Name: In Vivo Imagem de dois fótons de megacariócitos e proplatelets na medula óssea do crânio do rato (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-28T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 58 s
Description: Aprenda a imagem de dois fótons in vivo de megacariócitos e proplatelets na medula óssea do crânio do rato. Este método permite visualizar a formação de plaquetas em condições fisiológicas.

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Os autores gostariam de agradecer a Florian Gaertner (Instituto de Ciência e Tecnologia da Áustria, Klosterneuburg, Áustria) por seu conselho de especialistas em experimentos de microscopia de dois fótons na época em que estabelecemos a técnica no laboratório, e Yves Lutz no Centro de Imagens IGBMC /CBI (Illkirch, França) por sua experiência e ajuda com o microscópio de dois fótons. Agradecemos também a Jean-Yves Rinkel por sua ajuda técnica e Inês Guinard pelo desenho do esquema na Figura 1. Agradecemos à ARMESA (Association de Recherche et Développement en Médecine et Santé Publique) pelo apoio na aquisição do microscópio de dois fótons. A AB foi apoiada por bolsas de pós-doutorado da Etablissement Français du Sang (APR2016) e da Agence Nationale de la Recherche (ANR-18-CE14-0037-01).

<ol><li>Junt, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+visualization+of+thrombopoiesis+within+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Dynamic visualization of thrombopoiesis within bone marrow.</a> Science. 317 (5845), 1767-1770 (2007).</li>
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<li>Kohler, A., Geiger, H., Gunzer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+hematopoietic+stem+cells+in+the+marrow+of+long+bones+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Imaging hematopoietic stem cells in the marrow of long bones in vivo.</a> Methods in Molecular Biology. 750, 215-224 (2011).</li>
<li>Lewandowski, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+cellular+imaging+pinpoints+the+role+of+reactive+oxygen+species+in+the+early+steps+of+adult+hematopoietic+reconstitution%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">In vivo cellular imaging pinpoints the role of reactive oxygen species in the early steps of adult hematopoietic reconstitution.</a> Blood. 115 (3), 443-452 (2010).</li>
<li>Reismann, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longitudinal+intravital+imaging+of+the+femoral+bone+marrow+reveals+plasticity+within+marrow+vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Longitudinal intravital imaging of the femoral bone marrow reveals plasticity within marrow vasculature.</a> Nature Communications. 8 (1), 2153(2017).</li>
<li>Chen, Y., Maeda, A., Bu, J., DaCosta, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Femur+window+chamber+model+for+in+vivo+cell+tracking+in+the+murine+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Femur window chamber model for in vivo cell tracking in the murine bone marrow.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (113), e542205(2016).</li>
<li>Guesmi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual-color+deep-tissue+three-photon+microscopy+with+a+multiband+infrared+laser%5BTitle%5D)+AND+%22Light+Science+%26+Applications%22%5BJournal%5D)">Dual-color deep-tissue three-photon microscopy with a multiband infrared laser.</a> Light Science & Applications. 7, 12(2018).</li>
<li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-photon+imaging+of+mouse+brain+structure+and+function+through+the+intact+skull%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Three-photon imaging of mouse brain structure and function through the intact skull.</a> Nature Methods. 15 (10), 789-792 (2018).</li>
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</ol>

Os autores não têm conflitos de interesse para declarar.

Os mecanismos de formação de plaquetas são altamente dependentes do ambiente de medula óssea. Assim, a microscopia intravital tornou-se uma ferramenta importante no campo para visualizar o processo em tempo real. Camundongos com megacaiócitos fluorescentes podem ser obtidos cruzando camundongos expressando a recombinase cre em megacaiócitos com qualquer rato repórter floxed contendo um de expressão genética fluorescente condicional. Aqui, foram utilizados ratos repórteres mTmG (B6.129(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-t...

