Name: Ultracentrifugação de gradiente de densidade para investigar a reciclagem endócítica em células mamíferas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-30T13:15:00.000+00:00
Duration: 5 min 13 s
Description: Aprenda a isolar endossomos de reciclagem em células mamíferas usando ultracentrifugação em gradiente de sacarose. Este método facilita o estudo do tráfego proteico via vias endocíticas em amostras de tecidos e células.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este trabalho foi apoiado por fundos do Research Grants Council Hong Kong, cuhk direct grant scheme, United College endowment fund, e tuyf Charitable Trust. Os números deste trabalho foram adaptados de nossa publicação anterior, "ARF6-Rac1- a propagação de neurite mediada por sinalização é potencializado pelo adaptador neuronal FE65 através da orquestração ARF6 e ELMO1" publicada no FASEB Journal em outubro de 2020.

1. Cultura e transfecção de células mamíferas
<ol><li>Placa 2 x 106 células em um prato de cultura de 100 mm. Use quatro pratos para cada transfecção. NOTA: O número de células necessárias pode variar para diferentes linhas celulares. A otimização pode ser necessária antes de prosseguir para a etapa de isolamento.</li>
	<li>No dia seguinte, transfete as células com Lipofectamina de acordo com as instruções do fabricante.</li>
</ol>2. Colheita celular
<ol><li>Descarte o meio de cultura 48 h pós-transfecção.</li>
	<li>Lave as células com PBS gelado (fosfatos de sódio de 10 mM, cloreto de potássio de 2,68 mM, cloreto de sódio de 140 mM) duas vezes.</li>
	<li>Adicione 1 mL de PBS gelado+ (PBS complementado com coquetel inibidor de protease 0,5x e coquetel inibidor de fosfatase de 0,5x) a cada prato.</li>
	<li>Colete as células com um raspador de células e transfira a suspensão celular para um tubo de centrífuga de 15 mL.</li>
	<li>Pelota as células por centrifugação usando um rotor de balde de balanço a 400 x g por 5 min.</li>
	<li>Descarte o supernatante e resuspenque a pelota celular suavemente em 5 mL de tampão de homogeneização (HB; 250 mM de sacarose, 3 mM imidazol no pH 7.4, 1 mM EDTA complementado com 0,03 mM cicloheximida, coquetel inibidor de protefase 1xase e 1xxphosphatase inibidor).</li>
	<li>Colete as células por centrifugação a 1.300 x g por 10 min.</li>
	<li>Resuspense a pelota de célula em 1 mL de HB.</li>
	<li>Homogeneize as células com um homogeneizador do Dounce para 15-20 derrames. NOTA: Outros métodos de homogeneização, por exemplo, passando a amostra através de uma seringa, poderiam ser utilizados. A eficiência de homogeneização poderia ser revelada observando o homogeneizado sob um microscópio de contraste de fase.</li>
	<li>Transfira o homogeneizar para um tubo de centrifugação de 2 mL. NOTA: Colher 50 μL de homogeneizar com 12,5 μL de tampão de amostra de 5x e rotulá-lo como total lysate.</li>
	<li>Adicione 0,7 mL de HB ao homogeneizar.</li>
	<li>Gire o homogenate diluído a 2.000 x g por 10 min a 4 °C. NOTA: A pelota contém núcleos e células ininterruptas.</li>
	<li>Colete 1,5 mL do supernaspe e repita o passo 2.12 uma vez.</li>
	<li>Colete 1,4 mL do supernante e rotule-o como supernante pós-nuclear (PNS).</li>
</ol>3. Preparação da coluna de gradiente de densidade
<ol><li>Transfira 1,2 mL de PNS para um tubo ultracentrífuga.</li>
	<li>Adicione 1 mL de solução de sacarose de 62% (2,351 M de sacarose, 3 mM de imidazol no pH 7.4) à amostra e misture bem por tubulação suave. NOTA: A solução resultante é uma solução de sacarose de 40,6%.</li>
	<li>Adicione 3,3 mL de solução de sacarose de 35% (1,177 M de sacarose, 3 mM imidazol no pH 7.4) cuidadosamente em cima da amostra.</li>
	<li>Adicione 2,2 mL de solução de sacarose de 25% (0,806 M de sacarose, 3 mM imidazol no pH 7.4) cuidadosamente em cima da solução de 35% de sacarose. NOTA: O índice refrativo das soluções de sacarose de 62%, 40,6%, 35% e 25% à temperatura ambiente são 1,44, 1,40, 1,39 e 1,37, respectivamente. Os índices refrativos das soluções de sacarose poderiam ser verificados com um refratômetro para garantir a precisão e consistência do experimento.</li>
	<li>Encha o tubo de ultracentrifugação com HB. NOTA: Armazene temporariamente a coluna de gradiente de densidade preparada a 4 °C.</li>
</ol>4. Fracionamento e recuperação da fração contendo endosome de reciclagem
<ol><li>Centrifugar a coluna a 210.000 x g por 3 h a 4 °C.</li>
	<li>Colete 12 frações (1 mL cada) cuidadosamente, começando a partir da parte superior do gradiente. NOTA: Os endossomos de reciclagem devem ser encontrados na interface entre 35% e 25% de soluções de sacarose. As frações coletadas podem ser congeladas em nitrogênio líquido e armazenadas a -80 °C.</li>
	<li>Diluir todas as frações com 1 mL de tampão de diluição (3 mM imidazol em pH 7,4, 1 mM EDTA).</li>
	<li>Centrifugar a amostra diluída a 100.000 x g por 1 h a 4 °C.</li>
	<li>Aspire o supernasal e adicione 50 μL de tampão de amostra de 1x para colher as frações.</li>
	<li>Analise o conteúdo da proteína nas frações por manchas ocidentais.</li>
</ol>

