Name: Perfil da modificação H3K4me3 em plantas usando decote sob alvos e tagmentação (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 48 s
Description: Aprenda o método CUT&Tag refinado para perfilamento epigenômico em plantas usando folhas de algodão. Esta técnica permite analisar modificações de histonas como H3K4me3 com alta eficiência e resolução.

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Este trabalho foi apoiado financeiramente em parte por subsídios da Fundação Nacional de Ciência Natural da China (NSFC, 31900395, 31971985, 31901430), e fundos de pesquisa fundamental para as Universidades Centrais, Hainan Yazhou Bay Seed Lab (JBGS, B21HJ0403), Hainan Provincial Natural Science Foundation of China (320LH002) e projeto JCIC-MCP.

1. Prepare soluções de transposase e estoque (Dia 1)
NOTA: Nesta parte, os adaptadores de oligonucleotídeos são complexos com transposase Tn5 para fazer transposase ativa.
<ol><li>Primers diluídos (primer A, primer B e primer C) a 100 μM de concentração usando o buffer de renascimento (10 mM Tris pH 8.0, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA) (consulte a Tabela 1 para obter informações sequenciais de primers e Tabela 2 para as receitas para soluções de trabalho). Armazenar a -20 °C até usar.</li>
	<li>Configure as seguintes reações em tubos PCR: Reaction 1 (adaptador AB), 10 μL de 100 μM primer A, 10 μL de 100 μM primer B; Reação 2 (adaptador AC), 10 μL de 100 μM primer A, 10 de μL 100 μM primer C.</li>
	<li>Enrilhar os adaptadores na máquina PCR utilizando o seguinte programa: tampa de calor (102 °C), 75 °C para 15 min, 60 °C para 10 min, 50 °C para 10 min, 40 °C para 10 min, 25 °C por 30 min. NOTA: Os adaptadores são moléculas de DNA parcialmente duplas (concentração = 50 pmol/μL).</li>
	<li>Configure a seguinte reação em um tubo de centrífuga de 1,5 mL: 10 μL de transposase pA-Tn5 (500 ng/μL ou 7,5 pmol/μL), 0,75 μL do adaptador AB (50 pmol/μL), 0,75 μL do adaptador AC (50 pmol/μL), 7 μL de tampão de acoplamento. Pipeta 20x suavemente para misturar bem e incubar a 30 °C em um banho de água por 1h. A concentração final de transposase = 4 pmol/μL. Armazenar a -20 °C até usar. NOTA: Molar razão do adaptador AB: adaptador AC: transposase = 0,5:0.5:1.</li>
	<li>Prepare as soluções de estoque de acordo com as receitas fornecidas na Tabela 2 e autoclave ou filtre as soluções de estoque para esterilizar.</li>
	<li>Autoclave e esterilizar tesouras, papel filtro, uma peneira de aço inoxidável, uma argamassa, pilões, etc.</li>
</ol>2. Isolamento dos núcleos (Dia 2)
<ol><li>Pré-esfrie a centrífuga a 4 °C. Para cada 1 g do material inicial (folhas de algodão), prepare 25 mL de tampão de isolamento nuclear A (10 mM Tris pH 8.0, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA), 20 mL de tampão de isolamento nuclear B (10 mM Tris pH 8.0, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA), 50 mL de tampão de lavagem nuclear (10 mM Tris pH 8.0, 150 mM NaCl, 0,5 mM espermidina, coquetel inibidor protease 0,1%), 1 mL de tampão de anticorpos (50 mM Tris pH 8.0, 1 mM EDTA, 150 mM NaCl, 0,5 mM de espermidina, 1 mg/mL BSA, coquetel inibidor de prote 0,1%, 0,05% w/vonina). Deixe os tubos sentarem no gelo até usar.</li>
	<li>Triture folhas frescas (~1 g) em nitrogênio líquido para um pó fino e transfira para um tubo de 50 mL contendo 25 mL de tampão de isolamento nuclear refrigerado A.</li>
	<li>Misture a solução tampão suavemente e incuba o tubo no gelo por 5 minutos com agitação suave para dispersar o material uniformemente.</li>
	<li>Centrifugar por 5 min a 500 rcf a 4 °C para formar a pelota celular.</li>
	<li>Decante o supernaspe e resuspenque a pelota com 20 mL de tampão de isolamento nuclear refrigerado B complementado com 0,5% Triton X-100. Inverta o tubo suavemente para resuspensar a pelota completamente. NOTA: O buffer de isolamento nuclear B de 20 mL é aplicável para 1 g de material de partida, e este volume pode ser dimensionado de acordo.<ol>