As plaquetas são produzidas por células especializadas em megacaiócitos localizadas na medula óssea. A maneira precisa como os megacaiócitos liberam plaquetas na circulação há muito tempo não ficou clara devido ao desafio técnico em observar eventos em tempo real através do osso. A microscopia de dois fótons ajudou a superar esse desafio e levou a grandes avanços na compreensão do processo de formação de plaquetas. As primeiras observações in vivo de megacaito foram feitas por von Andrian e colegas em 2007, com a visualização de megacaiócitos fluorescentes através do crânio1. Isso foi possível porque a camada óssea no crânio frontoparietal de camundongos adultos jovens tem uma espessura de algumas dezenas de mícrons e é suficientemente transparente para permitir a visualização de células fluorescentes na medula óssea subjacente2.
Estudos subsequentes aplicaram este procedimento para avaliar a formação de proplatos em várias condições e decifrar os mecanismos subjacentes3,4,5,6. Esses estudos forneceram evidências definitivas de que os megacaiócitos ampliam dinamicamente as saliências, chamadas proplatelets, através da barreira endotelial dos vasos sinusoides(Figura 1). Essas propuladas são então liberadas como fragmentos longos que representam várias centenas de plaquetas em volume. As plaquetas serão formadas após a remodelação das propuladas na microcirculação de órgãos a jusante, notadamente nos pulmões7. Até o momento, no entanto, o processo preciso e os mecanismos moleculares permanecem sujeitos a debate. Por exemplo, o papel proposto das proteínas citoesqueletal no alongamento das proplatelets difere entre as condições in vitro e in vivo 3, e as diferenças na formação de proplatelets têm sido demonstradas sob condições inflamatórias6. Complicando ainda mais as coisas, um estudo recente contestou o conceito orientado por proplatelet e propôs que in vivo, plaquetas são essencialmente formadas através de um mecanismo de brotação de membrana no megacaiócito nível8.
Este artigo apresenta um protocolo para a observação de megacaiócitos e proplatelets na medula óssea do osso do crânio em camundongos vivos, usando um procedimento minimamente invasivo. Abordagens semelhantes foram descritas anteriormente para visualizar outras células de medula, notadamente células hematopoiéticas e progenitoras9. O foco aqui está na observação de megacaiócitos e plaquetas para detalhar alguns parâmetros que podem ser medidos, notadamente morfologias proplatelet e velocidade plaqueta. Este protocolo apresenta como inserir um cateter na veia jugular para injetar traços fluorescentes e drogas e observar através do osso do crânio. O osso calvário é exposto usando uma pequena cirurgia para que um anel seja colado ao osso. Este anel serve para imobilizar a cabeça e evitar movimentos devido à respiração e formar um copo cheio de soro fisiológico como o meio de imersão da lente. Esta técnica é bem adequada para i) observar em tempo real a geometria sinusoide e megacariócitos interagindo com a parede do vaso; ii) seguir os megacaitos no processo de formação de proplatelet, alongamento e liberação; e iii) medir os movimentos das plaquetas para monitorar o complexo fluxo sanguíneo sinusoide. Os dados obtidos usando este protocolo foram publicados recentemente3.

