Ultracentrifugação de gradiente de densidade para investigar a reciclagem endócítica em células mamíferas
30 de junho de 2021
Este artigo tem como objetivo apresentar um protocolo para preparar endossóis de reciclagem de células mamíferas usando ultracentrifugação gradiente de densidade de sacarose.
Este protocolo ajuda a isolar os endossários de reciclagem contendo fração de células de mamíferos transfectadas para facilitar a investigação do tráfico de proteínas por meio do tráfico endocítico. Esta técnica é fácil de manusear e aplicável a amostras de tecido e células. Demonstrando o procedimento estará a Srta. Zhai Yu Qi, uma estudante de doutorado do Laboratório do Dr. Lao.
Para começar, prato 2 vezes 10 para as 6 células em um prato de cultura de 100 milímetros. No dia seguinte, transfem as células com Lipofectamina de acordo com as instruções do fabricante. Para colher as células, descarte o meio de cultura 48 horas após a transfecção e lave as células duas vezes com PBS gelado.
Em seguida, adicione um mililitro de PBS gelado suplementado com coquetel inibidor de protease 0,5X em coquetel inibidor de fosfatase 0,5X a cada prato. Em seguida, usando um raspador de células, colete as células e transfira a suspensão celular para um tubo de centrífuga de 15 mililitros. as células por centrifugação usando um rotor de balde de balanço.
Descarte o supernatante e resuspenque a pelota da célula suavemente em cinco mililitros de tampão de homogeneização. Colete as células novamente por centrifugação e resuspense a pelota celular em um mililitro de buffer de homogeneização. Homogeneize as células com um Homogeneizador Dounce usando 15 a 20 derrames.
Em seguida, transfira o homogonato para um tubo de centrifugação de dois mililitros. Adicione 700 microliters de tampão de homogeneização ao homogonato. Em seguida, gire o homogonato diluído e colete 1,5 mililitros do supernatante.
Gire o supernante coletado novamente, depois colete 1,4 mililitros do supernatante e rotule-o como supernante pós-nuclear. Para preparar a coluna de gradiente de densidade, transfira 1,2 mililitros do supernante pós-nuclear para um tubo ultracentrífuga. Em seguida, adicione um mililitro de solução de 62% de sacarose à amostra e misture bem por pipetação suave.
Em seguida, adicione cuidadosamente 3,3 mililitros de solução de 35% de sacarose em cima da amostra, seguido por 2,2 mililitros de solução de 25% de sacarose em cima da solução de 35%. Por fim, encha o tubo de ultracentrifutura até a parte superior com tampão de homogeneização. Centrifugar a coluna gradiente de densidade e coletar cuidadosamente 12 frações de 1 mililitro cada, a partir do topo do gradiente.
Em seguida, diluir todas as frações com um mililitro de tampão de diluição e centrifugar as amostras diluídas. Após a centrifugação, aspire o supernascer e adicione 50 microliters de tampão de amostra 1X para colher as frações. O marcador de reciclagem endosome Rab11 foi detectado na Fração sete.
Outros marcadores subcelulares, incluindo beta COP, COX IV, GAPDH, EEE1, Rab 7 e Lamp1 também foram sondados. Um sinal EEE1 positivo também foi detectado na Fração sete. As intensidades de banda medidas de GAPDH, Cox IV e Rab11 na Fração sete e no supernante pós-nuclear são mostradas aqui.
Após a transecção de células HEC293 com elmo1, ELMO1 ARF6Q67L ou ELMO1 ARF6Q67L FE65, não foram encontradas alterações na distribuição elmo1 com superexpressão ARF6Q67L e FE65. O nível ELMO1 na Fração sete foi comparado entre diferentes transfecções e encontrado elevado após a cotransfecção de ARF6Q67L. Observou-se um aumento adicional quando tanto a ARF6Q67L quanto a FE65 foram co-expressas.
Por outro lado, derrubar o FE65 diminuiu o enriquecimento de Elmo1 mediado arf6 na Fração sete. A fração obtida poderia ser utilizada para análise posterior. Por exemplo, a mancha ocidental para visualizar mudanças no nível da proteína na fração.
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Visão Geral
Este artigo apresenta um protocolo para o preparo de endossomos recicladores a partir de células de mamíferos utilizando ultracentrifugação em gradiente de densidade de sacarose. Esta técnica foi desenvolvida para facilitar a investigação do tráfego de proteínas por meio de vias endocíticas.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Biologia Celular
- Endocitose
- Transporte de Proteínas
Antecedentes
- Os endossomos recicladores desempenham um papel crucial no tráfego celular.
