Name: Dissecção de fibras musculares esqueléticas únicas para análises imunofluorescentes e morfométricas de junções neuromusculares de monte inteiro (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-14T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
Description: Aprenda a dissecar fibras musculares esqueléticas de ratos para análise imunofluorescente e morfométrica de junções neuromusculares em monte inteiro. Este método permite visualização de alta resolução de componentes pré e pós-sinápticos.

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Muito obrigado ao CSIC e ao PEDECIBA pelo apoio financeiro dado a este trabalho; para Natalia Rosano para suas correções manuscritos; para Marcelo Casacuberta que faz o vídeo e para Nicolás Bolatto por emprestar sua voz para ele.

Todos os procedimentos animais foram realizados de acordo com as diretrizes da Lei Nacional nº 18.611 para cuidados com animais utilizados para fins experimentais. O protocolo foi aprovado pelo Comitê de Ética Institucional (CEUA IIBCE, Protocolo nº 004/09/2015).
1. Dissecção muscular (Dia 1)
NOTA: Antes de começar, faça 40 mL de paraformaldeído (PFA), pH 7,4 na solução salina fosfato de Dulbecco (DPBS). Opcionalmente, faça 20 mL de 4% pfa. Prepare 5 mL aliquots e congele a -20 °C. No dia da dissecção, descongele uma alíquota de 4% e adicione 35 mL de DPBS para obter 40 mL de 0,5% de PFA.
<ol><li>
Isolamento do EDL (músculo de contração rápida)
	<ol>
<li>Eutanize um rato. Coloque o animal com o abdômen voltado para cima. Faça uma incisão inicial usando uma lâmina cirúrgica entre os dedos dos dedos do pé em direção ao membro traseiro. NOTA: Neste caso, uma injeção intraperitoneal de 90:10 mg/Kg de cetamina:xilazina foi dada para eutanásia do rato, mas outras opções de anestesia também são permitidas.</li>
		<li>Retire a pele, puxando-a para cima até que o joelho do rato seja exposto.</li>
		<li>Para encontrar o EDL, siga os tendões do pé até o ligamento anular. Este ligamento circunda dois tendões. Corte o ligamento entre os dois tendões com tesoura uniband (ou similar). Identifique o tendão edl levantando ambos e escolha o que faz os dedos se moverem para cima.</li>
		<li>Corte o tendão com uma tesoura uniband. Em seguida, mantendo o tendão com pinças biológicas finas, comece a separar lentamente o músculo EDL da tíbia anterior, do peroneus brevis e peroneus longus40 (ver Figura 1A). NOTA: Certifique-se de que o músculo está separado sem qualquer dano. Faça isso cortando o resto dos músculos laterais para abrir um caminho entre eles (o EDL não tem uma localização superficial) enquanto segura e levanta o músculo EDL.</li>
		<li>Para isolar completamente o músculo, corte o tendão preso ao joelho do rato com uma tesoura uniband.</li>
		<li>Mergulhe o músculo dissecado em 5 mL de 0,5% PFA e deixe por 24h a 4 °C. Opcionalmente, grampeie o músculo em um pedaço de papelão e gire-o com o músculo virado para baixo. Em seguida, mergulhe-o completamente em 8 mL da solução fixativa. Esta etapa ajuda na manutenção do músculo alongado durante o processo de fixação.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Isolamento do soleus (músculo de contração lenta)
	<ol>
<li>Vire o animal (o abdômen está agora voltado para baixo). Através da pele, corte o tendão calcâneo usando uma lâmina cirúrgica.</li>
		<li>Com a ajuda da pinça biológica e da tesoura uniband, separe o músculo gastrocnemius dos ossos, criando uma "tampa muscular". O soleus estará no lado interno da tampa muscular. Pode ser identificado porque é de cor vermelha e tem uma morfologia plana.</li>
		<li>Com um par de pinças biológicas, alcance e levante o tendão do soleus que fica acima do gastrocnemius (ver Figura 1B).</li>
		<li>Corte o tendão com uma tesoura uniband. Levante todo o músculo enquanto corta alguns dos pontos de apego fracos (ou seja, elementos neurovasculares). Por fim, para libertar completamente o músculo soleus, corte o soleus fascicle que forma o tendão calcâneo com tesoura uniband.</li>
		<li>Repita o passo 1.1.6 para fixar o músculo s soleus dissecado.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Preparação de fibras provocadas (dia 2)
<ol><li>Após 24 horas de fixação, enxágue os músculos com 6 mL de solução DPBS 3x por 10 minutos cada antes de isolar as fibras musculares.</li>
	<li>Para isolar as fibras, coloque um músculo em um slide de microscópio. Usando um estereótipo, segure suavemente um dos tendões com um par de pinças biológicas. Em seguida, com as outras pinças biológicas, comece a beliscar o tendão lentamente para separar as fibras musculares. Depois disso, puxe lentamente o tecido apertado para cima em direção ao tendão muscular oposto. Será necessário repetir esta ação várias vezes até obter vários pequenos pacotes isolados.</li>
	<li>Coloque-os cuidadosamente em um slide pré-tratado (silanizado). É necessário manter todas as fibras em ordem para que elas não se sobreponham. Neste ponto, seque as fibras por 24 h.</li>
</ol>3. Imunofluorescência
<ol><li>
Incubação primária de anticorpos (Dia 3) NOTA: Todas as etapas foram realizadas em temperatura ambiente, exceto se indicado de outra forma. A maneira mais eficiente de remover as diferentes soluções sem separar fibras do slide é usar uma seringa de insulina.<ol>
<li>Para iniciar o processo de imunossuagem, cerque as fibras musculares isoladas secas com uma caneta pap para criar uma barreira impermeável.</li>
		<li>Para hidratar as fibras musculares, adicione 200 μL de água destilada por 5 minutos e, em seguida, troque a água para 200 μL de DPBS para a próxima incubação de 5 minutos. Neste ponto, inicie a rotulagem de imunofluorescência.</li>
		<li>Incubar fibras com 300 μL de um tampão de bloqueio (BB) contendo 50 mM de glicato, 1% BSA e 1% Triton X-100 por 30 min.</li>
		<li>Substitua o BB pelo anticorpo primário em uma concentração sugerida pelos fabricantes. Use o BB para diluir o anticorpo. Este experimento utilizou 400 μL de SMI 32 ou SMI 31 que reconheceram o neurofilamento não fosforilado (NF) ou fosforilado (Phos-Nf) em diluição de 1/800 para detectar o componente pressináptico NMJ. NOTA: Ao decidir reconhecer todo o elemento pré-sináptico em vez de avaliar a fosforilação neurofilamental, escolha anticorpos contra sinapsina, sinaptofisina ou SV2a que foram previamente empregados.</li>
		<li>Incubar as fibras com a diluição do anticorpo primário a 4 °C durante a noite (opcionalmente, a incubação pode ser realizada a 37 °C por 1 h). Em ambos os casos, será importante realizar a incubação utilizando uma câmara úmida.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Imunofluorescência: Incubação de anticorpos secundários (Dia 4)
	<ol>
<li>Remova o anticorpo primário e enxágue as fibras 3x por 10 minutos cada uma com 500 μL de DPBS e a última vez com BB.</li>
		<li>Remova esta última lavagem e adicione o anticorpo secundário rotulado fluorescente diluído em BB. Para este experimento, foi utilizado 500 μL de anti-rato de cabra Alexa Fluor 488 a 1/1000 diluição em BB. Para ver o elemento postsinápico dos NMJs, 1:300 α-Bungarotoxina (Btx) conjugado biotin-XX foi adicionado à diluição de anticorpos secundários. NOTA: A adição de Btx-biotin XX permite melhores imagens de sinal a ruído uma vez detectadas com streptavidin que amplifica o sinal. Além disso, a conjugação de streptavidin a diferentes fluoroforos aumentou as combinações de cores em ensaios de co-rotulagem. Alternativamente, o Btx fluorescentemente rotulado permite obter imagens de qualidade semelhante.</li>
		<li>Incubar o anticorpo secundário e o Btx por 2h em temperatura ambiente ou 1h a 37 °C protegido da luz.</li>
		<li>Remova o anticorpo secundário e o Btx. Wash 3x por 10 min cada com 500 μL de DPBS e o último enxágue com BB.</li>
		<li>Incubar com 500 μL de Streptavidin Alexa Fluor 555 a 1/1000 diluição com BB por 1h em temperatura ambiente. Neste ponto, se desejar, adicione uma sonda para contra-conter os núcleos, como diaminofenilimale em uma concentração final de 1 μg/mL.</li>
		<li>Remova a solução de incubação e lave fibras 3x por 10 minutos cada com 500 μL de DPBS. Então, monte as fibras.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Montagem
	<ol>
<li>Coloque 4 pontos de esmalte transparente no slide do microscópio como se fossem os vértices de um quadrado. Deixe-os secar 1-2 min. Estes serão os pontos onde as tampas descansarão, ajudando a evitar o esmagamento de tecidos.</li>
		<li>Remova a última lavagem DPBS e adicione mídia de montagem suficiente (~ 200 μL) para cobrir as fibras; evite a secagem. NOTA: Para preparar 10 mL da mistura de mídia de montagem, use Tris-HCl 1,5 M pH 8,8: glicerol em um 4:1 (v:v).</li>
		<li>Use uma ponta de pipeta de 200 μL para espalhar cuidadosamente a mídia de montagem sobre as fibras para garantir uma imersão completa de todas elas. Antes de colocar o vidro de cobertura, remova as bolhas de ar.</li>
		<li>Coloque a mancha nas amostras tentando evitar a geração de bolhas de ar. Esse movimento pode ser feito com a ajuda de fórceps.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Microscopia e análise morfométrica
<ol><li>Imagem os preparos de fibra provocado usando microscopia confocal a laser.</li>
	<li>Pegue uma série de seções ópticas (pilhas Z de 30 μm) em toda a sinapse usando um intervalo de um micrômetro. Para definir a pilha, use o sinal Btx. Imagem mínima de 15-20 NMJs para cada condição muscular com uma resolução 2048 px x 2048 px. Este método foi escolhido para obter imagens com qualidade óptica e resolução suficientes para a análise morfométrica.</li>
	<li>Para realizar as medições, use as imagens de projeção de pilhas com qualquer software de análise. NOTA: Embora a análise morfométrica explicada tenha sido feita manualmente, existem duas ferramentas recém-desenvolvidas baseadas em Imagem J para estudar muitos aspectos diferentes da morfologia NMJ pré e postinástica33,34.</li>
	<li>Para obter os valores totais da área do NMJ, selecione a borda externa (contorno externo da área manchada, consulte a Figura 2) da placa final usando a ferramenta de laço Magnético Photoshop e determine o número de pixels selecionados na janela Histograma. Em seguida, as áreas de pixel podem ser convertidas em micrômetros quadrados usando a escala especificada pelo software confocal.</li>
	<li>Com a mesma ferramenta de laço, selecione a borda interna (contornos da área manchada dentro da placa final, consulte a Figura 2) e determine a área não manchada em toda a estrutura (ou área vazia) conforme detalhado acima (passo 4.4.). Os valores da Área Pós-Sináptica serão obtidos após subtrair a área total da área vazia de cada NMJ.</li>
	<li>Obtenha a Área Pré-Sináptica, que é definida como a área com imunofluorescência anti-neurofilamento, de forma semelhante à área total do NMJ. NOTA: Todos esses parâmetros foram utilizados para determinar o índice de densidade pós-sináptica (Área Pós-Sináptica/Área Total) e a Cobertura NMJ (Área Pré-Sináptica/Área Pós-Sináptica). Um índice de densidade pós-sináptica mais alto implica uma placa final mais densa ou mais compacta, enquanto uma cobertura NMJ menor reflete uma interação muito pior entre terminal nervoso e placa final (ambas compatíveis com um processo de denervação). No caso aqui mostrado, uma vez que foram detectadas formas fosfoiladas e não fosfoiladas de neurofilamentos no nível terminal nervoso, calculou-se a razão de sinal presintolético fosfoilado/não fosfoilado e a razão de cobertura fosfoilada/não fosfoilada.</li>
</ol>