<li>Realize um ensaio piloto para testar o efeito da concentração em série de Triton X-100 (por exemplo, 2 mL tampão de isolamento nuclear B, cada um com 0,1%, 0,25%, 0,5% e 1% Triton X-100 para 100 mg de tecidos triturados). A concentração apropriada de Triton X-100 é indicada por um acúmulo de núcleos brancos/cinzentos na parte inferior e um supernatante verde escuro após lise e centrifugação em baixa velocidade (< 500 rcf por 4 min).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Filtre o lise celular resultante com uma combinação de duas peneiras: uma peneira de 500 malhas na parte superior para remover os detritos de tecido maiores e uma peneira de 1000 malhas na parte inferior para coletar os núcleos. NOTA: Escolha um tamanho de malha adequado para as peneiras, dependendo do tamanho dos núcleos das plantas.</li>
	<li>Use papel filtro estéril na parte de trás da peneira para absorver detritos de pequenas células no lise.</li>
	<li>Transfira os núcleos restantes contendo liseto na parte superior da peneira de 1000 malhas para quatro tubos frescos de centrífuga de 1,5 mL.</li>
	<li>Centrifugar por 4 min a 300 rcf a 4 °C para coletar os núcleos.</li>
	<li>Remova o máximo possível do supernatante usando uma ponta de pipeta e lave a pelota com tampão de lavagem nuclear.</li>
	<li>Adicione 800 μL do tampão de lavagem nuclear e inverta os tubos suavemente para resuspensar a pelota. Gire o tubo novamente por 4 min a 300 rcf a 4 °C.</li>
	<li>Realize um total de 3 lavagens.</li>
	<li>(Opcional) Imagem dos núcleos sob um microscópio para coloração DAPI.<ol>
<li>Transfira 100 μL de suspensão de núcleos no tampão de lavagem nuclear a partir da etapa 2.11. para um novo tubo de 1,5 mL. Adicione 900 μL de tampão de lavagem nuclear e 2 μL de solução de estoque DAPI (1 mg/mL) para fazer uma concentração final de trabalho de 2 μg/mL para DAPI. Incubar o tubo no escuro por 30 minutos à temperatura ambiente.</li>
		<li>Após a coloração, centrífuga por 4 min a 300 rcf a 4 °C para coletar os núcleos.</li>
		<li>Remova o máximo possível do supernatante usando uma ponta de pipeta. Lave 3 vezes com 800 μL do tampão de lavagem nuclear.</li>
		<li>Remova o máximo possível do supernasciente e resuspenja os núcleos com 100 μL de tampão de lavagem nuclear.</li>
		<li>Imagem dos núcleos sob um microscópio de fluorescência usando o canal DAPI.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Misture os núcleos de dois tubos (~50 μL de núcleos em volume em cada tubo de 1,5 mL). Centrifugar por 4 min a 300 rcf a 4 °C. Remova o máximo possível do buffer restante usando uma ponta de pipeta.</li>
</ol>3. Incubação de anticorpos
<ol><li>Resuspend cada 50 μL de núcleos em um tubo de 1,5 mL com 1 mL de tampão de anticorpos.</li>
	<li>Configure as seguintes reações em tubos de 1,5 mL: duas réplicas biológicas de grupos de controle de IgG com 150 μL de núcleos (~ 1 μg de cromatina) e 2 μL de IgG (1 mg/mL) em cada tubo, duas réplicas biológicas de grupos de ensaio H3K4me3 com 150 μL de núcleos e 2 μL de anticorpo anti-H3K4me3 (1 mg/mL) em cada tubo.</li>
	<li>Misture a solução suavemente e deixe os tubos em um agitador horizontal para hibridização durante a noite a 4 °C e 12 rpm.</li>
	<li>Pré-esfrie a centrífuga a 4 °C. Prepare um tampão de lavagem fresco de 50 mL de imunoprecipitação (IP) (10 mM Tris pH 8.0, 150 mM NaCl, 0,5 mM de espermidina, coquetel inibidor de protease 0,1%, ,0,05% w/v digitonin) em um tubo de centrífugas de 50 mL. Deixe o tubo sentar no gelo.</li>
	<li>Centrifugar os tubos por 4 min a 300 rcf a 4 °C. Remova o tampão de anticorpos de cada tubo.</li>
	<li>Adicione 800 μL de tampão de lavagem IP em cada tubo e misture delicadamente. Deixe os tubos em um agitador horizontal por 5 minutos em temperatura ambiente e 12 rpm.</li>
	<li>Após a lavagem, centrifufique os tubos por 4 min a 300 rcf a 4 °C. Remova o supernatante usando uma ponta de pipeta. NOTA: Para evitar qualquer perturbação da pelota dos núcleos, deixe ~50-80 μL do buffer com os núcleos.</li>
	<li>Repetição passos 3.6.-3.7. mais duas vezes.</li>
	<li>Após a terceira lavagem, centrífuga por 2 min a 300 rcf a 4 °C. Remova o buffer restante o máximo possível.</li>
</ol>4. Incubação transposase