<ol><li>Elkin, S. R., Lakoduk, A. M., Schmid, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocytic+pathways+and+endosomal+trafficking%3A+a+primer%5BTitle%5D)+AND+%22Wiener+Medizinische+Wochenschrift%22%5BJournal%5D)">Endocytic pathways and endosomal trafficking: a primer.</a> Wiener Medizinische Wochenschrift. 166 (7-8), 196-204 (2016).</li>
<li>Kumari, S., Mg, S., Mayor, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocytosis+unplugged%3A+multiple+ways+to+enter+the+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Endocytosis unplugged: multiple ways to enter the cell.</a> Cell Research. 20 (3), 256-275 (2010).</li>
<li>Naslavsky, N., Caplan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+enigmatic+endosome+-+sorting+the+ins+and+outs+of+endocytic+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">The enigmatic endosome - sorting the ins and outs of endocytic trafficking.</a> Journal of Cell Science. 131 (13), (2018).</li>
<li>Cullen, P. J., Steinberg, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((To+degrade+or+not+to+degrade%3A+mechanisms+and+significance+of+endocytic+recycling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">To degrade or not to degrade: mechanisms and significance of endocytic recycling.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 19, 679-696 (2018).</li>
<li>Weeratunga, S., Paul, B., Collins, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognising+the+signals+for+endosomal+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Recognising the signals for endosomal trafficking.</a> Current Opinion in Cell Biology. 65, 17-27 (2020).</li>
<li>Khan, I., Steeg, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocytosis%3A+a+pivotal+pathway+for+regulating+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Endocytosis: a pivotal pathway for regulating metastasis.</a> British Journal of Cancer. 124 (1), 66-75 (2021).</li>
<li>Grant, B. D., Donaldson, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathways+and+mechanisms+of+endocytic+recycling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Pathways and mechanisms of endocytic recycling.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 10 (9), 597-608 (2009).</li>
<li>Maxfield, F. R., McGraw, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocytic+recycling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Endocytic recycling.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 5 (2), 121-132 (2004).</li>
<li>McDonald, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Explosion+in+the+complexity+of+membrane+protein+recycling%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Explosion in the complexity of membrane protein recycling.</a> American Journal of Physiology. Cell Physiology. 320 (4), 483-494 (2021).</li>
<li>O'Sullivan, M. J., Lindsay, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Endosomal+Recycling+pathway-at+the+crossroads+of+the+cell%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">The Endosomal Recycling pathway-at the crossroads of the cell.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (17), 6074(2020).</li>
<li>D'Souza-Schorey, C., Li, G., Colombo, M. I., Stahl, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+regulatory+role+for+ARF6+in+receptor-mediated+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A regulatory role for ARF6 in receptor-mediated endocytosis.</a> Science. 267 (5201), New York, N. Y. 1175-1178 (1995).</li>
<li>Schweitzer, J. K., Sedgwick, A. E., D'Souza-Schorey, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ARF6-mediated+endocytic+recycling+impacts+cell+movement%2C+cell+division+and+lipid+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">ARF6-mediated endocytic recycling impacts cell movement, cell division and lipid homeostasis.</a> Seminars in Cell and Developmental Biology. 22 (1), 39-47 (2011).</li>
<li>Finicle, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sphingolipids+inhibit+endosomal+recycling+of+nutrient+transporters+by+inactivating+ARF6%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Sphingolipids inhibit endosomal recycling of nutrient transporters by inactivating ARF6.</a> Journal of Cell Science. 131 (12), (2018).</li>
<li>Lu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((APE1+upregulates+MMP-14+via+redox-sensitive+ARF6-mediated+recycling+to+promote+cell+invasion+of+esophageal+adenocarcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">APE1 upregulates MMP-14 via redox-sensitive ARF6-mediated recycling to promote cell invasion of esophageal adenocarcinoma.</a> Cancer Research. 79 (17), 4426-4438 (2019).</li>
<li>Qi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arf6-driven+endocytic+recycling+of+CD147+determines+HCC+malignant+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+and+Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Arf6-driven endocytic recycling of CD147 determines HCC malignant phenotypes.</a> Journal of Experimental and Clinical Cancer Research. 38 (1), 471(2019).</li>
<li>Crupi, M. J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GGA3-mediated+recycling+of+the+RET+receptor+tyrosine+kinase+contributes+to+cell+migration+and+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">GGA3-mediated recycling of the RET receptor tyrosine kinase contributes to cell migration and invasion.</a> Oncogene. 39 (6), 1361-1377 (2020).</li>
<li>Gamara, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+Arf6+deletion+in+PLB-985+differentiated+in+neutrophil-like+cells+and+in+mouse+neutrophils%3A+impact+on+adhesion+and+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Mediators+of+Inflammation%22%5BJournal%5D)">Assessment of Arf6 deletion in PLB-985 differentiated in neutrophil-like cells and in mouse neutrophils: impact on adhesion and migration.</a> Mediators of Inflammation. 2020, 2713074(2020).</li>