<table><tbody><tr><td>Software GNU Octave Projeto</td><td></td><td>GNU</td><td>https://www.gnu.org/software/octave/</td></tr><tr><td>&nbsp; Histoacryl 5 x 0, 5 mL</td><td></td><td>Braun 1050052</td><td>solução injetável de cola cirúrgica</td></tr><tr><td>Detectores híbridos HyD Leica Microsystems 4tunes</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>Projeto</td><td></td> GNU <td>Versão mínima necessária</td></tr><tr><td>Imalgene/Cetamina 1000 fl/10 mL</td><td>Boehring</td><td>03661103003199</td><td>proteção ocular</td></tr><tr><td>Microscópio Leica SP8 MP DIVE equipado com uma objetiva de água de 25x, abertura numérica de 0,95</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td>excitação simultânea de AlexaFluor-488 e Qtracker-655</td></tr><tr><td>Matlab</td><td>MathWorks</td><td></td><td>https://www.mathworks.com/</td></tr> <tr><td>Ocrygel 10 g</td><td>Laboratoires T.V.M.</td><td>03700454505621</td><td>Pasta dentária de silício azul e amarelo</td></tr><tr><td>Picodent twinsin speed</td><td>Rotec</td><td>13001002</td><td></td></tr><tr><td>Qtracker 655 etiqueta vascular</td><td>Invitrogen</td><td>Q21021MP</td><td>solução injetável</td></tr><tr><td>Scanner ressonante, 8 ou 12 kHz</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rompun Xylazine 2% fl/25 mL</td><td>Bayer</td><td>04007221032311</td><td></td></tr><tr><td>Superglue gel</td><td></td><td></td><td>para colar o anel no osso</td></tr><tr><td>Cateter Surflo IV - Azul 22 G</td><td>Terumo</td><td>SR-OX2225C1</td><td></td></tr><tr><td>Ti:Laser pulsante Saph (Coerente) (femtossegundo)</td><td>Coerente</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo imagem de dois fótons de megacariócitos e proplatelets na medula óssea do crânio do rato

In Vivo Two-photon Imaging of Megakaryocytes and Proplatelets in the Mouse Skull Bone Marrow

As plaquetas são produzidas por megacaiócitos, células especializadas localizadas na medula óssea. A possibilidade de imagem de megacaiócitos em tempo real e seu ambiente nativo foi descrita há mais de 10 anos e lança uma nova luz sobre o processo de formação de plaquetas. Os megacariócitos estendem as saliências alongadas, chamadas proplatelets, através do revestimento endotelial dos vasos sinusoides. Este artigo apresenta um protocolo para imagem simultânea em tempo real fluorescentemente rotulado megacariócitos na medula óssea do crânio e vasos sinusoides. Esta técnica conta com uma pequena cirurgia que mantém o crânio intacto para limitar as reações inflamatórias. A cabeça do rato é imobilizada com um anel colado no crânio para evitar que os movimentos respirem.
Usando microscopia de dois fótons, megacariócitos podem ser visualizados por até algumas horas, permitindo a observação de saliências celulares e proplatelets no processo de alongamento dentro de vasos sinusoides. Isso permite a quantificação de vários parâmetros relacionados à morfologia das protrusões (largura, comprimento, presença de áreas de constrição) e seu comportamento de alongamento (velocidade, regularidade ou presença de pausas ou fases de retração). Esta técnica também permite o registro simultâneo de plaquetas circulantes em vasos sinusoides para determinar a velocidade plaqueta e a direção do fluxo sanguíneo. Este método é particularmente útil para estudar o papel dos genes de interesse na formação de plaquetas usando camundongos geneticamente modificados e também é favorável aos testes farmacológicos (estudar os mecanismos, avaliando drogas no tratamento de distúrbios de produção de plaquetas). Tornou-se uma ferramenta inestimável, especialmente para complementar estudos in vitro, pois agora se sabe que a formação in vivo e in vitro proplatelet depende de diferentes mecanismos. Foi demonstrado, por exemplo, que microtúbulos in vitro são necessários para alongamento proplatelet por si só. No entanto, in vivo, eles preferem servir como um andaime, o alongamento sendo promovido principalmente por forças de fluxo sanguíneo.

Usando este protocolo, o rastreador fluorescente, Qtracker-655, foi administrado por via intravenosa a vasos sinusoides de medula anastomosa na medula óssea do crânio e na direção de fluxo, como retratado pelas setas(Figura 4A, à esquerda). Utilizando camundongos mTmG, as plaquetas fluorescentes eGFP foram registradas acima de 20 s em cada ramo do navio, e sua velocidade foi medida usando o software ImageJ e GNU Octave(Figura 4A, à direita). Note a heterogeneida...

Descrevemos aqui o método para imagem de megacaiócitos e proplatelets na medula do osso do crânio de ratos vivos usando microscopia de dois fótons.