<ol><li>Araque, A., Parpura, V., Sanzgiri, R. P., Haydon, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tripartite+synapses%3A+Glia%2C+the+unacknowledged+partner%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Tripartite synapses: Glia, the unacknowledged partner.</a> Trends Neuroscience. 22, 208-215 (1999).</li>
<li>Robitaille, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+synaptic+efficacy+and+synaptic+depression+by+glial+cells+at+the+frog+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Modulation of synaptic efficacy and synaptic depression by glial cells at the frog neuromuscular junction.</a> Neuron. 21, 847-855 (1998).</li>
<li>Cappello, V., Francolini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuromuscular+Junction+Dismantling+in+Amyotrophic+Lateral+Sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Neuromuscular Junction Dismantling in Amyotrophic Lateral Sclerosis.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (10), 2092-2108 (2017).</li>
<li>Deschenes, M. R., Tenny, K. A., Wilson, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+and+decreased+activity+elicits+specific+morphological+adaptations+of+the+neuromuscular+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Increased and decreased activity elicits specific morphological adaptations of the neuromuscular junctions.</a> Neuroscience. 137, 1277-1283 (2006).</li>
<li>Desaulniers, P., Lavoie, P. A., Gardiner, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Habitual+exercise+enhances+neuromuscular+transmission+efficacy+of+rat+soleus+muscle+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Applied+Physiology%22%5BJournal%5D)">Habitual exercise enhances neuromuscular transmission efficacy of rat soleus muscle in situ.</a> Journal Applied Physiology. 90, 1041-1048 (2001).</li>
<li>Deschenes, M. R., Roby, M. A., Glass, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging+influences+adaptations+of+the+neuromuscular+junction+to+endurance+training%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Aging influences adaptations of the neuromuscular junction to endurance training.</a> Neuroscience. 190, 56-66 (2011).</li>
<li>Valdez, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attenuation+of+age-related+changes+in+mouse+neuromuscular+synapses+by+caloric+restriction+and+exercise%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+National+Academy+of+Science+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Attenuation of age-related changes in mouse neuromuscular synapses by caloric restriction and exercise.</a> Proceedings National Academy of Science U.S.A. 107, 14863-14868 (2010).</li>
<li>Arnold, A. -S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+and+functional+remodeling+of+the+neuromuscular+junction+by+skeletal+muscle+PGC-1%CE%B1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Morphological and functional remodeling of the neuromuscular junction by skeletal muscle PGC-1α.</a> Nature Communications. 5, 3569-3595 (2014).</li>
<li>Hill, R. R., Robbins, N., Fang, Z. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+of+presynaptic+and+postsynaptic+elements+of+neuromuscular+junctions+repeatedly+observed+in+living+adult+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurocytology%22%5BJournal%5D)">Plasticity of presynaptic and postsynaptic elements of neuromuscular junctions repeatedly observed in living adult mice.</a> Journal of Neurocytology. 20 (3), 165-182 (1991).</li>
<li>Brown, M. C., Hopkins, W. G., Keynes, R. J., White, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+early+morphological+changes+at+denervated+and+paralyzed+endplates+in+fast+and+slow+muscles+of+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">A comparison of early morphological changes at denervated and paralyzed endplates in fast and slow muscles of the mouse.</a> Brain Research. 248, 382-386 (1982).</li>
<li>Rosenheimer, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+chronic+stress+and+exercise+on+age+related+changes+in+end-plates+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Effects of chronic stress and exercise on age related changes in end-plates architecture.</a> Journal of Neurophysiology. 53, 1582-1589 (1985).</li>
<li>Andonian, M. H., Fahim, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+endurance+exercise+on+the+morphology+of+mouse+neuromuscular+junctions+during+ageing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurocytology%22%5BJournal%5D)">Effects of endurance exercise on the morphology of mouse neuromuscular junctions during ageing.</a> Journal of Neurocytology. 16, 589-599 (1987).</li>
<li>Tomas, J., Fenoll, R., Santafé, M., Batlle, J., Mayayo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+nerve+terminal+morphologic+plasticity+induced+by+small+changes+in+the+locomotor+activity+of+the+adult+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">Motor nerve terminal morphologic plasticity induced by small changes in the locomotor activity of the adult rat.</a> Neuroscience Letters. 106, 137-140 (1989).</li>
<li>Deschenes, M. R., Maresh, C. M., Crivello, J. F., Armstrong, L. E., Kramer, W. J., Covault, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+exercise+training+of+different+intensities+on+neuromuscular+junction+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurocytology%22%5BJournal%5D)">The effects of exercise training of different intensities on neuromuscular junction morphology.</a> Journal of Neurocytology. 22, 603-615 (1993).</li>
<li>Nishimune, H., Stanford, J. A., Mori, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+exercise+in+maintaining+the+integrity+of+the+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+Nerve%22%5BJournal%5D)">Role of exercise in maintaining the integrity of the neuromuscular junction.</a> Muscle Nerve. 49 (3), 315-324 (2014).</li>
<li>Andonian, M. H., Fahim, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endurance+exercise+alters+the+morphology+of+fast-+and+slow-twitch+rat+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Sports+Medicine%22%5BJournal%5D)">Endurance exercise alters the morphology of fast- and slow-twitch rat neuromuscular junction.</a> International Journal of Sports Medicine. 9, 218-223 (1988).</li>
<li>Fahim, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endurance+exercise+modulates+neuromuscular+junction+of+C57BL%5C6N+in+ageing+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physiology%22%5BJournal%5D)">Endurance exercise modulates neuromuscular junction of C57BL\6N in ageing mice.</a> Journal of Applied Physiology. 83, 59-66 (1997).</li>
<li>Waerhaug, O., Dahl, H. A., Kardel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+effects+of+physical+training+on+morphology+of+motor+nerve+terminals+in+rat+extensor+digitorum+longus+and+soleus+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22Anatomy+and+Embryology%22%5BJournal%5D)">Different effects of physical training on morphology of motor nerve terminals in rat extensor digitorum longus and soleus muscles.</a> Anatomy and Embryology. 186, 125-128 (1992).</li>
<li>Desaulniers, M. R., Lavoie, P. A., Gardiner, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endurance+training+increases+acetylcholine+receptor+quantity+at+neuromuscular+junctions+of+adult+rat+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Endurance training increases acetylcholine receptor quantity at neuromuscular junctions of adult rat skeletal muscle.</a> Neuroreport. 9, 3549-3552 (1998).</li>
<li>Deschenes, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+resistance+training+on+neuromuscular+junction+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+Nerve%22%5BJournal%5D)">Effects of resistance training on neuromuscular junction morphology.</a> Muscle Nerve. 23, 1576-1581 (2000).</li>
<li>Lepore, E., Casola, I., Dobrowolny, G., Musarò, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuromuscular+Junction+as+an+Entity+of+Nerve-Muscle+Communication%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Neuromuscular Junction as an Entity of Nerve-Muscle Communication.</a> Cells. 8 (8), 906-921 (2019).</li>
<li>Braak, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyotrophic+lateral+sclerosis-A+model+of+corticofugal+axonal+spread%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Review+Neurology%22%5BJournal%5D)">Amyotrophic lateral sclerosis-A model of corticofugal axonal spread.</a> Nature Review Neurology. 9, 708-714 (2013).</li>