<li>Santy, L. C., Ravichandran, K. S., Casanova, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DOCK180%2FElmo+complex+couples+ARNO-mediated+Arf6+activation+to+the+downstream+activation+of+Rac1%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">The DOCK180/Elmo complex couples ARNO-mediated Arf6 activation to the downstream activation of Rac1.</a> Current Biology. 15 (19), 1749-1754 (2005).</li>
<li>Wibo, M. Cell fractionation by centrifugation methods. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWibo%2C+M+%22Eukaryotic+Cell+Function+and+Growth%3A+Regulation+by+Intracellular+Cyclic+Nucleotides%22">Eukaryotic Cell Function and Growth: Regulation by Intracellular Cyclic Nucleotides</a>. Dumont, J. E., Brown, B. L., Marshall, N. J. , Springer. Boston, MA. 1-17 (1976).</li>
<li>Kelly, E. E., Horgan, C. P., McCaffrey, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rab11+proteins+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Society+Transactions%22%5BJournal%5D)">Rab11 proteins in health and disease.</a> Biochemical Society Transactions. 40 (6), 1360-1367 (2012).</li>
<li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+adaptor+FE65+stimulates+Rac1-mediated+neurite+outgrowth+by+recruiting+and+activating+ELMO1%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Neuronal adaptor FE65 stimulates Rac1-mediated neurite outgrowth by recruiting and activating ELMO1.</a> The Journal of Biological Chemistry. 293 (20), 7674-7688 (2018).</li>
<li>Chan, W. W. R., Li, W., Chang, R. C. C., Lau, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ARF6-Rac1+signaling-mediated+neurite+outgrowth+is+potentiated+by+the+neuronal+adaptor+FE65+through+orchestrating+ARF6+and+ELMO1%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%3A+Official+Publication+of+the+Federation+of+American+Societies+for+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">ARF6-Rac1 signaling-mediated neurite outgrowth is potentiated by the neuronal adaptor FE65 through orchestrating ARF6 and ELMO1.</a> FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 34 (12), 16397-16413 (2020).</li>
<li>Huber, L. A., Pfaller, K., Vietor, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organelle+proteomics%3A+implications+for+subcellular+fractionation+in+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Organelle proteomics: implications for subcellular fractionation in proteomics.</a> Circulation Research. 92 (9), 962-968 (2003).</li>
<li>Fleischer, S., Kervina, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+fractionation+of+rat+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Subcellular fractionation of rat liver.</a> Methods in Enzymology. 31, 6-41 (1974).</li>
<li>Marsh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endosome+and+lysosome+purification+by+free-flow+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Endosome and lysosome purification by free-flow electrophoresis.</a> Methods in Cell Biology. 31, 319-334 (1989).</li>
<li>Stasyk, T., Huber, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zooming+in%3A+fractionation+strategies+in+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Zooming in: fractionation strategies in proteomics.</a> Proteomics. 4 (12), 3704-3716 (2004).</li>
<li>Iordachescu, A., Hulley, P., Grover, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+for+the+collection+of+nanoscopic+vesicles+from+an+organotypic+culture+model%5BTitle%5D)+AND+%22RSC+Advances%22%5BJournal%5D)">A novel method for the collection of nanoscopic vesicles from an organotypic culture model.</a> RSC Advances. 8 (14), 7622-7632 (2018).</li>
<li>Chavrier, P., vander Sluijs, P., Mishal, Z., Nagelkerken, B., Gorvel, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+endosome+membrane+dynamics+characterized+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Early endosome membrane dynamics characterized by flow cytometry.</a> Cytometry. 29 (1), 41-49 (1997).</li>
<li>Chasan, A. I., Beyer, M., Kurts, C., Burgdorf, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+a+specialized%2C+antigen-loaded+early+endosomal+subpopulation+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation of a specialized, antigen-loaded early endosomal subpopulation by flow cytometry.</a> Methods in Molecular Biology. 960, 379-388 (2013).</li>
<li>Thapa, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphatidylinositol-3-OH+kinase+signaling+is+spatially+organized+at+endosomal+compartments+by+microtubule-associated+protein+4%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Phosphatidylinositol-3-OH kinase signaling is spatially organized at endosomal compartments by microtubule-associated protein 4.</a> Nature Cell Biology. 22 (11), 1357-1370 (2020).</li>
<li>Guimaraes de Araujo, M. E., Fialka, I., Huber, L. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGuimaraes+de+Araujo%2C+ME+%22Endocytic+Organelles%3A+Methods+For+Preparation+And+Analysis.+In+eLS%22">Endocytic Organelles: Methods For Preparation And Analysis. In eLS</a>. , John Wiley & Sons, Ltd. Hoboken, NJ. (2001).</li>
<li>Rickwood, D., Graham, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRickwood%2C+D+%22Centrifugation+Techniques%22">Centrifugation Techniques</a>. , John Wiley & Sons, Ltd. Hoboken, NJ. (2015).</li>
<li>Lamberti, G., de Araujo, M. E., Huber, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+macrophage+early+and+late+endosomes+by+latex+bead+internalization+and+density+gradient+centrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation of macrophage early and late endosomes by latex bead internalization and density gradient centrifugation.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (12), (2015).</li>
<li>Urbanska, A., Sadowski, L., Kalaidzidis, Y., Miaczynska, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+characterization+of+APPL+endosomes%3A+the+role+of+annexin+A2+in+APPL+membrane+recruitment%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Biochemical characterization of APPL endosomes: the role of annexin A2 in APPL membrane recruitment.</a> Traffic. 12 (9), Copenhagen, Denmark. 1227-1241 (2011).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm conflitos de interesse com o conteúdo deste artigo.