In Vivo Imagem de dois fótons de megacariócitos e proplatelets na medula óssea do crânio do rato

Platelets are produced by megakaryocytes, specialized cells located in the bone marrow. The possibility to image megakaryocytes in real time and their ...

Este método permite a visualização em tempo real de diferentes eventos, ocorrendo na medula óssea do rato do crânio, como megacariócitos, estendendo proplatelets dentro dos vasos sinusoides. A principal vantagem dessa técnica é uma pequena cirurgia necessária para minimizar a reação inflamatória, permitindo uma visualização in vivo de eventos em condições quase de fábrica. Para começar, transporte o rato para a sala de imagens.Ligue o microscópio e o computador e configure os parâmetros necessários. Uma vez que o mouse tenha colocado completamente anestesiado o mouse em uma placa aquecida, aquecido a 37 graus Celsius para todas as manipulações seguintes, raspe a cabeça e a garganta do mouse e aplique o gel nos olhos para evitar o ressecamento. Coloque o mouse de costas e conserte as pernas anteriores com fita cirúrgica para esticar a garganta.Depois de desinfetar a garganta, faça uma incisão de 0,7 a 1 centímetro sobre a veia jugular direita ou esquerda usando uma tesoura e estique o tecido conjuntivo adjacente para expor a veia malabarista externa em cima do músculo peitoral. Encha o cateter com soro fisiológico quente e estéril. Penetre o cateter através do músculo peitoral e, em seguida, insira o cateter na veia.Retire suavemente a agulha, conecte a seringa com os rastreadores fluorescentes e injete o volume morto do cateter. Coloque uma gota de cola cirúrgica para estabilizar o cateter. Retorne cuidadosamente o mouse para uma posição propensa.Desinfete o couro cabeludo com 70% de etanol com uma toalha de papel enquanto remove os cabelos soltos. Use tesouras finas estéreis e pinças para fazer uma incisão em forma de T na linha média até um centímetro entre as orelhas no couro cabeludo para expor o calvario. Exponha o crânio com pinças, depois use tesouras e pinças para remover cuidadosamente o periósteo.Use um cotonete estéril encharcado e fisiológico para remover todo o periósteo e quaisquer detritos ou cabelos que possam alterar a imagem. Enxágüe o crânio com soro fisiológico para remover quaisquer vestígios sanguíneos e seque rapidamente o osso com um cotonete. Aplique o gel de cola no anel, coloque o anel no osso exposto e mantenha-o por alguns segundos para permitir que o anel se apegue firmemente ao crânio.Umedeça levemente o crânio com um cotonete de algodão salino. Prepare a pasta dentária de Silício misturando cuidadosamente os componentes azul e amarelo em uma proporção de um para um. Sele o anel aplicando a pasta dentária para evitar vazamentos durante a imagem.Remova cuidadosamente qualquer pasta dentária ou cola que possa ter entrado no anel. Em seguida, encha o anel com soro fisiológico para verificar o vazamento. Coloque o mouse no suporte e coloque uma compressa dobrada sob a cabeça do animal para levantar a cabeça e evitar o descolamento do anel do crânio quando ligado ao suporte.Dane-se o anel no suporte do bloco. Coloque o suporte e o conjunto do mouse na câmara de microscópio aquecido. Defina os comprimentos de onda laser apropriados para os quatro quatros escolhidos e a recuperação das luzes emitidas.Utilizando o cateter inter malabarista injete 50 microliters de 0,2 solução micromolar do rastreador fluorescente para rotular a vasculatura. Coloque o estágio do microscópio com o suporte e o mouse sob o objetivo do microscópio. Certifique-se de que o anel está sempre cheio de soro fisiológico e recarrenchá-lo, se necessário, e imergir o objetivo e soro fisiológico.Use epifluorescência para localizar os vasos de medula óssea e observar os megacaiócitos alinhados ao longo dos vasos sinusoides. Para aquisições longas, configure uma aquisição 3D espaço-tempo com uma imagem de 384 por 384 pixels usando um scanner de ressonância Hertz de oito quilos e modo bidirecional. Use a linha média com boa resolução, em seguida, escolha o tamanho otimizado de etapa Z e configure o intervalo de tempo necessário antes de iniciar a aquisição.Para aquisições curtas e rápidas, escolha um espaço, tipo de aquisição de tempo e minimize o tamanho da imagem. Se necessário, ajuste a imagem para a nave girando o campo de imagem. Use a maior velocidade de varredura disponível e digitalização bidirecional.Minimize a média da linha para encontrar o compromisso ideal entre definição de imagem e rapidez da aquisição. Adquira apenas um plano Z e minimize o intervalo de tempo para aquisição. Para medir a velocidade plaqueta de 10 a 20 segundos de aquisição deve ser suficiente.O rastreador fluorescente foi administrado por via intravenosa à imagem dos vasos sinusoides de medula anastomosa na medula óssea do crânio, com a direção de fluxo representada pela seta. A velocidade da plaqueta fluorescente foi registrada em cada ramo do vaso, e a variação foi observada. Os vasos sinusoides apresentam fluxos complexos devido aos anastomoses, com a presença de refluxo de fluxo e até estase.Setas indicavam a direção oposta do fluxo na bifurcação. A velocidade da plaqueta também foi medida para os ramos da embarcação esquerda e direita indicaram irregularidade ao longo do tempo em cada ramo da embarcação com fases de aceleração, estase e desaceleração. Diferentes morfologias de proplatelets foram observadas, incluindo proplatelets com margens irregulares, em seguida, en proplatelets longos e proplatelets grossas e curtas.Quando os megacaiócitos estenderam as propuladas nas áreas de fluxos complexos, os propulados lançam de um ramo de navio para o outro, de acordo com a direção de fluxo. Ao parar o fluxo sanguíneo, as propuladas relaxaram e o camundongo inesperadamente sofreu parada cardíaca, indicando a importância das forças hidrodinâmicas no alongamento proplatelet. A largura e o comprimento dos proplatelets também foram medidos com largura média de 5,2 micrômetros e observou-se um comprimento máximo médio de aproximadamente 185 micrômetros.Traçar o comprimento proplatelet em função do tempo permite a visualização do comportamento dos proplatelets durante fases de alongamento, estase ou até mesmo retração. Observou-se a velocidade média de alongamento de aproximadamente 10 micrômetros por minuto. A instalação do cateter permitiu a injeção de medicamentos para estudar os efeitos na formação de proplatelets ou outros eventos de interesse em tempo real.

