têm sido amplamente utilizados por várias décadas no campo hematológico, notadamente para cultivar células em colônias formando ensaios para quantificar progenitores hematopoiéticos. No entanto, esses hidrogéis raramente têm sido usados para explorar o impacto biológico do ambiente mecânico 3D na maturação e diferenciação das células hematopoiéticas. Nos últimos anos, nosso laboratório desenvolveu um modelo de cultura 3D usando um hidrogel à base de metilcelulose 8. Este gel físico não reativo é uma ferramenta útil para imitar as restrições físicas do ambiente de megacaiócito nativo. É derivado da celulose pela substituição de resíduos de hidroxílico (-OH) por grupos de metoóxido (-OCH3). Tanto o grau de substituição de metila quanto a concentração de metilcelulose determinam a rigidez do hidrogel uma vez que tenha gelatinado. Durante a fase de desenvolvimento desta técnica, foi demonstrado que o módulo de um Young na faixa de 30 a 60 Pa é a rigidez de gel ideal para o crescimento de megacariocíte 9.
O protocolo a seguir descreve um método para cultivar progenitores megacariocíticos de camundongos em um hidrogel de metilcelulose 3D. Foi demonstrado anteriormente que, em comparação com a cultura líquida padrão, essa cultura de hidrogel aumenta o grau de poliploidização de megacaitos, melhora a maturação e organização intracelular, e aumenta a capacidade de megacaiócitos para estender proplatelets uma vez resuspended em um meio líquido 9. Este manuscrito descreve em detalhes o protocolo para o isolamento das células lin- da medula óssea do rato e sua incorporação em um hidrogel de metilcelulose para cultura 3D, bem como a quantificação de sua capacidade de produzir proplatas e a recuperação das células para análises posteriores.

<table><tbody><tr><td>Agulhas de calibre 18</td> Agulhas <td>de calibre</td> 21 <td>Sigma-Aldrich</td> 1001735825 <td></td></tr><tr><td>Agulhas de</td><td>calibre 23</td> BD Microlance <td>301155</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Terumo</td><td>AN*2332R1</td><td></td></tr><tr><td>Agulhas de calibre 25 BD</td><td>Microlance</td><td>300400</td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultura de 4 poços</td><td>Thermo Scientific</td><td>144444</td><td></td></tr><tr><td>Seringas de 5 mL</td><td>Terumo</td><td>SS+05S1</td><td></td></tr><tr><td>Cytoclips</td><td>Microm Microtech</td><td>F/CLIPSH</td><td></td></tr><tr><td>Cytofunnels equipados com cartões de filtro</td><td>Microm Microtech</td><td>F/JC304</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga Cytospin</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>Cytospin 4</td></tr><tr><td></td><td>Dakopen Dako DMEM</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1x</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>41 966-029</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190-094</td><td>Dulbecco Estéril' s ímãs de solução salina tampoiados com fosfato</td></tr><tr><td>EasySep</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>18000</td><td></td></tr><tr><td>Kit de isolamento de células progenitoras hematopoiéticas de camundongo EasySep</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>19856A</td><td>anticorpos biotinilados (CD5,CD11b, CD19, CD45R/B220, Ly6G/C(Gr-1), TER119,7&ndash; 4) e esferas magnéticas revestidas com estreptavidina</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Healthcare Life Science</td><td>SH30071.01</td><td></td></tr><tr><td>Luer lock 1 mL seringas</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z551546-100EA</td><td>ou 309628 seringas da BD MEDICAL</td></tr><tr><td>Luer lock seringas conectores</td><td>Fisher Scientific</td><td>11891120</td><td></td></tr><tr><td>MC 3%</td><td>R& AMP; D systems</td><td>HSC001</td><td></td></tr><tr><td>Corrediças revestidas com polilisina</td><td>Thermo Scientific</td><td>J2800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>PSG 100x</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>1037-016</td><td>10.000 unidades/mL penicilina, 10.000 &mu; g/mL de estreptomicina e 29,2 mg/mL de glutamina</td></tr><tr>Soro<td>de rato</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>13551</td><td></td></tr><tr><td>Hirudina recombinante</td><td>Transg&egrave; ne</td><td>rHV2-Lys47</td><td></td></tr><tr><td>Trombopoietina humana recombinante (rhTPO)</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>2822</td><td>10.000 unidades/mL</td></tr><tr><td>Tubos plásticos de 10 mL com fundo redondo Falcon</td><td></td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>Tubos</td><td></td><td></td><td></td> de poliestireno de 5 mL com fundo redondo</tr></tbody></table>

cultura de megacariócito em hidrogel baseado em metilcelulose 3d para melhorar a maturação celular e estudar o impacto da rigidez e confinamento

