Preparação de membrana plasmática em pequena escala para a análise de cânbicas cânbicas cdr1-mGFPHis
13 de junho de 2021
Este artigo apresenta um protocolo de isolamento de membrana plasmática de pequena escala para a caracterização da proteína Cdr1 (cassete de ligação ATP) da Candida ABC (fita adesão a ATP), superexpressa em Saccharomyces cerevisiae. Uma mGFPC terminal de protease com um linker de 16 resíduos entre o Cdr1 e a tag foi projetada para facilitar a purificação e o detergente-triagem do Cdr1.
O protocolo de isolamento da membrana plasmática em pequena escala e mGFPHis double tag, fornecem um método econômico, rápido, confiável e fácil para caracterizar proteínas de membrana no organismo modelo eucariótico, Saccharomyces cerevisiae. A maior vantagem dessa tecnologia é a facilidade e velocidade com que os níveis de expressão da proteína da membrana, as atividades da ATP e o detergente são mais adequados para sua purificação podem ser determinados. Esta tecnologia é muito amigável.
No entanto, um ponto importante a ser lembrado é a colheita de células como OD 600 de 2, o que garante baixa contaminação mitocondrial e as atividades mais altas possíveis de ATPase. Comece pré-culminando uma única colônia de leveduras em 10 mililitros de YPD médio a 30 graus Celsius por sete a oito horas a 200 rotações por minuto. Use 10 mililitros de pré cultura para inocular 40 mililitros de meio YPD fresco.
Em seguida, incubar as células a 30 graus Celsius durante a noite a 200 rotações por minuto até que a densidade celular atinja um OD 600 de um a três. No dia seguinte, colhem 40 unidades de densidade óptica, ou ODU, de células faciais logarítmicas por centrifugação a 4.200 vezes G por cinco minutos a quatro graus Celsius. Re suspenda e lave as células com 40 mililitros de gelo frio estéril água dupla destilada.
Repita a lavagem usando um mililitro de água gelada com centrifugação entre as etapas de lavagem. Suspenda a pelota em um mililitro de água estéril gelada e transfira a suspensão celular para um tubo de micro centrífuga de 1,5 mililitro pré-resfriado no gelo. Células de colheita a 3.300 vezes G por três minutos a quatro graus Celsius.
Aspire o supernatante e suspenda a pelota celular em 500 microliters de tampão homogeneizador recém-suplementado com um fluoreto de sulfa de metila de fenal de mililitro Neal, ou PMSF. Armazene a suspensão do celular a menos 80 graus Celsius até que use mais. Descongele as células no gelo por aproximadamente uma hora.
Em seguida, adicione contas de sílica geladas de 0,5 milímetros de diâmetro aos 500 microliters da suspensão celular para atingir um volume total de um mililitro. Para quebrar as células, o vórtice suspende a suspensão celular em intensidade máxima de agitação por um minuto, durante seis ciclos, com um período de resfriamento de três minutos no gelo após cada ciclo. Após o vórtice, faça um fino orifício na parte inferior do tubo com uma lâmina de bisturi aquecida e colete a célula quebrada homogeneizar em outro tubo de micro centrífuga de 1,5 mililitro gelado com um giro de baixa velocidade por 10 segundos.
Centrifugar a célula coletada homogeneizar a 5.156 vezes G por cinco minutos a quatro graus Celsius para remover detritos celulares. Transfira 450 microlitres de supernacidos em um tubo de micro centrífuga de 1,5 mililitro e adicione um mililitro de tampão homogeneizador frio estocido com um PMSF fresco mililitro. Para colher membranas plasmáticas centrifuugar a suspensão celular a 17.968 vezes G por uma hora a quatro graus Celsius.
Remova o supernatante e adicione 100 microliters de tampão homogeneizador recém-suplementado com um PMSF milimar. Em seguida, solte a pelota da membrana plasmática mexendo com a ponta de pipeta de 100 microliter e suspenda novamente a pelota repetindo tubos para cima e para baixo. Meça a concentração proteica da preparação da membrana plasmática com um kit de ensaio proteico compatível com tampões contendo o agente redutor e o detergente.
Armazene as membranas plasmáticas a menos 80 graus Celsius, ou mantenha-as no gelo para uso imediato. Despeje de quatro a cinco mililitros de gel de separação no aparelho de gel montado até dois centímetros do topo. Coloque cuidadosamente de um a dois mililitros de 0,1% SDS por cima e deixe o gel de poli acrilamida definir por 60 minutos em temperatura ambiente.
Após uma hora, remova a camada de 0,1% SDS do gel de separação polimerizado e enxágue o gel com água dupla destilada para remover traços de SDS. Despeje a mistura de gel de empilhamento no gel de separação. Coloque um pente no gel de empilhamento e remova quaisquer bolhas de ar ao redor do pente.