in-vivo-two-photon-imaging-megakaryocytes-proplatelets-mouse-skull

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Neste vídeo, descrevemos um procedimento cirúrgico para implantar um conjunto de anel craniano no osso do crânio exposto e imobilizar ainda mais a cabeça do camundongo para imagens cerebrais de alta resolução por um longo período.

Instalação de montagem de anel craniano em modelo de camundongo: um procedimento cirúrgico para implantar a montagem da janela de visualização no crânio murino para imagens de medula óssea do crânio de alta resolução

A imagem de lapso de tempo no animal vivo fornece informações valiosas sobre a reorganização estrutural no cérebro intacto. Aqui, apresentamos uma preparação de crânio afinado que permite imagens transcranianas de estruturas sinápticas marcadas com fluorescência no córtex de camundongo vivo por microscopia de dois fótons.

Two-Photon<em&gt; In vivo</em&gt; Imagem de espinhas dendríticas no Rato Cortex Usando um desbaste-crânio Preparação

Combinatória 5 proteínas fluorescentes marcação de células-tronco e progenitoras hematopoiéticas permite in vivo de rastreamento via clonal confocal e microscopia de dois fótons, fornecendo insights sobre medula óssea hematopoiética arquitetura durante a regeneração. Este método permite o mapeamento destino não-invasivo de espectro codificados células hspCs derivados em tecidos intactos por longos períodos de tempo após o transplante.