O protocolo acima descreve os procedimentos para isolar a reciclagem de endossóis de células cultivadas por ultracentrifugação. A confiabilidade desse método foi demonstrada pela últimapublicação 22, comprovando que os endosários de reciclagem são isolados com sucesso de outras organelas (Figura 1),como o aparelho golgi e mitocôndrias. Alguns passos críticos precisam ser atentos para obter um bom resultado de separação. Ao preparar as soluções de sacarose, recomenda-s...

O tráfico endossomal é um processo fisiológico essencial que implica vários eventos biológicos1, por exemplo, o transporte de receptores de sinalização, canais de íons e moléculas de adesão. Proteínas localizadas na membrana plasmática são internalizadas por endocitose2. As proteínas internalizadas são então classificadas pelo endosommaprecoce 3. Algumas das proteínas são direcionadas para lisesomos para degradação4. No entanto, uma quantidade significativa de proteínas são recicladas de volta à superfície celular por processos de reciclagem rápidos e lentas. Na reciclagem rápida, as proteínas deixam os endossos precoces e retornam diretamente à membrana plasmática. Por outro lado, na reciclagem lenta, as proteínas são primeiramente classificadas ao compartimento de reciclagem endóctico e depois transportadas de volta para a membrana plasmática. Várias proteínas de carga, por exemplo, clathrin, complexo retromer, complexo de recuperador e proteína da síndrome de Wiskott-Aldrich, e complexo SCAR Homologue (WASH), participam desses processos de reciclagem demembranas 4,5,6,7,8,9. O equilíbrio do evento de endocitose e reciclagem é crucial para a sobrevivência celular e contribui para diversos eventos celulares10, por exemplo, adesão celular, migração celular, polaridade celular e transdução de sinais.
ARF6, um pequeno GTPase, é um regulador relatado de tráfico endocítico7,11,12. De interesse, diversos grupos de pesquisa ilustraram a importância da ARF6 na reciclagem endocítica13,14,15,16,17. O estudo tem como objetivo investigar a relação entre o crescimento de neurite mediado pela ARF6 e a reciclagem endócítica. O relatório anterior sugere que a ativação do ARF6 é upstream para a atividade Rac1 através da atuação no complexo18(DOCK180) do ELMO1 . No entanto, ainda não está claro como o ARF6 aciona a sinalização rac1 mediada do ELMO1-DOCK180. A ultracentrifugação de gradiente de densidade foi empregada para investigar o papel da reciclagem endocítica mediada por ARF6 nesse processo. Com isso, a fração contendo endosome de reciclagem foi obtida a partir de lises celulares19. A fração foi submetida à mancha ocidental para análise de teor de proteínas. Os resultados do imunoblot revelaram que sob a presença de FE65, uma proteína adaptadora enriquecida pelo cérebro, a ARF6 ativa aumentou substancialmente o nível de ELMO1 na fração contendo endosome de reciclagem. O protocolo a seguir inclui os procedimentos para (1) transfecção de células mamíferas; (2) elaboração das amostras e colunas gradientes de densidade; e (3) obtenção da fração contendo endosome de reciclagem.