Megakaryocyte Culture in 3D Methylcellulose-Based Hydrogel to Improve Cell Maturation and Study the Impact of Stiffness and Confinement

O ambiente 3D que leva tanto ao confinamento quanto às restrições mecânicas é cada vez mais reconhecido como um importante determinante do comportamento celular. Assim, a cultura 3D foi desenvolvida para melhor abordar a situação in vivo. Os megacariócitos diferenciam-se das células hematopoiéticas e progenitoras (HSPCs) na medula óssea (ML). O BM é um dos tecidos mais moles do corpo, confinado dentro do osso. O osso sendo pouco extensível na escala celular, megacariócitos são concomitantemente submetidos a uma rigidez fraca e alto confinamento. Este protocolo apresenta um método para a recuperação de HSPCs de linhagem de camundongos negativos (Lin-) por triagem imunomagnética e sua diferenciação em megacaiócitos maduros em um meio 3D composto de metilcelulose. A metilcelulose não é reativa em relação aos megacaiócitos e sua rigidez pode ser ajustada à da medula óssea normal ou aumentada para imitar uma medula fibrosa patológica. O processo de recuperação dos megacaitos para novas análises celulares também está detalhado no protocolo. Embora a extensão de proplato é impedida dentro do meio 3D, ela é descrita abaixo como resuspend os megacaitos em meio líquido e quantificar sua capacidade de estender proplatelets. Os megacariócitos cultivados em hidrogel 3D têm maior capacidade de formar proplatelets em comparação com aqueles cultivados em um meio líquido. Esta cultura 3D permite i) diferenciar progenitores em direção a megacaitos que atingem um estado de maturação mais elevado, ii) para recapitular fenótipos que podem ser observados in vivo, mas passam despercebidos nas culturas líquidas clássicas, e iii) para estudar vias de transdução induzidas pelas pistas mecânicas fornecidas por um ambiente 3D.

Os dados obtidos por este protocolo foram originalmente publicados no Blood em 20169.
De acordo com o protocolo, as células foram semeadas em meio de hidrogel líquido ou metilcelulose. As células em meio líquido têm todos sedimentados na parte inferior do poço, em contato com a superfície plástica rígida e em algum momento com outras células. Em contraste, as células embutidas no hidrogel de metilcelulose são distribuídas de forma homogênea no gel e são isoladas das cél...

Reconhece-se agora que o ambiente tridimensional das células pode desempenhar um papel importante em seu comportamento, maturação e/ou diferenciação. Este protocolo descreve um modelo de cultura celular tridimensional projetado para estudar o impacto da contenção física e restrições mecânicas em megacaiócitos.

Cultura de megacariócito em hidrogel baseado em metilcelulose 3D para melhorar a maturação celular e estudar o impacto da rigidez e confinamento

The 3D environment leading to both confinement and mechanical constraints is increasingly recognized as an important determinant of cell behavior. 3D ...