In vivo Clonal Rastreamento de Stem hematopoiéticas e células progenitoras Marcado por cinco proteínas fluorescentes usando confocal e microscopia multifotônica

A natureza das interações entre células tronco e progenitoras hematopoéticas (hspCs) e nichos de medula óssea é pouco compreendido. Modificações de hardware personalizado e um protocolo de aquisição multi-passo permite o uso de dois fótons e microscopia confocal a imagem ex vivo hspCs rotulados hospedados dentro de áreas da medula óssea, as interações de rastreamento e movimento.

In Vivo Rastreamento 4-Dimensional de tronco hematopoéticas e células progenitoras em adultos mouse na calota craniana de Medula Óssea

Os monócitos são os principais reguladores da imunidade inata e desempenham um papel crítico na renovação do sistema fagocítico mononuclear periférico e em caso de inflamação. Este manuscrito descreve o procedimento de imagem em tempo real da medula óssea da calvária de camundongos para estudar o mecanismo de mobilização de monócitos.

Acompanhando Rato Medula Óssea monócitos<em&gt; In Vivo</em

Detalhamos um protocolo para monitorar o comportamento de neutrófilos e monócitos em veias mesentéricas em estado estacionário e condições inflamatórias usando microscopia confocal intravital em camundongos anestesiados.

Imagiologia neutrófilos e monócitos em Mesenteric Veins por Microscopia intravital em ratos anestesiados em Tempo Real

O protocolo descreve um novo modelo de câmara de janela de fêmur murino que pode ser usado para rastrear o movimento de células na medula óssea femoral in vivo. A microscopia de fluorescência multifotônica intravital é usada para obter imagens de três componentes da medula óssea femoral (vasculatura, matriz de colágeno e neutrófilos) ao longo do tempo.

Modelo Câmara fêmur Janela para<em&gt; In Vivo</em&gt; Acompanhamento de celular na Murino de Medula Óssea

Microscopia de fluorescência intravital (IVFM) da calvária é aplicada em combinação com modelos de animais geneticamente para estudar o homing e enxertia das células hematopoiéticas em nichos de medula óssea (BM).

Combinando a microscopia Intravital fluorescente (IVFM) com modelos genéticos para estudar a dinâmica de enxertia das células hematopoiéticas para nichos de medula óssea

Aqui, apresentamos um protocolo para analisar a ultraestrutura dos megacaiócitos in situ usando microscopia eletrônica de transmissão (TEM). As medulas ósseas murinas são coletadas, fixas, embutidas em resina epóxi e cortadas em seções ultrafinas. Após a coloração de contraste, a medula óssea é observada sob um microscópio TEM a 120 kV.

In situ Exploração de Murine Megacaryopoiesis usando Microscopia eletrônica de transmissão

Aqui, detalhamos o método de explanta da medula óssea, desde a preparação da amostra até a análise de slides microscópicas, para avaliar a capacidade de megacaiócitos que se diferenciaram em seu ambiente fisiológico para formar proplatelets.

Dinâmica de formação de propulato de plantas de medula óssea fresca

A microscopia intravital permite o estudo de processos biológicos dinâmicos, como regeneração tecidual e desenvolvimento tumoral. A medula óssea da calvária, um tecido altamente dinâmico, oferece informações sobre hematopoiese e função vascular. O uso de um implante de fixação de cabeça impresso em 3D biocompatível permite imagens longitudinais repetitivas, aprimorando nossa compreensão da dinâmica do tecido e do microambiente tumoral.

Imagem longitudinal intravital da dinâmica vascular na medula óssea da calvária

Aprenda a imagem de dois fótons in vivo de megacariócitos e proplatelets na medula óssea do crânio do rato. Este método permite visualizar a formação de plaquetas em condições fisiológicas.

In Vivo Imagem de dois fótons de megacariócitos e proplatelets na medula óssea do crânio do rato

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