<ol><li>Faça fresco 1 mL de tampão de incubação transposase (10 mM Tris pH 8.0, 300 mM NaCl, 0,5 mM de espermidina, coquetel inibidor de protease 0,1%, 0,05% w/v digitonin) misturando 1 mL do tampão de lavagem IP com 30 μL de 5 M NaCl.</li>
	<li>Para preparar o mix de transposase Tn5 para incubação, adicione 1 μL da transposase a cada 150 μL do tampão de incubação transposase. NOTA: Prepare o mix de solução transposase primeiro de acordo com o número de reações e, em seguida, adicione uma alíquota de 150 μL a cada tubo.</li>
	<li>Resuspend os núcleos com 150 μL de solução transposase.</li>
	<li>Deixe os tubos em um agitador horizontal a 12 rpm por 2-3 h em temperatura ambiente e misture a cada 10-15 min.</li>
	<li>Após a incubação da transposição, centrifugar os tubos por 4 min a 300 rcf a 4 °C. Remova o tampão de incubação transposase em cada tubo.</li>
	<li>Lave os tubos com tampão de lavagem IP. Para isso, adicione 800 μL de tampão de lavagem IP em cada tubo, misture suavemente e deixe os tubos em um agitador horizontal a 12 rpm por 5 min à temperatura ambiente.</li>
	<li>Centrifugar por 4 min a 300 rcf a 4 °C. Remova o supernatante usando uma ponta de pipeta.</li>
	<li>Repetição passos 4.6.-4.7. mais duas vezes.</li>
	<li>Após a terceira lavagem, centrífuga por 2 min a 300 rcf a 4 °C. Remova o buffer restante o máximo possível.</li>
</ol>5. Tagmentação
<ol><li>Faça recentemente 2 mL do buffer de tagmentação (10 mM Tris pH 8.0, 300 mM NaCl, 0,5 mM de espermidina, coquetel inibidor de protease 0,1%, 10 mM MgCl2, 0,05% w/v digitonin) misturando 2 mL de tampão de lavagem IP com 60 μL de 5 M NaCl e 20 μL de 1 M MgCl2.</li>
	<li>Resuspenda os núcleos com 300 μL de tampão de tagmentação.</li>
	<li>Misture a solução e incuba em um banho de água de 37 °C por 1h para tagmentação.</li>
	<li>Pare a tagmentação com 10 μL de 0,5 M EDTA (concentração final ~15 mM) e 30 μL de 10% SDS (concentração final 1%).</li>
</ol>6. Extração de DNA e construção de biblioteca NGS
<ol><li>Adicione 300 μL de tampão de extração de DNA CTAB conforme descrito7. Incubar os tubos em um banho de água de 65 °C por 30 minutos. Inverta para misturar cada ~10 min.</li>
	<li>Adicione 600 μL de fenol: clorofórmio: álcool isoamyl (25:24:1) a cada tubo. Homogeneizar.</li>
	<li>Pré-centrifugar os tubos de gel de bloqueio de fase por 2 min a 13.000 rcf a 4 °C. Transfira a solução acima para tubos de gel de bloqueio de fase.</li>
	<li>Centrifugar por 10 min a 13.000 rcf a 4 °C.</li>
	<li>Transfira o supernatante (~600 μL) para um novo tubo de 1,5 mL.</li>
	<li>Adicione 600 μL de clorofórmio a cada tubo. Homogeneizar.</li>
	<li>Centrifugar por 10 min a 13.000 rcf a 4 °C.</li>
	<li>Transfira o supernante (~600 μL) para um novo tubo de 1,5 ml.</li>
	<li>Adicione 12 μL de 100% de etanol e 2 μL de GlycoBlue Coprecipitant. Misture bem e armazene a -20 °C por 1h.</li>
	<li>Centrifugar por 10 min a 13.000 rcf a 4 °C.</li>
	<li>Decantar o supernatante. Lave a pelota de DNA usando 75% (v/v) etanol e centrífuga por 5 min a 13.000 rcf a 4 °C.</li>
	<li>Decantar o supernatante. Seque a pelota de DNA e resuspenja o DNA em 25 μL de ddH2O.</li>
	<li>Configure a reação do PCR da seguinte forma. Para um total de 50 μL de reação, adicione 24 μL de DNA, 11 μL de ddH2O, 10 μL de tampão TAE 5x, 2 μL de primer P5 (10 μM), 2 μL de primer P7 (10 μM) e 1 μL de Enzima Amplify TruePrep Amplify. Programa PCR: 72 °C para 3 min, 98 °C para 30 s; em seguida, 14 ciclos de 98 °C para 30 s, 60 °C para 30 s e 72 °C para 30 s, seguido por 72 °C para 5 min. NOTA: Os primeiros 72 °C para 3 min de extensão não podem ser ignorados. A superamplificação da biblioteca levará a um alto nível de duplicatas pcr no NGS. Comece a partir de 12-14 ciclos PCR em reação PCR para H3K4me3 ao usar ~1 μg de cromatina em cada reação.</li>
	<li>Carregar 2 μL dos produtos PCR em gel de 1,5% de agarose para eletroforese.</li>
	<li>Purifique os produtos PCR usando contas magnéticas de purificação de DNA comercial.</li>
	<li>Quantifique a biblioteca com um fluorômetro e eletroforese de gel de agarose. NOTA: A concentração efetiva da biblioteca deve ser >2 nM por qPCR para garantir uma boa qualidade.</li>
	<li>Realizar sequenciamento de próxima geração (NGS) e análise de dados.</li>
</ol>