<table><tbody><tr><td>1 mL, tubo de polipropileno de parede espessa de topo aberto, 11 x 34 mm</td><td>Beckman Coulter</td><td>347287</td><td></td></tr><tr><td>placa de cultura de tecidos de 100 mm</td><td>SPL</td><td>20100</td><td></td></tr><tr><td>13,2 mL, tubo ultratransparente de parede fina de topo aberto certificado gratuitamente, 14 x 89 mm</td><td>Beckman Coulter</td><td>C14277</td><td></td></tr><tr><td>5x tampão de amostra</td><td>GenScript</td><td>MB01015</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete, coquetel de inibidor de protease sem EDTA</td><td>Roche</td><td>11873580001</td><td></td></tr><tr><td>COX IV (3E11) Tecnologia</td><td>de sinalização celular</td> mAb de coelho <td>4850S</td><td>Anticorpo monoclonal de coelho para detecção de COX IV.</td></tr><tr><td>Cicloheximida</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1988</td><td></td></tr><tr><td>Dounce Tissue Grinder, 7 mL</td><td>DWK Life Sciences</td><td>357542</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) com baixa glicose</td><td>HyClone</td><td>SH30021.01</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo ELMO1 (B-7)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-271519</td><td>Anticorpo monoclonal de camundongo para detecção de ELMO1.</td></tr><tr><td>EndoFree Plasmid Maxi Kit</td><td>QIAGEN</td><td>12362</td><td></td></tr><tr><td>FE65 anticorpo (E-20)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-19751</td><td>Anticorpo policlonal de cabra para detecção de FE65.</td></tr><tr><td>Soro bovino fetal, grau de pesquisa</td><td>HyClone</td><td>SV30160.03</td><td></td></tr><tr><td>GAPDH Anticorpo monoclonal (6C5)</td><td>Ambion</td><td>AM4300</td><td>Anticorpo monoclonal de camundongo para detecção de GAPDH.</td></tr><tr><td>Software ImageLab</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>Medição da intensidade da banda</td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I2399</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000 Reagente de transfecção</td><td>Invitrogen</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>Monoclonal Anti-&beta;-COP anticorpo</td><td>Sigma</td><td>G6160</td><td>Anticorpo monoclonal de camundongo para detecção de &beta;-COP.</td></tr><tr><td>Tecnologia de sinalização celular</td> <td>mAb de camundongo Myc-tag (9B11)</td><td>2276S</td><td>Anticorpo monoclonal de camundongo para detecção de proteínas marcadas com myc.</td></tr><tr><td>OmniPur EDTA, sal dissódico, dihidrato</td><td>Calbiochem</td><td>4010-OP</td><td></td></tr><tr><td>Optima L-100 XP</td><td>Beckman Coulter</td><td>392050</td><td></td></tr><tr><td>Optima MAX-TL</td><td>Beckman Coulter</td><td>A95761</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I Mídia de soro reduzida</td><td>Gibco</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>PBS Tablets</td><td>Gibco</td><td>18912014</td><td></td></tr><tr><td>PhosSTOP</td><td>Roche</td><td></td><td></td>4906845001</tr><tr><td>Anticorpo policlonal específico RAB11A</td><td>Proteintech</td><td>20229-1-AP</td><td>Anticorpo policlonal de coelho para detecção de Rab11.</td></tr><tr><td>Sacarose</td><td>Affymetrix</td><td>AAJ21931A4</td><td></td></tr><tr><td>SW 41 Ti Rotor de Balde Oscilante</td><td>Beckman Coulter</td><td>331362</td><td></td></tr><tr><td>TLA-120.2 Rotor de ângulo fixo</td><td>Beckman Coulter</td><td>362046</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,05%), vermelho de fenol</td><td>Gibco</td><td>25300062</td><td></td></tr></tbody></table>