Em seguida, deixe o gel de empilhamento definir por 60 minutos à temperatura ambiente. Retire o pente e enxágue as ranhuras de gel com água. Coloque o gel no tanque de gel e encha o tanque de gel até o topo com tampão de corrida.
Misture de cinco a 10 microliters de amostras de membrana plasmática com volumes iguais de corante de carga de proteínas duas vezes e carregue imediatamente a mistura de amostras em ranhuras de gel individuais, submersas em tampão de corrida. Carregar marcadores de peso molecular de proteína na faixa de 10 a 245 Kilodalton em um slot separado para permitir a estimativa de tamanho de fragmentos de proteínas individuais. Realize a eletroforese de gel a 200 volts até que o corante azul de carga atinja a parte inferior do gel.
Examine o gel para fluorescência GFP em gel com um sistema de imagem de gel. Seguindo as proteínas fluorescentes de fixação de imagem em 10 a 20 mililitros de solução de fixação de gel de proteína por agitação suave do gel por 15 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, enxágue as duas vezes por 10 minutos com 10 mililitros de água dupla destilada e coloque o gel em 10 mililitros de solução de mancha de Kumasi coloidal com agitação suave por uma hora à temperatura ambiente para visualizar bandas proteicas.
Para melhor visualização de bandas proteicas, desperche o gel uma ou duas vezes em 20 mililitros de água dupla destilada por uma hora antes de gravar imagens com o sistema de imagem em gel. Uma alta frequência de transformação de Saccharomyces cerevisiae A D Delta Delta foi alcançada com o controle positivo plasmídeo PS2. Não foram obtidos transformadores Eurocell Prototron para o controle negativo.
Cerca de 50 células URA prototrofo CDR1-mGFPHintfomucofoi obtido após incubação de células AD Delta Delta transformadas em placas CSM menos URA por três dias. Petite transformador que não pode crescer em placas de ágar YPG foram eliminados. CDR1-mGHPHis amostras com concentrações variadas foram quantificadas com fluorescência em gel.
As intensidades de fluorescência mGFP foram lineares sobre toda a faixa de concentração com fluorescência mínima de fundo. Variando a densidade celular indicou que quebrar 40 ODU de células produziu a mais alta qualidade de membranas plasmáticas com a maior atividade DE ATPase CDR1. No entanto, o rendimento das membranas plasmáticas aumentou proporcionalmente ao aumento das densidades celulares.
A capacidade de 31 detergentes com várias propriedades para solubilizar CDR1-mGHPHis de membranas de plasma bruto do Delta delta, células CDR1-mGHPHis foram testadas com a página SDS. Beta e alfa DDM E Fos-choline 13 foram os melhores detergentes para solubilizar CDR1-mGHPHis. No entanto, Fos-choline 13 causa hidrólise parcial de CDR1-mGHPHis.
A proteína da membrana plasmática bruta solubilizada com 1%de detergente foi separada usando um superos seis aumentou 10 300 coluna de exclusão do tamanho de GL. Cromatógramas de Maltosides e proteínas extraídas de GNL mostraram a maioria dos CDR1-mGHPHis iludindo como um pico gaussiano bem moldado em 15,5 milímetros CDR1-mGHPHis solubilizado com glicose contendo detergentes aludidos como um pico agregado ou ampla. Os picos mais altos para DDM indicaram que uma grande parte do DMN G solubilizado CDR1-mGHPHis pode ser desnaturado.
Nos cromatógramas FSCC para fos-colinas zwitterionic e dois detergentes não iônicos apenas Digitonin e deu um cromatógrafo semelhante ao DDM. Fos-choline 13 deu um pico simétrico em forma afiada, mas aludiu com um volume de elução significativamente menor do que o do DDM. A tag dupla otimizada também melhora o rendimento de purificação e ajudou a determinar a localização, o tráfico e a estabilidade térmica das proteínas de membrana.
A tecnologia de expressão heteróloga também pode ser usada na triagem de medicamentos de alto rendimento, e na caracterização detalhada de muitas outras proteínas de membrana.
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Visão Geral
Este estudo apresenta um protocolo em pequena escala para o isolamento de membrana plasmática, destinado à caracterização da proteína ABC Cdr1 no organismo modelo eucariótico Saccharomyces cerevisiae. As principais vantagens incluem a rapidez, economia e confiabilidade do método na avaliação da expressão de proteínas de membrana e das atividades ATPase.