<ol><li>Abascal, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perspectives+on+ENCODE%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Perspectives on ENCODE.</a> Nature. 583 (7818), 693-698 (2020).</li>
<li>Park, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-seq%3A+advantages+and+challenges+of+a+maturing+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology.</a> Nature Reviews Genetics. 10 (10), 669-680 (2009).</li>
<li>Kaya-Okur, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CUT%26Tag+for+efficient+epigenomic+profiling+of+small+samples+and+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">CUT&Tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells.</a> Nature Communications. 10 (1), 1930(2019).</li>
<li>Tao, X., Feng, S., Zhao, T., Guan, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+chromatin+profiling+of+H3K4me3+modification+in+cotton+using+CUT%26Tag%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">Efficient chromatin profiling of H3K4me3 modification in cotton using CUT&Tag.</a> Plant Methods. 16, 120(2020).</li>
<li>Kaya-Okur, H. S., Janssens, D. H., Henikoff, J. G., Ahmad, K., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+low-cost+chromatin+profiling+with+CUT%26Tag%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Efficient low-cost chromatin profiling with CUT&Tag.</a> Nature Protocols. 15 (10), 3264-3283 (2020).</li>
<li>Bartosovic, M., Kabbe, M., Castelo-Branco, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+CUT%26Tag+profiles+histone+modifications+and+transcription+factors+in+complex+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Single-cell CUT&Tag profiles histone modifications and transcription factors in complex tissues.</a> Nature Biotechnology. , (2021).</li>
<li>Paterson, A. H., Brubaker, C. L., Wendel, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+method+for+extraction+of+cotton+%28Gossypium+spp.%29+genomic+DNA+suitable+for+RFLP+or+PCR+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Molecular+Biology+Reporter%22%5BJournal%5D)">A rapid method for extraction of cotton (Gossypium spp.) genomic DNA suitable for RFLP or PCR analysis.</a> Plant Molecular Biology Reporter. 11 (2), 122-127 (1993).</li>
<li>Haring, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+immunoprecipitation%3A+optimization%2C+quantitative+analysis+and+data+normalization%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">Chromatin immunoprecipitation: optimization, quantitative analysis and data normalization.</a> Plant Methods. 3 (1), 11(2007).</li>
<li>Ouyang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+low-input+profiling+of+histone+marks+in+plants+using+nucleus+CUT%26Tag%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Rapid and low-input profiling of histone marks in plants using nucleus CUT&Tag.</a> Frontiers in Plant Science. 12, 634679(2021).</li>
<li>Swift, J., Coruzzi, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+matter+of+time+-+How+transient+transcription+factor+interactions+create+dynamic+gene+regulatory+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29+-+Gene+Regulatory+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">A matter of time - How transient transcription factor interactions create dynamic gene regulatory networks.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Gene Regulatory Mechanisms. 1860 (1), 75-83 (2017).</li>
<li>Buenrostro, J. D., Wu, B., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATAC-seq%3A+a+method+for+assaying+chromatin+accessibility+genome-wide%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">ATAC-seq: a method for assaying chromatin accessibility genome-wide.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 109, 21-29 (2015).</li>
</ol>

