Imagem e quantificação de dendritos neuronais intactos via clareza de tecido
April 20th, 2021
A morfologia dendrítica neuronal muitas vezes está por trás da função. De fato, muitos processos de doenças que afetam o desenvolvimento de neurônios se manifestam com um fenótipo morfológico. Este protocolo descreve um método simples e poderoso para analisar arbores dendríticas intactas e suas espinhas associadas.
Este protocolo permitirá que os pesquisadores respondam a perguntas importantes sobre padrões neuronais de conectividade e organização espacial que fundamentam a função dentro de um circuito. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite a visualização de morfologias neuronais localizadas profundas dentro do tecido tridimensional intacto. Este método é simples e, portanto, facilmente reproduzível.
Os experimentadores iniciantes devem estar confortáveis em executar esta técnica. É imprescindível ter uma amostra de tecido claro para obter dados de alta qualidade. A demonstração visual de técnicas adequadas de clareza tecidual e de compensação permitirá resultados facilmente reprodutíveis.
Para começar, coloque o tecido cerebral submerso de hidrogel em uma incubadora de vácuo por três horas a 37 graus Celsius com menos 90 quilopascal de vácuo. Deixe a parte superior do tubo desparafusada para permitir que o vácuo se forme corretamente. Lave o tecido com PBS por 10 minutos em temperatura ambiente com agitação suave.
Coloque a amostra de tecido polimerizado na câmara de eletroforese, acompanhando a orientação do tecido dentro da câmara. Encha a câmara e o reservatório com o tampão SDS de eletroforese fornecido. Execute a amostra a 70 volts, um ampere e 35 graus Celsius com corrente constante por cerca de duas horas por mililitro de tecido.
Verifique periodicamente a amostra quanto a limpeza do tecido cerebral, removendo-a da câmara e substituindo-a na mesma orientação. Depois que a amostra terminar de limpar, lave-a em PBS durante a noite à temperatura ambiente, substituindo o PBS por PBS fresco o mais frequentemente possível. Após a lavagem final na PBS, lave o tecido por cinco minutos em água deionizada à temperatura ambiente três vezes.
O tecido ficará opaco e pode se expandir. Incubar o tecido na solução de correspondência de índices de refração por pelo menos quatro horas em temperatura ambiente. Durante a incubação, construa uma câmara de habitação adequada para a imagem da amostra.
Comece usando um slide de vidro como base para montagem, em seguida, deite borracha ou espaçadores plásticos e fixe-os com super cola, certificando-se de que não há nenhum furo. Coloque o tecido claro na câmara de montagem pré-preenchido com solução de correspondência de índice refrativo. Montar o tecido com segurança colocando uma mancha de vidro em cima e selando-o com esmalte.
Imagem deste tecido adicionando uma gota de índice de refração combinando solução de montagem diretamente em cima do vidro. Para construir uma grande câmara de imagem tecidual para tecidos com mais de cinco milímetros de espessura, use uma antena de vidro de 10 centímetros com uma parede alta. Coloque um tubo cônico de 50 mililitros no centro, certificando-se de que o diâmetro do tubo é grande o suficiente para aceitar o barril da lente objetiva utilizada.
Faça 3% de agarose na água e despeje-o no espaço entre o prato de vidro e o tubo cônico, em seguida, deixe esfriar por uma hora. Isso formará um anel de agarose sólida. Adere firmemente o tecido ao fundo da câmara usando super cola e encha a câmara com solução de correspondência de índice refrativo, que pode começar a polimerizar a menos que seja preservada do ar e armazenada a quatro graus Celsius.
Adquira a imagem usando um microscópio confocal. Ligue todos os equipamentos de imagem relevantes. Coloque a amostra no palco.
Aproxime cuidadosamente os meios de comunicação de imersão com o objetivo e forme uma coluna contínua de mídia. Usando epifluorescência, encontre um campo de imagem apropriado. Comece definindo as configurações de resolução e digitalização de velocidade.
Se a imagem usar um microscópio confocal, feche totalmente o pinhole para obter a menor seção óptica e, portanto, a melhor resolução Z. Aumente gradualmente a potência do laser ou o ganho do sensor até que uma imagem adequada seja obtida com uma alta relação sinal-ruído. Se utilizar imagens padrão de EGFP ou tdTomato de duas cores, defina as configurações da coleta de luz.
Defina os parâmetros de pilha Z com base nos pontos de partida e extremidade observados do tecido. Defina o tamanho da etapa com base na resolução Z desejada. Tamanhos de passo menores produzirão uma resolução Z maior, mas podem levar ao branqueamento amostral.
Quando estiver satisfeito com as configurações de aquisição de imagens, adquira a imagem. Certifique-se de que a imagem tem uma alta relação sinal-ruído e mostra limites distintos de estruturas. Após a aquisição de imagens, a morfologia celular representativa foi analisada utilizando estatísticas incorporadas e classificando scripts dentro do software de análise.