<li>Fischer, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyotrophic+lateral+sclerosis+is+a+distal+axonopathy%3A+Evidence+in+mice+and+man%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">Amyotrophic lateral sclerosis is a distal axonopathy: Evidence in mice and man.</a> Experimental Neurology. 185, 232-240 (2004).</li>
<li>Moloney, E. B., de Winter, F., Verhaagen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ALS+as+a+distal+axonopathy%3A+molecular+mechanisms+affecting+neuromuscular+junction+stability+in+the+presymptomatic+stages+of+the+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">ALS as a distal axonopathy: molecular mechanisms affecting neuromuscular junction stability in the presymptomatic stages of the disease.</a> Frontiers in Neuroscience. 14 (8), 252-270 (2014).</li>
<li>Scott, W., Stevens, J., Binder-Macleod, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+skeletal+muscle+fiber+type+classifications%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Therapy%22%5BJournal%5D)">Human skeletal muscle fiber type classifications.</a> Physical Therapy. 81, 1810-1816 (2001).</li>
<li>Schiaffino, S., Hanzlíková, V., Pierobo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relations+between+structure+and+function+in+rat+skeletal+muscle+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Relations between structure and function in rat skeletal muscle fibers.</a> Journal of Cellular Biology. 47 (1), 107-119 (1970).</li>
<li>Schiaffino, S., Reggiani, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiber+types+in+mammalian+skeletal+muscles.+Review%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Fiber types in mammalian skeletal muscles. Review.</a> Physiological Reviews. 91 (4), 1447-1531 (2011).</li>
<li>Mech, A. M., Brown, A. L., Schiavo, G., Sleigh, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+variability+is+greater+at+developing+than+mature+mouse+neuromuscular+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Anatomy%22%5BJournal%5D)">Morphological variability is greater at developing than mature mouse neuromuscular junctions.</a> Journal of Anatomy. 237 (4), 603-617 (2020).</li>
<li>Jones, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMJ-morph+reveals+principal+components+of+synaptic+morphology+influencing+structure-function+relationships+at+the+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Biology%22%5BJournal%5D)">NMJ-morph reveals principal components of synaptic morphology influencing structure-function relationships at the neuromuscular junction.</a> Open Biology. 6 (12), 160240(2016).</li>
<li>Waerhaug, O., Lømo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+causing+different+properties+at+neuromuscular+junctions+in+fast+and+slow+rat+skeletal+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22Anatomy+and+Embryology%22%5BJournal%5D)">Factors causing different properties at neuromuscular junctions in fast and slow rat skeletal muscles.</a> Anatomy and Embryology. 190, 113-125 (1994).</li>
<li>Wood, S. J., Slater, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+contribution+of+postsynaptic+folds+to+the+safety+factor+for+neuromuscular+transmission+in+rat+fast-+and+slow-twitch+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">The contribution of postsynaptic folds to the safety factor for neuromuscular transmission in rat fast- and slow-twitch muscles.</a> Journal of Physiology. 500, 165-176 (1997).</li>
<li>Prakash, Y. S., Miller, S. M., Huang, M., Sieck, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphology+of+diaphragm+neuromuscular+junctions+on+different+fibre+types%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurocytology%22%5BJournal%5D)">Morphology of diaphragm neuromuscular junctions on different fibre types.</a> Journal of Neurocytology. 25, 88-100 (1996).</li>
<li>Murray, L. M., Gillingwater, T. H., Parson, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+mouse+cranial+muscles+to+investigate+neuromuscular+pathology+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neuromuscular+Disorders%22%5BJournal%5D)">Using mouse cranial muscles to investigate neuromuscular pathology in vivo.</a> Neuromuscular Disorders. 20 (11), 740-743 (2010).</li>
<li>Mejia Maza, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMJ-Analyser%3A+high-throughput+morphological+screening+of+neuromuscular+junctions+identifies+subtle+changes+in+mouse+neuromuscular+disease+models%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">NMJ-Analyser: high-throughput morphological screening of neuromuscular junctions identifies subtle changes in mouse neuromuscular disease models.</a> bioRxiv. , (2020).</li>
<li>Burke, S. R. A., Reed, E. J., Romer, S. H., Voss, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Levator+auris+longus+preparation+for+examination+of+mammalian+neuromuscular+transmission+under+voltage+clamp+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Levator auris longus preparation for examination of mammalian neuromuscular transmission under voltage clamp conditions.</a> Journal of Visualized Experiments. (135), e57482(2018).</li>
<li>Franco, J. A., Kloefkorn, H. E., Hochman, S., Wilkinson, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+adult+mouse+muscle-nerve+preparation+for+studying+the+firing+properties+of+muscle+afferents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">An in vitro adult mouse muscle-nerve preparation for studying the firing properties of muscle afferents.</a> Journal of Visualized Experiments. (91), e51948(2014).</li>
<li>Brill, M. S., Marinkovic, P., Misgeld, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+photo-bleaching+to+delineate+single+Schwann+cells+at+the+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Sequential photo-bleaching to delineate single Schwann cells at the neuromuscular junction.</a> Journal of Visualized Experiments. (71), e4460(2013).</li>
<li>Murray, L., Gillingwater, T. H., Kothary, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+the+transversus+abdominis+muscle+for+whole-mount+neuromuscular+junction+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Dissection of the transversus abdominis muscle for whole-mount neuromuscular junction analysis.</a> Journal of Visualized Experiments. (83), e51162(2014).</li>
<li>Tsang, Y. M., Chiong, F., Kuznetsov, D., Kasarskis, E., Geula, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+neurons+are+rich+in+non-phosphorylated+neurofilaments%3A+cross-species+comparison+and+alterations+in+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Motor neurons are rich in non-phosphorylated neurofilaments: cross-species comparison and alterations in ALS.</a> Brain Research. 861 (1), 45-58 (2000).</li>
<li>Balice-Gordon, R. J., Thomposon, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+organization+and+development+of+compartmentalized+innervation+in+rat+extensor+digitorum+longus+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">The organization and development of compartmentalized innervation in rat extensor digitorum longus muscle.</a> Journal of Physiology. 398, 211-231 (1988).</li>
<li>Cipriani, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuromuscular+junction+changes+in+a+mouse+model+of+Charcot-Marie-Tooth+disease+type+4C%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Science%22%5BJournal%5D)">Neuromuscular junction changes in a mouse model of Charcot-Marie-Tooth disease type 4C.</a> International Journal of Molecular Science. 19 (12), 4072(2018).</li>
<li>Boido, M., Vercelli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuromuscular+junctions+as+key+contributors+and+therapeutic+targets+in+spinal+muscular+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroanatomy%22%5BJournal%5D)">Neuromuscular junctions as key contributors and therapeutic targets in spinal muscular atrophy.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 10 (6), (2016).</li>
<li>Barik, A., Li, L., Sathyamurthy, A., Xiong, W. -C., Mei, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schwann+cells+in+neuromuscular+junction+formation+and+maintenance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Schwann cells in neuromuscular junction formation and maintenance.</a> Journal of Neuroscience. 36 (38), 9770-9781 (2016).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Neste artigo, apresentamos um protocolo detalhado para a dissecção de dois músculos esqueléticos de ratos (um contração lenta e outro de contração rápida), isolamento muscular de fibras e detecção de imunofluorescência de marcadores pré e pós-sinápticos para avaliar quantitativamente as alterações do NMJ, bem como processos de montagem/desmontagem. Esse tipo de protocolo pode ser útil nos modelos de roedores41,42 para avaliar nmj durante processos fisiológicos ou...