Este protocolo permite a avaliação in vitro do impacto do confinamento e da rigidez média a que megacariócitos nativos são expostos na medula óssea sobre seu comportamento e maturação. A principal vantagem dessa técnica é um modelo simplificado que elimina interações células-células e matrizes celulares e foca nos aspectos mecânicos. Boas práticas laboratoriais e condições de trabalho estéreis devem ser estritamente observadas.De fato, mesmo uma ligeira contaminação do hidrogel pode ter um impacto dramático na diferenciação de megacaióte. Para obter um único poço de cultura de células de hidrogel, comece descongelando duas alíquotas de 3%de metilcelulose a temperatura ambiente, depois cubra uma seringa de bloqueio Luer de um mililitro com a metilcelulose, primeiro desenhando um mililitro e depois expulsando tudo. Em seguida, usando a mesma seringa e agulha, retire 333 microliters de metilcelulose de uma alíquota fresca.Depois de remover cuidadosamente a agulha, use fórceps esterilizados para enroscar um conector de travar Luer na extremidade da seringa, em seguida, anexar uma segunda seringa de bloqueio Luer não revestida de mililitro ao conector. Distribua igualmente o metilcelulose entre as duas seringas e reserve-as. Em seguida, resuspenncie a linhagem de camundongos anteriormente isolada células-tronco hematopoiéticas e progenitoras no meio de cultura concentrada a uma densidade de uma vez 10 para as seis células por 167 microlitres.Desconecte uma das seringas do conector e pipeta 167 microliters da suspensão celular diretamente no conector enquanto simultaneamente desenha o êmbolo da seringa lentamente para abrir espaço para a suspensão da célula. Depois de adicionar toda a suspensão da célula ao conector, retire ainda mais o êmbolo para retirar a suspensão do conector e reconecte cuidadosamente a segunda seringa, tomando cuidado para não perder nenhuma suspensão na rosca do parafuso. Para homogeneizar o meio de metilcelulose com a suspensão da célula, mova lentamente os êmbolos para frente e para trás entre as duas seringas 10 vezes, em seguida, desenhe o volume total em uma seringa e desconecte as duas seringas, deixando o conector no vazio.Esvazie o conteúdo da seringa em um poço de uma placa de quatro poços e incubar a placa a 37 graus abaixo de 5% de dióxido de carbono. Para analisar proplatelets, no terceiro dia de cultura, transfira cuidadosamente todas as células de um poço para um tubo de 15 mililitros contendo 10 mililitros de DMEM com 1%PSG. Resuspenque as células tubondo suavemente para diluir completamente a metilcelulose, em seguida, centrífugue o tubo por cinco minutos a 300 vezes G à temperatura ambiente.Depois de descartar o supernascer, resuspenque a pelota celular em um mililitro de cultura completa média e re-semente as células a 500 microliters por poço de uma placa de quatro poços. Incubar a placa a 37 graus Celsius abaixo de 5% de dióxido de carbono. No dia seguinte, usando um microscópio Brightfield com um objetivo de 20X, adquira aleatoriamente 10 imagens por poço, certificando-se de não ter muitas células no campo de visão e capturando pelo menos cinco megacaiócitos por campo.Usando ImageJ, conte o número total de megacaiócitos e aqueles que estendem proplatelets em cada imagem para calcular a proporção de megacaiócitos que estendem proplatelets. Para fixar as células para análises futuras, adicione a solução fixativa em cima da metilcelulose sem interromper o gel. Depois de esperar por um tempo adequado, dependendo do fixador utilizado, use uma pipeta P1000 para pipetar suavemente o fixador e o gel até que o metilcelulose tenha sido homogêneo diluído.E usando a mesma ponta pipeta, transfira todo o conteúdo do poço para um tubo de 15 mililitros contendo 10 mililitros de DPBS e homogeneize por mistura. Centrifugar a mistura. Descarte o supernatante e resuspenque a pelota de megacaióte em um meio apropriado para a análise desejada.No terceiro dia de cultura, os megacaiócitos no meio líquido têm sedimentado na parte inferior do poço e estão em contato com a superfície plástica rígida, bem como outras células. Em contraste, as células embutidas no hidrogel de metilcelulose são distribuídas de forma homogênea e isoladas das células vizinhas. Uma análise do diâmetro médio dos megacaitos em diferentes condições culturais mostra que 2%de metilcelulose aumenta ligeiramente o diâmetro médio de megacariote em comparação com a cultura líquida.No entanto, aumentar a concentração de metilcelulose em 0,5% prejudica a diferenciação de megacariócitos, como indicado por um diâmetro médio menor. Em imagens de microscopia eletrônica de transmissão representativa, as membranas intracytoplasmáticas em megacariócitos diferenciados in vivo dentro da medula óssea parecem ser intimamente opostas com territórios citoplasmados delineados. Na cultura líquida, as membranas têm principalmente uma pequena aparência oval redonda ou vesículas alongadas sem delimitação de territórios citoplasmados.Em contraste, a cultura de 2% de metilcelulose tem se oposto intimamente às membranas com territórios citoplasmesmes delimitantes semelhantes à estrutura in situ. No quarto dia de cultura, os megacaiócitos previamente cultivados em hidrogel mostram aumento da formação de proplatelet em comparação com aqueles cultivados em meio líquido. A proporção média de megacaiocitas que estendem proplatelets é geralmente em torno de 15 a 20% com uma pré-cultura líquida em comparação com 35 a 40% com uma pré-cultura de hidrogel de metilcelulose.Ao tentar este procedimento, é importante pipetar os volumes apropriados muito precisamente, pois uma pequena mudança na concentração final de metilcelulose pode modificar significativamente a rigidez da mídia. Após a maturação celular no hidrogel, megacariócitos podem ser recuperados para análise de ploidy e marcadorcelular por citometria de fluxo ou fixada para microscopia eletrônica ou imunossuagem de proteína de interesse.

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Aprenda a cultivar megacariócitos em hidrogel de metilcelulose 3D para estudar rigidez e confinamento mecânico. Este método melhora a maturação celular e a formação de proplaquetas em células-tronco hematopoéticas de camundongo.

Cultura de megacariócito em hidrogel baseado em metilcelulose 3D para melhorar a maturação celular e estudar o impacto da rigidez e confinamento (Vídeo) | JoVE Journal

Cultura de megacariócito em hidrogel baseado em metilcelulose 3D para melhorar a maturação celular e estudar o impacto da rigidez e confinamento

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