ultracentrifugação de gradiente de densidade para investigar a reciclagem endócítica em células mamíferas

Density Gradient Ultracentrifugation for Investigating Endocytic Recycling in Mammalian Cells

O tráfico endossomal é um processo celular essencial que regula uma ampla gama de eventos biológicos. As proteínas são internalizadas da membrana plasmática e depois transportadas para os endossómos iniciais. As proteínas internalizadas podem ser transitadas para o lysosome para degradação ou recicladas de volta à membrana plasmática. Uma via robusta de reciclagem endócítica é necessária para equilibrar a remoção de materiais de membrana da endocitose. Várias proteínas são relatadas para regular a via, incluindo o fator de ribossiation ADP 6 (ARF6). A ultracentrifugação gradiente de densidade é um método clássico para fracionamento celular. Após a centrifugação, organelas são sedimentadas em sua superfície isopécnica. As frações são coletadas e usadas para outras aplicações a jusante. Descrito aqui é um protocolo para obter uma fração contendo endosome de células de mamíferos transfectadas usando ultracentrifugação de gradiente de densidade. As frações isoladas foram submetidas à mancha ocidental padrão para analisar seu conteúdo proteico. Ao utilizar este método, identificamos que o direcionamento da membrana plasmática do engolfamento e da motilidade celular 1 (ELMO1), um substrato de toxina botulínica C3 relacionado a Ras 1 (Rac1) fator de troca de nucleotídeos de guanina, é através da reciclagem endocítica mediada por ARF6.

Após fracionar as células HEK293 não traduzidas por ultracentrifugação gradiente de densidade, 12 frações foram coletadas a partir do topo do gradiente. As frações colhidas foram diluídas com o tampão de diluição em uma razão de 1:1 e submetidas a uma segunda rodada de centrifugação. As amostras foram então submetidas a manchas ocidentais para análise de seu conteúdo proteico. Como mostrado na Figura 1,o marcador de reciclagem endosome Rab11 é detectado na fração 720....

Este artigo tem como objetivo apresentar um protocolo para preparar endossóis de reciclagem de células mamíferas usando ultracentrifugação gradiente de densidade de sacarose.

