Imagem e quantificação de dendritos neuronais intactos via clareza de tecido
20 de abril de 2021
A morfologia dendrítica neuronal muitas vezes está por trás da função. De fato, muitos processos de doenças que afetam o desenvolvimento de neurônios se manifestam com um fenótipo morfológico. Este protocolo descreve um método simples e poderoso para analisar arbores dendríticas intactas e suas espinhas associadas.
Este protocolo permitirá que os pesquisadores respondam a perguntas importantes sobre padrões neuronais de conectividade e organização espacial que fundamentam a função dentro de um circuito. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite a visualização de morfologias neuronais localizadas profundas dentro do tecido tridimensional intacto. Este método é simples e, portanto, facilmente reproduzível.
Os experimentadores iniciantes devem estar confortáveis em executar esta técnica. É imprescindível ter uma amostra de tecido claro para obter dados de alta qualidade. A demonstração visual de técnicas adequadas de clareza tecidual e de compensação permitirá resultados facilmente reprodutíveis.
Para começar, coloque o tecido cerebral submerso de hidrogel em uma incubadora de vácuo por três horas a 37 graus Celsius com menos 90 quilopascal de vácuo. Deixe a parte superior do tubo desparafusada para permitir que o vácuo se forme corretamente. Lave o tecido com PBS por 10 minutos em temperatura ambiente com agitação suave.
Coloque a amostra de tecido polimerizado na câmara de eletroforese, acompanhando a orientação do tecido dentro da câmara. Encha a câmara e o reservatório com o tampão SDS de eletroforese fornecido. Execute a amostra a 70 volts, um ampere e 35 graus Celsius com corrente constante por cerca de duas horas por mililitro de tecido.
Verifique periodicamente a amostra quanto a limpeza do tecido cerebral, removendo-a da câmara e substituindo-a na mesma orientação. Depois que a amostra terminar de limpar, lave-a em PBS durante a noite à temperatura ambiente, substituindo o PBS por PBS fresco o mais frequentemente possível. Após a lavagem final na PBS, lave o tecido por cinco minutos em água deionizada à temperatura ambiente três vezes.
O tecido ficará opaco e pode se expandir. Incubar o tecido na solução de correspondência de índices de refração por pelo menos quatro horas em temperatura ambiente. Durante a incubação, construa uma câmara de habitação adequada para a imagem da amostra.
Comece usando um slide de vidro como base para montagem, em seguida, deite borracha ou espaçadores plásticos e fixe-os com super cola, certificando-se de que não há nenhum furo. Coloque o tecido claro na câmara de montagem pré-preenchido com solução de correspondência de índice refrativo. Montar o tecido com segurança colocando uma mancha de vidro em cima e selando-o com esmalte.
Imagem deste tecido adicionando uma gota de índice de refração combinando solução de montagem diretamente em cima do vidro. Para construir uma grande câmara de imagem tecidual para tecidos com mais de cinco milímetros de espessura, use uma antena de vidro de 10 centímetros com uma parede alta. Coloque um tubo cônico de 50 mililitros no centro, certificando-se de que o diâmetro do tubo é grande o suficiente para aceitar o barril da lente objetiva utilizada.
Faça 3% de agarose na água e despeje-o no espaço entre o prato de vidro e o tubo cônico, em seguida, deixe esfriar por uma hora. Isso formará um anel de agarose sólida. Adere firmemente o tecido ao fundo da câmara usando super cola e encha a câmara com solução de correspondência de índice refrativo, que pode começar a polimerizar a menos que seja preservada do ar e armazenada a quatro graus Celsius.
Adquira a imagem usando um microscópio confocal. Ligue todos os equipamentos de imagem relevantes. Coloque a amostra no palco.
Aproxime cuidadosamente os meios de comunicação de imersão com o objetivo e forme uma coluna contínua de mídia. Usando epifluorescência, encontre um campo de imagem apropriado. Comece definindo as configurações de resolução e digitalização de velocidade.
Se a imagem usar um microscópio confocal, feche totalmente o pinhole para obter a menor seção óptica e, portanto, a melhor resolução Z. Aumente gradualmente a potência do laser ou o ganho do sensor até que uma imagem adequada seja obtida com uma alta relação sinal-ruído. Se utilizar imagens padrão de EGFP ou tdTomato de duas cores, defina as configurações da coleta de luz.
Defina os parâmetros de pilha Z com base nos pontos de partida e extremidade observados do tecido. Defina o tamanho da etapa com base na resolução Z desejada. Tamanhos de passo menores produzirão uma resolução Z maior, mas podem levar ao branqueamento amostral.
Quando estiver satisfeito com as configurações de aquisição de imagens, adquira a imagem. Certifique-se de que a imagem tem uma alta relação sinal-ruído e mostra limites distintos de estruturas. Após a aquisição de imagens, a morfologia celular representativa foi analisada utilizando estatísticas incorporadas e classificando scripts dentro do software de análise.
Os dados coletados refletem que o Neurônio 2 tem estrutura maior que a dendrítica com maior densidade de espinhas em comparação com o Neurônio 1. Para comprovar esse resultado, foi realizada a análise padrão de Scholl, que afirma que o Neurônio 2 é mais dendriticamente complexo que o Neurônio 1, conforme denotado pelo aumento do número de intersecções de Scholl a 50 a 100 micrômetros da soma. O neurônio 1 contém uma proporção maior de espinhas com formas mais filopodia e é um subtipo imaturo da coluna vertebral.