Componentes Principais do Estudo
Área de Pesquisa
- Biologia celular
- Caracterização de proteínas de membrana
- Sistemas modelos eucarióticos
Contexto
- Importância das proteínas de ligação à ATP (ABC)
- Dificuldades na purificação de proteínas de membrana
- Papel de Saccharomyces cerevisiae como organismo modelo
Métodos Utilizados
- Protocolo de isolamento em pequena escala da membrana plasmática
- Saccharomyces cerevisiae
- Marcação dupla C-terminal mGFPHis clivável por protease
Resultados Principais
- Caracterização bem-sucedida de Cdr1 utilizando o novo protocolo
- Medição eficaz dos níveis de expressão de proteínas de membrana
- Avaliação das atividades ATPase e do uso ideal de detergentes
Conclusões
- O protocolo aumenta a facilidade dos estudos de proteínas de membrana
- Fornece uma ferramenta valiosa para pesquisas futuras envolvendo proteínas de membrana
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este protocolo permite o isolamento rápido e em pequena escala de membranas plasmáticas de leveduras modificadas, apoiando a caracterização inicial de alvos de proteínas de membrana, como transportadores ABC. Ao facilitar a avaliação rápida de níveis de expressão, atividade ATPase e solubilização com detergente, auxilia na validação de alvos e na redução de riscos mecanicistas durante a fase de descoberta. O método aumenta a confiança preditiva na identificação de compostos promissores ao fornecer dados confiáveis e quantitativos sobre o comportamento de proteínas de membrana em condições próximas às nativas.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas por meio da quantificação da expressão de proteínas de membrana e da atividade funcional.
- Valor Operacional: Apoia a desmistificação biológica ao permitir a avaliação rápida de variantes mutantes e dos efeitos de detergentes na estabilidade do alvo.
- Valor Preditivo: Aprimora a triagem de portfólios ao gerar dados reprodutíveis sobre localização, tráfego e estabilidade térmica das proteínas.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Prepara sistemas biológicos validados para triagem subsequente mediante o isolamento de membranas plasmáticas de alta qualidade, adequadas para ensaios funcionais.
- Valor Operacional: Aborda a padronização de ensaios por meio da preparação consistente de membranas, gerando leituras quantificáveis de ATPase.
- Escalabilidade: Destaca o potencial de reutilização da plataforma para testar os efeitos de compostos na função de proteínas de membrana em formato escalável.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinhamento Translacional: Apoia sistemas relevantes para doenças ao permitir a caracterização de bombas de efluxo fúngicas como a Cdr1, relevantes para mecanismos de resistência a antifúngicos.
- Continuidade Pré-clínica: Descreve a continuidade desde a descoberta até a validação pré-clínica, fornecendo um método confiável para avaliar a função de proteínas mutantes antes de estudos in vivo.
- Decisões Ajustadas ao Risco: Concentra-se na redução preditiva de riscos, gerando dados que orientam decisões de avançar ou não com base em perfis de estabilidade e atividade proteica.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se insere no continuum de descoberta, desde a validação do alvo até a identificação de compostos iniciais, permitindo a triagem funcional precoce de alvos proteicos de membrana antes da otimização do composto.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses e a elucidação de vias ao permitir a medição da atividade ATPase e da expressão proteica em leveduras geneticamente modificadas.
- Triagem: Descreve a preparação do ensaio mediante o isolamento reprodutível de membranas plasmáticas compatível com triagem de detergentes e cromatografia de exclusão por tamanho.
- Análises: Destaca resultados quantitativos, como fluorescência em gel e medições de atividade ATPase, que permitem a comparação entre condições e mutantes.
- Pesquisa Translacional: Conecta-se à continuidade pré-clínica ao fornecer dados sobre estabilidade e tráfego proteicos relevantes para a validação de alvos.
- Reutilização Empresarial: Posiciona o protocolo como uma capacidade reutilizável para caracterizar múltiplas proteínas de membrana em contextos de alto rendimento.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Confiança preditiva na validação de alvos, redução da ambiguidade mecanicista no comportamento de proteínas de membrana.
- Valor Operacional: Padronização, reprodutibilidade e escalabilidade do isolamento de membranas para uso repetido em diversos projetos.
- Valor Estratégico: Decisões melhoradas de avançar/não avançar, eficiência do capital e redução de riscos biológicos em estágios avançados mediante perfilagem funcional precoce.
- Impacto no Portfólio: Priorização e decisões de avanço ajustadas ao risco, com base em dados quantitativos de proteínas de membrana.
Considerações de Implementação
- Requer experiência em cultura de levedura, isolamento de membranas e quantificação baseada em fluorescência.
- Necessita de instrumentação laboratorial padrão, incluindo centrífugas, vórtex, sistemas de eletroforese em gel e detectores de fluorescência.
- Exige padronização entre equipes quanto ao momento da colheita (OD 600 de 2) e protocolos de lavagem para minimizar a contaminação mitocondrial.
- Envolve considerações de adaptação ao aplicar a estratégia de marcação a outras proteínas de membrana além da Cdr1 em levedura.
- Inclui limitações práticas, como a necessidade de otimizar a escolha do detergente para evitar hidrólise proteica, conforme observado com Fos-colina 13.
Perguntas Frequentes sobre Biotecnologia Farmacêutica
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:57
Growing and Harvesting Yeast Cells
2:26
Isolation of Plasma Membranes
4:14
Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE)
6:22
Results: Analysis of Cdr1-mGFPHis Isolated from Plasma Membranes of Saccharomyces cerevisiae
9:06
Conclusion