Ultracentrifugação de gradiente de densidade para investigar a reciclagem endócítica em células mamíferas

Endosomal trafficking is an essential cellular process that regulates a broad range of biological events. Proteins are internalized from the plasma ...

Este protocolo ajuda a isolar os endossários de reciclagem contendo fração de células de mamíferos transfectadas para facilitar a investigação do tráfico de proteínas por meio do tráfico endocítico. Esta técnica é fácil de manusear e aplicável a amostras de tecido e células. Demonstrando o procedimento estará a Srta. Zhai Yu Qi, uma estudante de doutorado do Laboratório do Dr. Lao.Para começar, prato 2 vezes 10 para as 6 células em um prato de cultura de 100 milímetros. No dia seguinte, transfem as células com Lipofectamina de acordo com as instruções do fabricante. Para colher as células, descarte o meio de cultura 48 horas após a transfecção e lave as células duas vezes com PBS gelado.Em seguida, adicione um mililitro de PBS gelado suplementado com coquetel inibidor de protease 0,5X em coquetel inibidor de fosfatase 0,5X a cada prato. Em seguida, usando um raspador de células, colete as células e transfira a suspensão celular para um tubo de centrífuga de 15 mililitros. as células por centrifugação usando um rotor de balde de balanço.Descarte o supernatante e resuspenque a pelota da célula suavemente em cinco mililitros de tampão de homogeneização. Colete as células novamente por centrifugação e resuspense a pelota celular em um mililitro de buffer de homogeneização. Homogeneize as células com um Homogeneizador Dounce usando 15 a 20 derrames.Em seguida, transfira o homogonato para um tubo de centrifugação de dois mililitros. Adicione 700 microliters de tampão de homogeneização ao homogonato. Em seguida, gire o homogonato diluído e colete 1,5 mililitros do supernatante.Gire o supernante coletado novamente, depois colete 1,4 mililitros do supernatante e rotule-o como supernante pós-nuclear. Para preparar a coluna de gradiente de densidade, transfira 1,2 mililitros do supernante pós-nuclear para um tubo ultracentrífuga. Em seguida, adicione um mililitro de solução de 62% de sacarose à amostra e misture bem por pipetação suave.Em seguida, adicione cuidadosamente 3,3 mililitros de solução de 35% de sacarose em cima da amostra, seguido por 2,2 mililitros de solução de 25% de sacarose em cima da solução de 35%. Por fim, encha o tubo de ultracentrifutura até a parte superior com tampão de homogeneização. Centrifugar a coluna gradiente de densidade e coletar cuidadosamente 12 frações de 1 mililitro cada, a partir do topo do gradiente.Em seguida, diluir todas as frações com um mililitro de tampão de diluição e centrifugar as amostras diluídas. Após a centrifugação, aspire o supernascer e adicione 50 microliters de tampão de amostra 1X para colher as frações. O marcador de reciclagem endosome Rab11 foi detectado na Fração sete.Outros marcadores subcelulares, incluindo beta COP, COX IV, GAPDH, EEE1, Rab 7 e Lamp1 também foram sondados. Um sinal EEE1 positivo também foi detectado na Fração sete. As intensidades de banda medidas de GAPDH, Cox IV e Rab11 na Fração sete e no supernante pós-nuclear são mostradas aqui.Após a transecção de células HEC293 com elmo1, ELMO1 ARF6Q67L ou ELMO1 ARF6Q67L FE65, não foram encontradas alterações na distribuição elmo1 com superexpressão ARF6Q67L e FE65. O nível ELMO1 na Fração sete foi comparado entre diferentes transfecções e encontrado elevado após a cotransfecção de ARF6Q67L. Observou-se um aumento adicional quando tanto a ARF6Q67L quanto a FE65 foram co-expressas.Por outro lado, derrubar o FE65 diminuiu o enriquecimento de Elmo1 mediado arf6 na Fração sete. A fração obtida poderia ser utilizada para análise posterior. Por exemplo, a mancha ocidental para visualizar mudanças no nível da proteína na fração.

density-gradient-ultracentrifugation-for-investigating-endocytic

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Este artigo descreve um protocolo para a extração de traduzir os ribossomos das células eucarióticas. Uma vez extraído, ribossomos são separados em monosomes e polirribossomos por fracionamento gradiente de sacarose para permitir diferentes populações ribossomal a ser analisado. Como tal, este método é o padrão ouro para examinar a regulamentação da tradução.