A junção neuromuscular do mamífero (NMJ) é uma grande sinapse tripartite colinérgica composta pelo nervo do neurônio motor, a membrana pós-sináptica na fibra muscular esquelética e as células schwann terminais1,2,3. Esta sinapse apresenta alta plasticidade morfológica e funcional4,5,6,7,8, mesmo durante a idade adulta, quando os NMJs podem sofrer modificações estruturais dinâmicas. Por exemplo, alguns pesquisadores têm mostrado que terminações nervosas motoras mudam continuamente sua forma na escala de micrômetros9. Também foi relatado que a morfologia do NMJ responde aos requisitos funcionais, uso alterado, envelhecimento, exercício ou variações na atividade locomotor4,10,11,12,13,14,15. Assim, o treinamento e a falta de uso representam estímulos essenciais para modificar algumas características do NMJ, como seu tamanho, comprimento, dispersão de vesículas e receptores sinápticos, bem como ramificação terminal nervoso14,16,17,18,19,20.
Além disso, foi demonstrado que qualquer alteração estrutural ou degeneração dessa junção vital poderia resultar em morte celular do neurônio motor e atrofia muscular21. Acredita-se também que a comunicação alterada entre nervos e músculos poderia ser responsável pelas alterações fisiológicas relacionadas à idade do NMJ e possivelmente por sua destruição em estados patológicos. O desmantelamento da junção neuromuscular desempenha um papel crucial no surgimento da Esclerose Lateral Amiotrófica (ELA), doença neurodegenerativa que constitui um dos melhores exemplos de interação músculo-nervo prejudicada3. Apesar dos inúmeros estudos realizados sobre a disfunção do neurônio motor, ainda se debate se a deterioração observada na ELA ocorre devido ao dano direto no neurônio motor e, em seguida, estende-se às projeções cortico-espinhais22; ou se deve ser considerada como uma axonopatia distal onde a degeneração começa nas terminações nervosas e progride em direção ao neurônio motor somas23,24. Dada a complexidade da patologia da ELA, é lógico considerar que ocorre uma mistura de processos independentes. Como o NMJ é o ator central da interação fisiopatológica entre músculo e nervo, sua desestabilização representa um ponto crucial na origem da doença que é relevante a ser analisada.
O sistema neuromuscular de mamíferos é funcionalmente organizado em unidades motoras discretas, consistindo de um neurônio motor e as fibras musculares que são exclusivamente inervadas pelo seu terminal nervoso. Cada unidade motora possui fibras com propriedades estruturais e funcionais semelhantes ou idênticas25. O recrutamento seletivo do neurônio motor permite otimizar a resposta muscular às demandas funcionais. Agora está claro que os músculos esqueléticos dos mamíferos são compostos de quatro tipos diferentes de fibras. Alguns músculos são nomeados de acordo com as características de seu tipo de fibra mais abundante. Por exemplo, o soleus (um músculo posterior do membro posterior envolvido na manutenção da postura corporal) possui a maioria das unidades de contração lenta (tipo 1) e é reconhecido como um músculo lento. Em vez disso, o extensor digitorum longus (EDL) é essencialmente composto de unidades com propriedades semelhantes de contração rápida (fibras tipo 2) e é conhecido como um músculo rápido especializado para movimentos filásticos necessários para a locomoção. Em outras palavras, embora os músculos adultos sejam de natureza plástica devido às influências hormonais e neurais, sua composição de fibras determina a capacidade de realizar diferentes atividades, como visto no soleus que experimenta atividade contínua de baixa intensidade e EDL que exibe uma contração única mais rápida. Outras características que são variáveis entre diferentes tipos de fibras musculares estão relacionadas à sua estrutura (conteúdo mitocondrial, extensão do ânticulo sarcoplasmático, espessura da linha Z), teor de myosina ATPase e composição da cadeia pesada de miosina26,27,28,29.
Para os NMJs roedores, há diferenças significativas entre os músculos28,29. Análises morfométricas realizadas em soleus e EDL de ratos revelaram uma correlação positiva entre a área sináptica e o diâmetro da fibra (ou seja, a área sináptica em fibras lentas soleus é maior do que nas fibras rápidas EDL), mas a razão entre a área de NMJ e o tamanho da fibra é semelhante em ambos os músculos30,31. Além disso, em relação aos terminais nervosos, as áreas absolutas da placa endplate nas fibras tipo 1 foram menores do que nas fibras tipo 2, enquanto a normalização por diâmetro de fibras fez áreas de terminais nervosos nas fibras tipo 1 as maiores32.
No entanto, pouquíssimos estudos se concentram na análise morfométrica para mostrar as evidências de mudanças em alguns dos componentes do NMJ33,34. Assim, devido à relevância do NMJ na função do organismo, cuja morfologia e fisiologia são alteradas em diversas patologias, é importante otimizar protocolos de dissecção de diferentes tipos de músculos com qualidade suficiente para permitir a visualização de toda a estrutura do NMJ. Também é necessário avaliar a ocorrência de alterações pré ou pós-sinápticas em diferentes situações experimentais ou condições como envelhecimento ou exercício35,36,37,38. Além disso, pode ser útil evidenciar alterações mais sutis em componentes do NMJ, como a fosforilação de neurofilamento alterada nas terminações nervosas terminais terminais, conforme relatado na ALS39.