Todos os autores não têm conflitos de interesse com qualquer empresa negociando um dos produtos mencionados acima.

Aqui, descrevemos a CUT&Tag, uma tecnologia para gerar bibliotecas de DNA em alta resolução e fundo excepcionalmente baixo usando um pequeno número de células com um procedimento simplificado em comparação com a imunoprecipitação de cromatina (ChIP). Nosso sucesso com o perfil H3K4me3 em folhas de algodão sugere que a CUT&Tag, que foi projetada pela primeira vez para células animais, também pode ser usada para células vegetais. Tanto o sistema tampão Tris comumente usado para o ensaio ChIP8 quanto...

Os locais de DNA de ligação do fator de transcrição e a cromatina aberta associadas às marcas de modificação de histona servem papéis funcionais críticos na regulação da expressão genética e são os principais focos da pesquisa epigenética1. Convencionalmente, o ensaio de imunoprecipitação de cromatina (ChIP) juntamente com sequenciamento profundo (ChIP-seq) tem sido usado para a identificação em todo o genoma de modificação de histona cromatina específica ou alvos de DNA com proteínas específicas, e é amplamente adotado no campo da epigenética2. O decote sob alvos e a tecnologia de tagmentação (CUT&Tag) foi originalmente desenvolvido pelo Laboratório Henikoff para capturar os fragmentos de DNA afiliados à proteína em todo o genoma5. Quando comparado ao ChIP, a CUT&Tagcan gera bibliotecas de DNA em alta resolução e fundo excepcionalmente baixo usando um pequeno número de células com um procedimento simplificado3. Até o momento, foram estabelecidos métodos para análise de regiões de cromatina com modificações específicas de histona utilizando CUT&Tag em células animais4,5. Especificamente, cut&tag de célula única (scCUT&Tag) também foi desenvolvido com sucesso para tecidos humanos e células6. No entanto, devido à complexidade da parede celular e metabólitos secundários, a CUT&Tag ainda é tecnicamente desafiadora para tecidos vegetais.
Anteriormente, relatamos um protocolo CUT&Tag usando núcleos intactos isolados de folhas de algodão allotetraploid4. Para demonstrar a eficiência do isolamento dos núcleos e da captura de DNA utilizando tecido vegetal, o procedimento de criação de perfil é apresentado aqui. Os principais passos incluem isolamento de núcleos intactos, incubação in situ com o anticorpo para modificação de cromatina, incubação transposase, integração adaptadora e preparação da biblioteca de DNA. A solução de problemas se concentra na preparação da biblioteca CUT&Tag para o isolamento dos núcleos da planta e controle de qualidade.
Neste estudo, apresentamos uma estratégia refinada da CUT&Tag para plantas. Não só fornecemos um protocolo passo-a-passo para o perfil H3K4me3 em folhas de algodão, mas também fornecemos uma metodologia otimizada para o isolamento dos núcleos vegetais, incluindo a estratégia de seleção da concentração de detergente para a lise celular adequada e a estratégia de filtragem dos núcleos. Passos detalhados com comentários críticos também estão incluídos neste protocolo atualizado.

<table><tbody><tr><td><forte>Anticorpo</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-H3K4me3</td><td>Millipore</td><td>07-473</td><td></td></tr><tr><td>Coelho normal IgG</td><td>Millipore</td><td>12-370</td><td></td></tr><tr><td><forte>Produtos químicos</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino (BSA)</td><td></td><td></td><td>Faça 10 mg/ml de solução estoque de BSA. Armazene a -20&deg; D</td></tr><tr><td>digitonina (~50% (TLC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D141</td><td>Fazer solução estoque de digitonina a 5% (200 mg de digitonina [~50% de pureza] para 2 mL de DMSO). Nota: Esterilize usando um filtro de 0.22 mícron. Armazene a -20&deg; C</td></tr><tr><td>dimetilsulfóxido (DMSO)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>clorofórmio</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>etilenodiaminotetracético (EDTA)</td><td></td><td></td><td>Faça uma solução-mãe de EDTA 0,5 M (pH = 8,5). Nota: Fazer 100 mL de EDTA 0,5-M (pH = 8,5) requer aproximadamente 2 g de pellets de hidróxido de sódio (NaOH) para ajustar o pH</td></tr><tr><td>etanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coprecipitante GlycoBlue Coprecipitante (15 mg/mL)</td>Cloreto de magnésio <td>Invitrogen</td><td>AM9516</td><td></td></tr><tr><td>(MgCl2)</td><td></td><td></td><td>Fazer 1 M MgCl2 solução estoque</td></tr><tr><td>coquetel de inibidor de protease</td><td>Calbiochem</td><td>539133-1SET</td><td></td></tr><tr><td>cloreto de potássio (KCl)</td><td></td><td></td><td>Faça 1 M KCl solução estoque</td></tr><tr><td>fenol:clorofórmio:álcool isoamílico (25:24:1,v:v:v)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>cloreto de sódio (NaCl)</td><td></td><td></td><td>Faça 5 M NaCl solução estoque</td></tr><tr><td>espermidina</td><td></td><td></td><td>Faça 2 M solução estoque de espermidina, armazene a -20&deg;C.</td></tr><tr><td>dodecil sulfato de sódio (SDS)</td><td></td><td></td><td>Faça uma solução estoque de SDS a 10%. Nota: Não autoclave; esterilizar usando um filtro de 0,22 mícron</td></tr><tr><td>Base</td><td></td><td></td><td>Tris Faça 1 M Tris (pH = 8,0) solução estoque</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td></td><td></td><td>Faça 20% Triton X-100 solução estoque</td></tr> <tr><td>< forte > enzima < / forte ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>hiperativa pG-Tn5 / pA-Tn5 transposase para CUT & Tag</td><td>Vazyme</td><td>S602 / S603</td><td>Verifique a afinidade do anticorpo da proteína A ou proteína G que está fundida com o Tn5. De um modo geral, as proteínas A e G têm ampla afinidade com anticorpos. No entanto, a proteína A tem uma afinidade relativamente maior com os anticorpos de coelho e a proteína G tem uma afinidade relativamente maior com os anticorpos de camundongo. Selecione os produtos de transposase apropriados que correspondam ao seu anticorpo.</td></tr><tr><td>TruePrep Amplify Enzyme</td><td>Vazyme</td><td>TD601</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5424R</td><td></td></tr><tr><td>Máquina de PCR</td><td>Applied Biosystems</td><td>ABI9700</td><td></td></tr><tr><td>Agitador orbital</td><td>MIULAB</td><td>HS-25</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop One&nbsp; espectrofotômetro</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-UM-W</td><td></td></tr></tbody></table>

perfil da modificação h3k4me3 em plantas usando decote sob alvos e tagmentação

Profiling of H3K4me3 Modification in Plants using Cleavage under Targets and Tagmentation