Os dados coletados refletem que o Neurônio 2 tem estrutura maior que a dendrítica com maior densidade de espinhas em comparação com o Neurônio 1. Para comprovar esse resultado, foi realizada a análise padrão de Scholl, que afirma que o Neurônio 2 é mais dendriticamente complexo que o Neurônio 1, conforme denotado pelo aumento do número de intersecções de Scholl a 50 a 100 micrômetros da soma. O neurônio 1 contém uma proporção maior de espinhas com formas mais filopodia e é um subtipo imaturo da coluna vertebral.
Espinhos com cabeças definidas, chamadas espinhos de cogumelo, provavelmente contêm sinapses mais desenvolvidas e maduras. Assim, o Neurônio 2 é mais maduro com maior densidade de espinhas maduras. Após a limpeza, os pedaços de tecido podem ser manchados usando a imunohistoquímica tradicional.
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Visão Geral
Este estudo apresenta um método para analisar arborizações dendríticas neuronais e espinhos dentro de tecido cerebral tridimensional intacto. Ele enfatiza a importância da morfologia dendrítica na função neuronal e sua relevância para vários processos de doenças. Ao utilizar um protocolo simples, os pesquisadores podem visualizar conexões neuronais e organização espacial de forma eficaz.
Componentes-Chave do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Morfologia Neuronal
- Análise Dendrítica
Fundamentos
- A morfologia dendrítica é crucial para a função neuronal.
- Doenças podem manifestar fenótipos morfológicos em neurônios.
- Entender padrões de conectividade é essencial para estudar circuitos.
- As técnicas existentes podem carecer de profundidade de visualização em tecidos tridimensionais.
Propósito do Estudo
- Fornecer um método reproduzível para visualizar a morfologia neuronal.
- Permitir a análise de estruturas dendríticas em profundidade dentro do tecido intacto.
- Auxiliar pesquisadores no estudo da conectividade e organização neuronal.
Métodos Utilizados
- O estudo utiliza tecido cerebral tridimensional intacto.
- Os pesquisadores identificam a clareza do tecido como crucial para imagens de alta qualidade.
- Etapas-chave incluem incubação a vácuo e eletroforese para clarificação do tecido.
- A imagem é realizada usando microscopia confocal com configurações específicas para resolução.
Principais Resultados
- Os resultados mostram diferenças na complexidade dendrítica entre neurônios, conforme analisado com interseções de Scholl.
- Os neurônios exibiram densidade e tipos de espinhos variáveis, indicando diferenças de maturidade.
- As descobertas sugerem como a morfologia neuronal reflete estados funcionais e de desenvolvimento.
Conclusões
- Este método permite uma análise detalhada da morfologia neuronal, permitindo insights sobre a conectividade.
- Ele melhora a compreensão das estruturas dendríticas relacionadas à saúde e doença neuronal.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
High-resolution imaging of intact neuronal dendrites using CLARITY tissue clearing enables detailed morphological analysis critical for early neuroscience drug discovery. This approach supports predictive confidence in target validation by revealing connectivity patterns and substructure changes relevant to disease models. Integrating reproducible 3D imaging workflows strengthens translational continuity from discovery through preclinical research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of neuronal connectivity and spatial organization in intact tissue.
- Supports functional target validation by quantifying dendritic complexity and spine maturation.
- Facilitates mechanistic de-risking through direct visualization of disease-relevant neuronal changes.
Screening & Assay Development
- Prepares validated 3D neural tissue systems for downstream compound screening.
- Standardizes imaging and analysis protocols for reproducible quantitative outputs.
- Enables scalable assessment of neuronal morphology for screening readiness.
Translational & Preclinical Research
- Aligns morphological readouts with disease-relevant biomarkers in preclinical models.
- Provides continuity from discovery imaging to preclinical validation of neuronal endpoints.
- Supports risk-adjusted advancement decisions based on quantitative structural data.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the neuroscience discovery continuum, bridging early target validation, phenotypic screening, and preclinical model assessment.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by visualizing intact neuronal networks.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative imaging outputs for compound evaluation.
- Analytics: Provides statistical measurements such as Scholl analysis and spine classification for condition comparison.
- Translational Research: Connects morphological changes to disease models and biomarker strategies.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized, reusable imaging and analysis workflow for neuroscience R&D teams.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in neuronal target validation.
- Operational Value: Promotes standardization, reproducibility, and scalability in 3D tissue imaging.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by providing robust morphological endpoints.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of neuroscience assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue clearing, confocal microscopy, and image analysis software.
- Needs access to vacuum incubators, electrophoresis chambers, and high-resolution imaging platforms.
- Demands cross-team standardization of sample preparation and imaging protocols.
- Adaptable to various neural tissue models and labeling strategies.
- Dependent on achieving sufficient tissue clarity and signal-to-noise for reliable quantification.