<table><tbody><tr><td>Estereomicroscópio com iluminação de luz fria</td><td>Nikon</td><td>SMZ-10A</td><td></td></tr><tr><td>Plataforma de balanço</td><td>Biometra (WT 16)</td><td>042-500</td><td></td></tr><tr><td>Óculos de cobertura (24 x 32 mm)</td><td>Lâminas</td><td>de microscópio Deltalab D102432</td><td></td></tr><tr><td>Premium (Plus)</td><td>PORLAB</td><td>PC-201-16</td><td></td></tr><tr><td>Pinças</td><td>FST</td><td>11253-20</td><td></td></tr><tr><td>Uniband LA-4C Tesoura 125mm</td><td>E.M.S</td><td>77910-26</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas cirúrgicas disponíveis #10</td> Seringa estéril disponível <td>Sakira Medical</td><td>1567</td><td></td></tr><tr><td>(1 ml)</td>Caneta Super PAP <td>Sakira Medical</td><td>1569</td><td></td></tr><tr><td></td><td>E.M.S</td><td>71310</td><td></td></tr><tr><td>100 &mu; l ou 200 &mu; l pipeta</td><td>Finnpipette</td><td>9400130</td><td></td></tr><tr><td>microscópio confocal</td><td>Zeiss</td><td>LSM 800 - AiryScan</td><td></td></tr><tr><td>NTac:SD-TgN(SOD1G93A)L26H ratos</td><td>Taconic</td><td>2148-M</td><td></td></tr><tr><td>1X PBS (Dulbecco)</td><td>Gibco</td><td>21600-010</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeído</td><td>Sigma</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Glicina</td><td>Amresco</td><td>167</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Bio Basic INC.</td><td>9048-46-8</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Mallinckrodt</td><td>5092</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Amresco</td><td>497</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Neurofilamento Purificado H (NF-H), Anticorpo Fosforilado</td><td>BioLegend</td><td>801601</td><td>Anteriormente Covance # SMI 31P</td></tr><tr><td>Anti-Neurofilamento Purificado H (NF-H), Anticorpo Não Fosforilado</td><td>BioLegend</td><td>801701</td><td>Anteriormente Covance # SMI-32P</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 cabra anti-Mouse IgG (H + L)</td> <td>Thermo Scientific</td><td>A11029</td><td></td></tr><tr><td>&alpha; -Bungarotoxina, conjugado de biotina-XX</td><td>Invitrogen</td><td>B1196</td><td></td></tr><tr><td>Estreptavidina, Alexa Fluor 555 conjugado</td><td>Invitrogen</td><td>S32355</td><td></td></tr><tr><td>Diaminofenilindol (DAPI)</td> <td>Sigma</td><td>D8417</td><td></td></tr></tbody></table>