Regulação epigenômica no nível cromático, incluindo modificações de DNA e histona, comportamentos de fatores de transcrição e RNAs não codificantes com suas proteínas recrutadas, levam ao controle temporal e espacial da expressão genética. O decote sob alvos e tagmentação (CUT&Tag) é um método de enzimática em que a proteína específica da cromatina é primeiro reconhecida por seu anticorpo específico, e então o anticorpo amarra uma proteína de fusão A-transposase (pA-Tn5), que corta a cromatina alvo in situ pela ativação de íons de magnésio. Aqui, fornecemos nosso protocolo CUT&Tag publicado anteriormente usando núcleos intactos isolados de folhas de algodão allortetraploid com modificação. Este protocolo passo a passo pode ser usado para pesquisa epigenômica em plantas. Além disso, modificações substanciais para o isolamento dos núcleos vegetais são fornecidas com comentários críticos.

A Figura 1 retrata o fluxo de trabalho CUT&amp;Tag. A Figura 2 mostra a coloração da DAPI dos núcleos intactos. O objetivo do passo do "isolamento dos núcleos" foi obter os núcleos intactos em uma quantidade suficiente para a reação subsequente da CUT&amp;Tag. A Figura 3 mostra a eletroforese de gel agarose dos produtos PCR. O controle negativo do IgG é necessário em paralelo ao configurar o experimento. Em comparação com o grupo de...

O decote sob metas e tagmentação (CUT&Tag) é uma estratégia eficiente de perfil epigenômico de cromatina eficiente. Este protocolo apresenta uma estratégia refinada da CUT&Tag para o perfil das modificações de histonas nas plantas.

Perfil da modificação H3K4me3 em plantas usando decote sob alvos e tagmentação

Epigenomic regulation at the chromatic level, including DNA and histone modifications, behaviors of transcription factors, and non-coding RNAs with their ...