Análise de Perfil eucarióticas Polyribosome

Neste vídeo, descrevemos um protocolo simples e eficiente usando centrifugação gradiente para isolar núcleos únicos. Uma vez isolados, esses núcleos podem ser usados para sequenciamento e análise do genoma.

Purificação de Núcleos Baseada em Centrifugação de Gradiente: Uma Técnica para Obter Fração Ultrapura de Núcleos Intactos Usando Centrifugação de Gradiente de Densidade

Este vídeo demonstra o método de purificação baseado em ultracentrifugação com gradiente de densidade para isolar subpopulações de vesículas extracelulares adequadas para estudos de caracterização.

Purificação de subpopulações de vesículas extracelulares: uma técnica para purificar subpopulações de vesículas extracelulares usando ultracentrifugação com gradiente de densidade

Aqui, apresentamos um protocolo para isolar a membrana plasmática, citoplasma e mitocôndrias de células U937 sem o uso de centrifugação de alta velocidade. Esta técnica pode ser usada para purificar as fracções subcelulares para posterior exame de localização de proteínas através de immunoblotting.

Fracionamento celular de células U937, na ausência de centrifugação de alta velocidade

Este protocolo de fracionamento permitirá que os pesquisadores isolem proteínas citoplasmáticas, nucleares, mitocondriais e de membrana de células de mamíferos. As duas últimas frações subcelulares são ainda purificadas através do gradiente de densidade isopícnico.

Fracionamento Celular de Células U937 por Purificação de Gradiente de Densidade Ipopínica

Este protocolo detalha o enriquecimento de vesículas extracelulares de micobactérias nativas (mEVs) de culturas axênicas de Mycobacterium smegmatis (Msm) e como mCherry (um repórter fluorescente vermelho) contendo MsmEVs recombinantes pode ser projetado e enriquecido. Por fim, verifica-se a nova abordagem com o enriquecimento de MsmEVs contendo a proteína EsxA do Mycobacterium tuberculosis.

Enriquecimento de vesículas extracelulares nativas e recombinantes de micobactérias

Os sítios de contato mitocondrial são complexos proteicos que interagem com proteínas da membrana interna e externa mitocondriais. Esses sítios são essenciais para a comunicação entre as membranas mitocondriais e, portanto, entre o citosol e a matriz mitocondrial. Aqui, descrevemos um método para identificar candidatos que se qualificam para esta classe específica de proteínas.

Um método aprimorado para isolar locais de contato mitocondrial

Este estudo descreve um método para isolar e purificar vesículas extracelulares bacterianas (BEVs) enriquecidas de fezes humanas via centrifugação por gradiente de densidade (DGC), identifica as características físicas dos BEVs a partir da morfologia, tamanho de partícula e concentração, e discute as potenciais aplicações da abordagem DGC em pesquisa clínica e científica.

Isolamento e Purificação de Vesículas Extracelulares Bacterianas de Fezes Humanas Utilizando Centrifugação por Gradiente de Densidade

O protocolo descreve o isolamento de EVs microbianos intestinais de ratos sensíveis ao sal alimentados com HSD usando centrifugação por gradiente de densidade. Os EVs foram caracterizados por rastreamento de nanopartículas, ensaios TEM, LPS/BCA e sequenciamento de rRNA 16S para analisar o tamanho, morfologia, composição e origem da microbiota.

Separação e Caracterização Diferencial de Vesículas Microbianas Extracelulares Intestinais em Ratos Sensíveis ao Sal sob Condições de Dieta Rica em Sal

Este protocolo descreve o isolamento e quantificação de pequenos RNAs de lipoproteína de alta densidade.

O isolamento de lipoproteínas de alta densidade para não codificante pequeno ARN Quantificação

Aprenda a isolar endossomos de reciclagem em células mamíferas usando ultracentrifugação em gradiente de sacarose. Este método facilita o estudo do tráfego proteico via vias endocíticas em amostras de tecidos e células.

Ultracentrifugação de gradiente de densidade para investigar a reciclagem endócítica em células mamíferas

Explorar mais vídeos