dissecção de fibras musculares esqueléticas únicas para análises imunofluorescentes e morfométricas de junções neuromusculares de monte inteiro

Dissection of Single Skeletal Muscle Fibers for Immunofluorescent and Morphometric Analyses of Whole-Mount Neuromuscular Junctions

A junção neuromuscular (NMJ) é um ponto de contato especializado entre o nervo motor e o músculo esquelético. Esta sinapse periférica exibe alta plasticidade morfológica e funcional. Em numerosos distúrbios do sistema nervoso, nMJ é um alvo patológico precoce resultando em falha de neurotransmissão, fraqueza, atrofia e até mesmo na morte da fibra muscular. Devido à sua relevância, a possibilidade de avaliar quantitativamente certos aspectos da relação entre os componentes do NMJ pode ajudar a compreender os processos associados à sua montagem/desmontagem. O primeiro obstáculo ao trabalhar com músculos é obter a expertise técnica para identificar e dissecar rapidamente sem danificar suas fibras. O segundo desafio é utilizar métodos de detecção de alta qualidade para obter imagens NMJ que possam ser usadas para realizar análise quantitativa. Este artigo apresenta um protocolo passo-a-passo para dissecar extensor digitorum longus e soleus músculos de ratos. Também explica o uso da imunofluorescência para visualizar elementos pré e postingaptáticos de NMJs de montagem integral. Os resultados obtidos demonstram que essa técnica pode ser usada para estabelecer a anatomia microscópica da sinapse e identificar alterações sutis no status de alguns de seus componentes em condições fisiológicas ou patológicas.