O objetivo geral do experimento foi identificar fragmentos de DNA afiliados à proteína em todo o genoma, o que refletiu o status da cromatina. Para atingir esse objetivo, foram realizadas três operações especiais. Em primeiro lugar, os núcleos intactos das células vegetais foram isolados.Em segundo lugar, as modificações na cromatina foram reconhecidas por um anticorpo específico in situ. Em terceiro lugar, o anticorpo amarrando uma proteína de fusão de transposase, transposase Tn5, cutucar a cromatina in situ sob a ativação de íons de magnésio. Os fragmentos de DNA e os locais de ligação da modificação da cromatina foram então integrados com adaptadores e prontos para a preparação do DNA.O enriquecimento de reação em cadeia de polimerase melhorou o sequenciamento da geração. A regulação epigenômica no nível cromático, incluindo modificações de DNA e histona, comportamentos de fatores de transcrição e RNAs não codificantes com suas proteínas recrutadas, levam ao controle temporal e espacial da expressão genética. A tecnologia CUT&Tag desenvolvida pela Henikoff Lab é um método de tethering de enzimas para perfil epigenômico de cromatina com alta eficiência.Aqui empregamos as folhas de algodão como materiais experimentais, e para realizar o perfil de cromatina usando anticorpo de Histone H3 Lysine-4 Trimetilação como exemplo. Fornecemos um protocolo refinado com vídeo para desempenho da CUT&Tag em plantas. Para cada preparação amostral utilizando CUT&Tag, foram coletados gramas de tecido de folha de algodão.A folha foi moída em um pó fino com nitrogênio líquido, e transferida para um tubo falcão de 50 mL contendo 25 mL de tampão de isolamento nuclear refrigerado A.A solução tampão foi misturada suavemente, e o tubo foi incubado no gelo por cinco minutos com suave agitação para dispersar o material uniformemente. Foi então girado a 500 relativas da força centrífuga ou rcf, a 4 graus Celsius, por cinco minutos, para formar a pelota celular. O supernante foi decantado e a pelota foi resuspended com 20 mL de tampão de isolamento nuclear refrigerado B, complementado com 0,5% Triton.O tubo foi invertido suavemente para resuspensar a pelota completamente. O liseto celular resultante foi então filtrado com uma combinação de duas peneiras, uma peneira de 500 malhas foi usada em cima para remover os detritos de tecido maiores. E uma peneira de 1000 malhas foi usada na parte inferior para coletar os núcleos.A escolha do tamanho adequado da malha das peneiras depende do tamanho dos núcleos das plantas. O papel filtro estéril foi usado na parte de trás da peneira para absorver parte do lise e pequenos detritos celulares. O lysate contendo os núcleos foi transferido para um tubo de centrífuga fresco de 1,5 mililitros, e girou a 300 rcf por quatro minutos, a 4 graus Celsius graus Celsius para coletar os núcleos.Após a centrifugação, uma ponta de pipeta foi usada para remover o máximo possível do supernante. Uma quantidade de 800 microliters, um tampão de lavagem nuclear foi adicionado. E o tubo foi invertido suavemente para resuspensar os núcleos.O tubo foi girado novamente a 300 rcf, por quatro minutos a 4 graus Celsius. Após um total de três lavagens, os núcleos resultantes foram combinados em um tubo de centrífugas fresco de 1,5 mililitros, e girados a 300 rcf, por quatro minutos a 4 graus Celsius. Uma ponta de pipeta foi usada para remover o máximo possível do buffer restante.O passo seguinte foi a incubação do anticorpo. Uma alíquota de 50 microliters de núcleos foi resuspended em 1 mililitro de tampão de anticorpos suplementado com EDTA, BSA, coquetel inibidor de protease em digitonina. Uma alíquota de 150 microlitres da suspensão dos núcleos foi colocada em um tubo fresco de 1,5 mililitro para uma reação, dois microliters de anticorpos foram adicionados a cada tubo.Neste ensaio, duas réplicas biológicas para o anticorpo anti-histone-H3-Lysine-4-Trimethylation e grupos de controle negativos de imunoglobulina G foram criadas após a adição de anticorpos. A solução foi misturada suavemente, e os tubos foram deixados em um agitador horizontal para hibridização durante a noite a quatro graus Celsius em 12 rpm. Na manhã seguinte, os tubos foram retirados e os núcleos foram lavados usando 800 microliters de tampão de lavagem de imuno precipitação.O tubo foi invertido suavemente para mistura e foi deixado no agitador horizontal por cinco minutos à temperatura ambiente em 12 rpm. Após a lavagem, o tubo foi girado a 300 rcf por quatro minutos a quatro graus Celsius. Após a centrifugação, o supernatante foi removido usando uma ponta de pipeta.Isso se repetiu para um total de três lavagens. Após a terceira lavagem, o tubo foi girado a 300 rcf por dois minutos a quatro graus Celsius, e uma ponta de pipeta foi usada para remover o buffer restante o máximo possível. Para preparar a mistura de transposase Tn5 para incubação.Um microliter de transposase foi adicionado a cada 150 microlitres do buffer de incubação transposase. Recomendamos preparar o mix de solução transposase primeiro de acordo com o número de reações. E, em seguida, adicionar uma alíquota de 150 microliters a cada tubo.A solução foi misturada suavemente e deixada em um agitador horizontal à temperatura ambiente em 12 rpm por duas horas. Os tubos foram misturados suavemente a cada 10 a 15 minutos. Após a incubação, os núcleos foram lavados três vezes usando 800 microliters de tampão de lavagem de imuno precipitação à temperatura ambiente para remover a transposase Tn5 não ligada.Após a terceira lavagem, o tubo foi girado a 300 rcf por dois minutos a quatro graus Celsius, e uma ponta de pipeta foi usada para remover o tampão restante. Para a etapa de tagmentação, 300 microliters de tampão de tagmentação foram adicionados ao tubo de reação. A solução foi bem misturada e incubada a 37 graus Celsius por uma hora.Após a incubação foram adicionados 10 microliters de 0,5 mol por litro EDTA a 30 microliters de 10% SDS para determinar a reação. Os próximos 300 microliters de tampão de extração de DNA foram adicionados. Foi realizada extração irregular de DNA.Os fragmentos de DNA foram dissolvidos em 25 microlitres de água estéril. Foram utilizados 24 microliters para amplificação de PCR na construção de bibliotecas NGS. Esta figura mostra a mancha de núcleos intactos com DAPI em imagem, sob um microscópio obter uma quantidade adequada de núcleos intactos e relativamente limpos é o passo crítico para a CUT&Tag.Após a PCR, dois microlitres foram transferidos e o tamanho do DNA foi verificado em gel de 1,5%. Este número mostra que se compara com o controle negativo do gene da imunoglobulina. A maior parte dos fragmentos de DNA da amostra de Lysina 4 De Lysina 4 de Histone h3 deve variar de 280 a 500 pares de base.Os fragmentos de DNA podem ser purificados e, em seguida, perfilados por sequenciamento de alto rendimento. Este número mostra o sequenciamento de geração de resultados para o anticorpo anti-histone H3 Lysine 4 Trimetilação comparar com os grupos de controle negativos da imunoglobulina G. Esta tecnologia gera as bibliotecas de DNA em alta resolução e fundo excepcionalmente baixo usando um pequeno número de células com um procedimento simplificado em comparação com chip-seq.CUT&Tag é um novo método e ainda está em andamento.

profiling-h3k4me3-modification-plants-using-cleavage-under-targets

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Uma abordagem confiável e útil para detectar modificações das histonas em genes específicos de plantas é descrito. A abordagem combina cromatina imunoprecipitação (chip) e real-time PCR quantitativo. Ela permite a detecção de modificações das histonas em genes específicos, com um papel em diversos processos fisiológicos.

Detecção de histona Modificações nas folhas das plantas

Ao combinar nativa e reticulação da cromatina imunoprecipitação com alta resolução de Espectrometria de Massa, ChroP abordagem permite a dissecar a arquitectura proteómica composto de histonas modificações, variantes e proteínas não-histonic sinergia na cromatina domínios funcionalmente distintos.