Espinhos com cabeças definidas, chamadas espinhos de cogumelo, provavelmente contêm sinapses mais desenvolvidas e maduras. Assim, o Neurônio 2 é mais maduro com maior densidade de espinhas maduras. Após a limpeza, os pedaços de tecido podem ser manchados usando a imunohistoquímica tradicional.
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Visão Geral
Este artigo apresenta um protocolo detalhado para processamento, visualização e análise de fatias espessas de tecido neural marcado utilizando a técnica de clareamento de tecidos CLARITY, microscopia confocal e análise de imagem. O método permite a obtenção de imagens de alta resolução de morfologias neuronais profundas em tecido cerebral tridimensional intacto, facilitando o estudo da conectividade neuronal e da organização de subestruturas em estados saudáveis e patológicos.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Tecnologia de Imagem
- Neuroanatomia
Contexto
- A atividade cerebral é determinada pela conectividade e morfologia neuronais.
- Os avanços em imagem e clareamento de tecidos melhoraram a capacidade de estudar fatias cerebrais espessas com alta resolução.
- O CLARITY permite a visualização de estruturas neuronais profundas dentro do tecido.
- Softwares de processamento de imagens permitem análise rápida de grandes conjuntos de dados.
Objetivo do Estudo
- Fornecer um protocolo reprodutível para clareamento, imageamento e análise de fatias espessas de tecido neural.
- Facilitar o estudo de padrões de conectividade neuronal e morfologias.
- Permitir a comparação de tecido cerebral saudável e doente ao nível morfológico.
Métodos Utilizados
- Embebição em hidrogel e incubação sob vácuo de tecido cerebral.
- Clareamento de tecido por eletroforese usando tampão SDS.
- Equalização do índice de refração e montagem para imagem.
- Microscopia confocal para obtenção de imagens de alta resolução.
- Análise de imagens incluindo análise de Scholl e classificação de espinhos.
Resultados Principais
- O protocolo permite a visualização clara de morfologias neuronais profundas dentro do tecido.
- O Neurônio 2 exibiu uma estrutura dendrítica mais complexa e maior densidade de espinhos maduros (em forma de cogumelo) em comparação com o Neurônio 1.
- O Neurônio 1 possuía mais espinhos imaturos semelhantes a filópodes.
- A análise de Scholl confirmou maior complexidade dendrítica no Neurônio 2.
- O método é simples e reprodutível para usuários iniciantes.
Conclusões
- Este protocolo permite uma análise morfológica detalhada de neurônios em tecido cerebral espesso.
- Ele auxilia estudos sobre conectividade e maturação neuronal.
- A abordagem é acessível e pode ser adotada por pesquisadores novos na área de clareamento e imagem de tecidos.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A imagem de alta resolução de dendritos neuronais intactos utilizando o método de clareamento de tecidos CLARITY permite uma análise morfológica detalhada, essencial para a descoberta precoce de fármacos em neurociência. Esta abordagem aumenta a confiança preditiva na validação de alvos ao revelar padrões de conectividade e alterações em subestruturas relevantes para modelos de doenças. A integração de fluxos de trabalho reprodutíveis de imagem 3D fortalece a continuidade translacional, desde a descoberta até a pesquisa pré-clínica.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a investigação da conectividade neuronal e da organização espacial em tecido intacto.
- Apóia a validação funcional de alvos mediante a quantificação da complexidade dendrítica e da maturação de espinhos.
- Facilita a redução de riscos mecanicistas por meio da visualização direta de alterações neuronais relevantes para a doença.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Prepara sistemas de tecido neural 3D validados para triagem de compostos posteriores.
- Padroniza protocolos de imagem e análise para obter saídas quantitativas reprodutíveis.
- Permite avaliação escalonável da morfologia neuronal para prontidão em triagem.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha leituras morfológicas com biomarcadores relevantes para a doença em modelos pré-clínicos.
- Proporciona continuidade do imaging de descoberta até a validação pré-clínica de desfechos neuronais.
- Apoia decisões de avanço ajustadas ao risco com base em dados estruturais quantitativos.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este método integra-se ao continuum de descobertas em neurociência, conectando a validação inicial de alvos, triagem fenotípica e avaliação de modelos pré-clínicos.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses e a clarificação de vias ao visualizar redes neuronais intactas.
- Triagem: Fornece saídas de imagem quantitativas e reprodutíveis para avaliação de compostos.
- Análises: Oferece medidas estatísticas, como análise de Scholl e classificação de espinhos, para comparação de condições.
- Pesquisa Translacional: Relaciona alterações morfológicas a modelos de doenças e estratégias de biomarcadores.
- Reutilização Empresarial: Estabelece um fluxo de trabalho padronizado e reutilizável de imagem e análise para equipes de P&D em neurociência.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a ambiguidade mecanicista na validação de alvos neuronais.
- Valor Operacional: Promove padronização, reprodutibilidade e escalabilidade no imageamento de tecidos tridimensionais.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de avançar/não avançar e a eficiência do capital ao fornecer desfechos morfológicos robustos.
- Impacto na Carteira: Permite a priorização e o avanço ajustados ao risco de ativos em neurociência.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em clareamento de tecidos, microscopia confocal e software de análise de imagens.
- Necessita de acesso a incubadoras a vácuo, câmaras de eletroforese e plataformas de imagem de alta resolução.
- Exige padronização entre equipes nos protocolos de preparação de amostras e aquisição de imagens.
- Adaptável a diversos modelos de tecido neural e estratégias de marcação.
- Depende da obtenção de clareamento tecidual suficiente e relação sinal-ruído adequada para quantificação confiável.