Este protocolo oferece um método simples para isolar e imunostain fibras musculares de dois tipos diferentes de músculos (músculos de contração rápida e lenta, ver Figura 1). Utilizando os marcadores e/ou sondas corretos, os componentes do NMJ podem ser detectados e avaliados, uma vez que um ponto de vista quantitativo para avaliar algumas das alterações morfológicas que podem ocorrer como consequência da progressão da doença ou de um tratamento medicamentoso específico. No presente estudo, ...

A capacidade de detectar com precisão componentes de junção neuromuscular é crucial na avaliação de modificações em sua arquitetura devido a processos patológicos ou de desenvolvimento. Aqui apresentamos uma descrição completa de um método simples para obter imagens de alta qualidade de junções neuromusculares de montagem inteira que podem ser usadas para realizar medições quantitativas.

Dissecção de fibras musculares esqueléticas únicas para análises imunofluorescentes e morfométricas de junções neuromusculares de monte inteiro

The neuromuscular junction (NMJ) is a specialized point of contact between the motor nerve and the skeletal muscle. This peripheral synapse exhibits high ...

Dissecção de fibras musculares esqueléticas únicas para análises imunofluorescentes e morfométricas de junções neuromusculares de montagem inteira. Este vídeo demonstrará um protocolo para dissecar os músculos EDL e soleus de forma eficaz e segura com uma abordagem repetível. Este vídeo também ensinará como obter junções neuromusculares de montagem total com o objetivo de reconhecer componentes sinápticos com integridade 3D para permitir uma análise morfométrica precisa.Para dissecar os músculos, esses instrumentos cirúrgicos são necessários. Para iniciar o procedimento, coloque o animal com o abdômen voltado para cima. Faça uma incisão inicial usando uma lâmina cirúrgica entre os dedos dos dedos dos membros traseiros.Retire a pele, puxando para cima até que o joelho direito seja exposto. Para encontrar o EDL, siga os tendões do pé até o ligamento anular. Este ligamento circunda dois tendões.Corte o ligamento com a tesoura Uniband entre os dois tendões. Identifique o tendão edl levantando ambos e vendo qual deles faz os dedos se moverem para cima. Corte o tendão com uma tesoura.Enquanto segura o tendão com pinças biológicas, comece a separar lentamente o músculo EDL dos outros músculos do membro traseiro. A separação do músculo sem causar danos pode ser feita fazendo vários cortes no resto dos músculos laterais para abrir um caminho entre eles, enquanto segura e levanta o músculo da parte de divisão do tendão edl. Para isolar completamente o músculo, corte o tendão que está preso ao joelho do rato usando uma tesoura Uniband.Mergulhe o músculo dissecado na solução fixativa, e deixe-o por 24 horas a quatro graus Celsius. Em geral, é útil ter um músculo alongado. Para isso, use papelão e grampos para fixar o músculo para fixação.Para isolar o músculo soleus, vire o animal. Através da pele, corte o tendão calcâneo usando uma lâmina cirúrgica. Com a ajuda da pinça biológica e da tesoura Uniband, separe o músculo gastrocnemius dos ossos, criando uma tampa muscular.O soleus estará no lado interno da tampa muscular. Pode ser identificado porque é vermelho e plano. Com um par de pinças biológicas, alcance e levante o tendão do soleus que fica acima do gastrocnemius.Corte o tendão com uma tesoura Uniband. Levante todo o músculo enquanto corta alguns dos pontos fracos de fixação. Finalmente, para libertar completamente o músculo soleus, corte a vesícula soleus que forma o tendão calcâneo.Repita a etapa de fixação como feito com o músculo EDL. Para usar este método, é importante fixar os grampos nos tendões e não no músculo. Uma vez passado o período de fixação de 24 horas, enxágue os músculos na solução DPBS antes de começar a isolar as fibras musculares.Para isolar as fibras, segure suavemente um dos tendões com um par de pinças biológicas. Em seguida, com o outro par de pinças biológicas, comece a lentamente beliscar o tendão para separar as fibras musculares. Para isolar as fibras, puxe lentamente para cima em direção ao tendão muscular oposto.Será necessário repetir essa ação várias vezes até obter múltiplos, pequenos e isolados pacotes. Uma vez separados em pequenos feixes isolados, coloque-os cuidadosamente em um slide silanizado pré-tratado. É necessário manter todas as fibras ordenadas para que elas não se sobreponham.Neste ponto, as fibras podem ser deixadas para secar ao ar por 24 horas. Depois de 24 horas, comece a imunossuagem. Para criar uma barreira impermeável, use uma caneta PAP para cercar as fibras musculares isoladas no slide pré-tratado.Este é um exemplo de uma imagem confocal de alta resolução que pode ser obtida seguindo o protocolo descrito aqui. No canto superior esquerdo, o elemento pós-sináptico é mostrado, e no canto superior direito, o elemento pré-sináptico, enquanto as imagens inferiores mostram os componentes sinápticos esquematizados a fim de ilustrar os parâmetros que serão usados para análise morfométrica. O segundo slide mostra a fusão dos sinais pré e pós-sinápticos com a mancha de núcleo da API.As diferenças entre as junções neuromusculares de animais transgênicos e animais não transgênicos são claramente visíveis. A análise morfométrica das junções neuromusculares mostra evidências do sinal pós-sináptico em animais transgênicos e parece ser mais compacta, principalmente devido à redução da área total da junção neuromuscular. Como mostrado aqui, a junção neuromuscular área pré-sináptica do animal transgênico é reduzida.O menor detectado foi o encontrado com sinal de neurofilamento antifosforylated, como mostrado na imagem B, por exemplo. A última imagem mostra os resultados relativos ao estado das junções neuromusculares de montagem total. Utilizando o índice de cobertura, foi estabelecido que as junções neuromusculares transgênicas foram encontradas parcialmente denervadas.Além disso, pode determinar que a cobertura e o nexo do neurofilamento fosfoilado é menor do que o obtido quando um neurofilamento não fosfoilado é detectado. O protocolo proposto permite obter preparações de junção neuromuscular de alta qualidade a partir de fibras musculares lentas e rápidas. Os componentes de junção neuromuscular pré e pós-sináptica foram identificados por sondas ou anticorpos específicos e, em seguida, retratados em microscopia confocal ou super-resolução, permitindo a análise morfométrica em escala micrométrica.