A Abordagem ChroP Combina chip e Espectrometria de Massa dissecar proteômica Paisagens Locus específicas da cromatina

Nós fornecemos aqui um protocolo eficiente e confiável para a imunocoloração, hibridação in situ fluorescente, a coloração do DNA seguido de quantitativo, imagem de alta resolução em Arabidopsis thaliana óvulos inteiros de montagem. Este método foi utilizado com sucesso para analisar as modificações da cromatina e arquitectura nuclear.

Um método eficiente para Quantitativa, Análise de células Único de cromatina Modificação e Arquitetura Nuclear em Todo-mount óvulos em<em&gt; Arabidopsis</em

Cromatina imunoprecipitação é uma técnica poderosa para a identificação de locais de Arabidopsis proteínas de ligação ao ADN in vivo. Este procedimento inclui a ligação cruzada da cromatina e fragmentação, imunoprecipitação com anticorpos selectivos contra a proteína de interesse, e análise de qPCR de DNA ligado. Nós descrevemos um ensaio ChIP simples otimizado para plantas de Arabidopsis.

Ensaio para imunoprecipitação da cromatina a identificação de Arabidopsis interações proteína-ADN<em&gt; In Vivo</em

Apresentamos um método eficaz e reprodutível para isolar e cultura de células progenitoras neurais do tecido do cérebro embrionário e pós-natal por imunoprecipitação da cromatina (ChIP) de histona 3 lisina 79 laboratório (H3K79me2) - uma marca do histone localizada dentro do domínio globular de histona 3.

Isolamento e cultivo de progenitores neurais seguido de imunoprecipitação de cromatina da marcação de dimetilação da lisina 9 da histona 3

O protocolo foi desenvolvido para extrair efetivamente histonas intactas de materiais de folhas de sorgo para o perfil de modificações pós-translacionais de histona que podem servir como potenciais marcadores epigenéticos para ajudar as culturas resistentes à seca de engenharia.

Isolamento de Histone do tecido da folha de sorgo para perfil de espectrometria de massa de top down de potenciais marcadores epigenéticos

Aqui, apresentamos um protocolo para analisar a distribuição em todo o genoma das modificações de histona, que podem identificar novos genes-alvo na patogênese de M. oryzae e outros fungos filamentosos.

Análise em todo o genoma da distribuição de modificações de histona usando o Método de Sequenciamento de Imunoprecipitação de Chromatina em Magnaporthe oryzae

Um fluxo de trabalho analítico baseado em cromatografia líquida, espectrometria de mobilidade iônica aprisionada e espectrometria de massa por tempo de voo (LC-TIMS-ToF MS/MS) para alta confiança e análise "bottom-up" altamente reprodutível de modificações e identificação de histonas com base em parâmetros principais (tempo de retenção [TR], seção transversal de colisão [CCS] e relação massa-carga [m/z] precisa).

Triagem de modificação de histona usando cromatografia líquida, espectrometria de mobilidade iônica aprisionada e espectrometria de massa por tempo de voo

Pesquisadores novos no campo epigenético encontrarão no CUT&amp;Tag uma alternativa significativamente mais fácil aos ensaios ChIP. A CUT&amp;Tag beneficiou tremendamente os estudos epigenéticos em populações de células raras e primárias, gerando dados de alta qualidade a partir de muito poucas células. Este protocolo descreve a realização de ensaios H3K4me1 CUT&amp;Tag em mioblastos de camundongos isolados de músculos posteriores de camundongos.

Usando o ensaio de clivagem sob alvos e marcação (CUT&#38;Tag) na pesquisa de mioblastos de camundongos

Esse protocolo permite a extração eficiente de histonas de várias amostras clínicas para análise subsequente de modificações pós-traducionais por LC-MS/MS. Ao facilitar a detecção robusta de modificações chave de histonas, serve como uma ferramenta valiosa para o perfil epigenético abrangente em grandes coortes clínicas.

Extração de histonas de amostras clínicas para perfilamento epigenético por espectrometria de massa

Este estudo apresenta um protocolo multioma espacial Trekker–CUT&amp;Tag que combina codificação de barras espacial direta de uma seção de tecido com análise multioma de célula única. Essa abordagem permite o perfilamento espacialmente resolvido de uma única célula da expressão gênica e a modificação da histona H3K27ac simultaneamente, oferecendo insights mecanicistas sobre a regulação gênica no contexto da microanatomia tecidual.

Perfilamento Multiômico Integrado de Célula Única Espacialmente Resolvido do Transcriptoma e Alvos Epigenômicos em Seções de Tecido Congelado

Aprenda o método CUT&Tag refinado para perfilamento epigenômico em plantas usando folhas de algodão. Esta técnica permite analisar modificações de histonas como H3K4me3 com alta eficiência e resolução.

Perfil da modificação H3K4me3 em plantas usando decote sob alvos e tagmentação

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