dissection-single-skeletal-muscle-fibers-for-immunofluorescent

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Dissecção e imagem das Zonas de Ativos no Drosophila Junção neuromuscular

Visualizando as células individuais em tecidos densamente compactados, tais como as células de Schwann terminais (SCs) em junções neuromusculares (NMJs), é um desafio. "Sequential foto-branqueamento" permite delinear SCs terminais individuais, por exemplo, no explante triangularis músculo Sterni, uma preparação conveniente nervo-músculo, onde sequencial de branqueamento podem ser combinados com o lapso de tempo de imagem...

Sequencial de foto-branqueamento de delinear células de Schwann individuais na junção neuromuscular

Fonte: Marinello, M., et al. Caracterização de junções neuromusculares em camundongos por microscopia confocal e super-resolução combinada. J. Vis. Exp. (2021)Este vídeo demonstra a preparação, imunocoloração e imagem de junções neuromusculares no tecido muscular de ratos usando microscopia confocal e de super-resolução para visualizar e analisar estruturas pré-sinápticas e pós-sinápticas.

Caracterização de junções neuromusculares em camundongos por microscopia combinada confocal e super-resolução

Neste vídeo demonstramos um protocolo de dissecção do músculo transversus abdominis do camundongo e usamos imunofluorescência e microscopia para visualizar junções neuromusculares.

Dissecção do Músculo Transversus Abdominis para Análise de Junção Neuromuscular de Montagem Integral

A junção neuromuscular (JNM) é alterada em uma variedade de condições que às vezes podem culminar em insuficiência sináptica. Este relatório descreve métodos baseados em microscópio de fluorescência para quantificar essas mudanças estruturais.

A Junção Neuromuscular: Synapse Medir o tamanho, Mudanças de fragmentação e em Synaptic Density proteína utilizando microscopia de fluorescência confocal

Nós descrevemos uma nova técnica experimental que chamamos minimamente invasiva músculo incorporação (MIME), que se baseia a evidência de que o tecido muscular esquelético contém células miogênico viáveis que podem facilitar o doador-mediada por células myogenesis quando implantado em um músculo do hospedeiro.

Minimamente invasivo músculo incorporação (MIME) - uma nova técnica Experimental para facilitar Myogenesis doador-mediada por células

Este protocolo descreve um método para análise morfométrica de junções neuromusculares por microscopia confocal combinada e STED que é usado para quantificar alterações patológicas em modelos de camundongos de SMA e CMS relacionada ao ColQ.

Caracterização de Junções Neuromusculares em Camundongos por Microscopia Confocal Combinada e Super-Resolução

O protocolo mostra um método para examinar a correlação espacial entre os terminais pré-sinápticos, receptores pós-sinápticos e células schwann peri-sinápticas no músculo gastrocnemius medial de ratos usando imunohistoquímica fluorescente com diferentes biomarcadores, ou seja, neurofilamento 200, transporte de acetilcholina vesicular, alfa-bungarotoxina e S100.

Visualizando as Características Morfológicas da Junção Neuromuscular no Músculo Gastrocnemius De Rato Medial

Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para visualizar as redes de microtúbulos nas junções neuromusculares e células musculares. Combinado com as poderosas ferramentas genéticas de Drosophila melanogaster, este protocolo facilita muito a triagem genética e a análise da dinâmica de microtúbulos para o papel das proteínas reguladoras da rede de microtúbulos no sistema nervoso.

Usando a junção neuromuscular de larvas de Drosophila e células musculares para visualizar a rede de microtúbulos

Descrevemos um protocolo para obtenção de fibras enzimaticamente dissociadas de diferentes comprimentos e tipos de seis músculos de camundongos adultos: três deles já descritos (flexor curto dos dedos, extensor longo dos dedos, sóleo) e três deles dissociados com sucesso pela primeira vez (extensor longo do hálux, fibular longo, fibular dos dígitos).

Fibras musculares esqueléticas curtas, intermediárias e longas intactas obtidas por dissociação enzimática de seis músculos dos membros posteriores de camundongos: além do flexor curto dos dedos

Injeções locais de um corante mitocondrial marcando mitocôndrias da célula terminal de Schwann in vivo para microscopia confocal. Esse método utiliza prova de conceito demonstrada em tecido muscular esquelético de camundongos com músculo saudável ou doente para fornecer visualização mitocondrial de alta resolução.

Métodos para Quantificação In Situ da Morfologia Mitocondrial em Células Musculares e Terminais de Schwann de Camundongos

Aprenda a dissecar fibras musculares esqueléticas de ratos para análise imunofluorescente e morfométrica de junções neuromusculares em monte inteiro. Este método permite visualização de alta resolução de componentes pré e pós-sinápticos.

Dissecção de fibras musculares esqueléticas únicas para análises imunofluorescentes e morfométricas de junções neuromusculares de monte inteiro (Vídeo) | JoVE Journal

Dissecção de fibras musculares esqueléticas únicas para análises imunofluorescentes e morfométricas de junções neuromusculares de monte inteiro

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