- Compreender o tráfego de proteínas é essencial para obter insights sobre diversos processos celulares.
- A ultracentrifugação é uma técnica amplamente utilizada para o isolamento de componentes celulares.
- Este protocolo é aplicável a amostras de tecido e de células.
Objetivo do Estudo
- Fornecer um método confiável para o isolamento de endossomos recicladores.
- Aprimorar a compreensão dos mecanismos de tráfego endocítico.
- Apoiar pesquisas futuras sobre a dinâmica de proteínas dentro das células.
Métodos Utilizados
- Transfeção de células de mamífero com Lipofectamina.
- Coleta de células 48 horas após a transfeção.
- Lavagem das células com PBS frio a 4 °C.
- Utilização da ultracentrifugação em gradiente de densidade de sacarose para isolamento.
Resultados Principais
- Isolamento bem-sucedido de endossomos recicladores de células transfectadas.
- Demonstração do protocolo por um estudante de doutorado.
- Facilitação de estudos adicionais sobre o tráfego de proteínas.
- Validação da aplicabilidade do método a diversos tipos de amostras.
Conclusões
- O protocolo fornece uma abordagem direta para o isolamento de endossomos recicladores.
- Espera-se que auxilie na compreensão do tráfego de proteínas.
- Este método pode ser utilizado em diversos contextos de pesquisa biológica.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
O isolamento de endossomos recicladores permite a desmistificação mecanicista de alvos no tráfego endocítico ao fornecer dados quantitativos de fracionamento subcelular. Isso apoia a validação de alvos e o desenvolvimento de ensaios para proteínas que regulam a reciclagem de proteínas de membrana, como os efetores da ARF6. O método aumenta a confiança preditiva na identificação de compostos líderes ao associar a localização proteica a vias funcionais de reciclagem.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvos
- Valor Científico: Investigar hipóteses terapêuticas sobre reguladores do reciclamento endocítico, como ARF6 e ELMO1.
- Valor Operacional: Fornecer dados de fracionamento para esclarecer mecanismos de tráfego proteico específicos da via.
- Valor Científico: Apoiar a desmistificação biológica ao validar o engajamento do alvo em frações de endossomos recicladores.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Valor Científico: Prepara frações contendo endossomos de reciclagem validadas para análise posterior por Western blot.
- Valor Operacional: Permite o isolamento padronizado e reprodutível de organelas para medição quantitativa de proteínas.
- Valor Científico: Facilita a preparação para ensaios na triagem de compostos que modulam a reciclagem endocítica.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Conecta dados de tráfego em fase de descoberta a modelos pré-clínicos por meio do isolamento da fração positiva para Rab11.
- Valor Operacional: Garante a continuidade desde a fracionamento subcelular até a validação funcional em sistemas relevantes para a doença.
- Valor Científico: Apoia o avanço com ajuste de risco ao confirmar a localização do alvo nas vias de reciclagem.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se integra aos fluxos de trabalho de descoberta inicial ao isolar frações subcelulares que orientam decisões de validação de alvos e identificação de compostos promissores.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses sobre reguladores do reciclamento endocítico por meio de fracionamento e análise de marcadores.
- Triagem: Permite o desenvolvimento de ensaios mediante o isolamento padronizado de frações positivas para Rab11 para quantificação proteica.
- Análises: Gera resultados quantitativos de Western blot a partir de frações para comparar o enriquecimento proteico entre diferentes condições.
- Pesquisa Translacional: Conecta os dados de fracionamento à continuidade pré-clínica ao validar o isolamento de endossomos recicladores.
- Reutilização Empresarial: Oferece uma plataforma reutilizável de fracionamento subcelular para múltiplos projetos de validação de alvos.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na validação de alvos ao reduzir a ambiguidade mecanicista nas vias de tráfego.
- Valor Operacional: Garante reprodutibilidade e escalabilidade do isolamento de organelas para análises downstream consistentes.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de prosseguir ou não ao fornecer dados de localização subcelular para alvos da via de reciclagem.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de alvos com base em dados de enriquecimento do endossomo de reciclagem.
Considerações de Implementação
- Requer experiência em técnicas de cultura celular, transfeção e ultracentrifugação.
- Depende do acesso a rotores de balde oscilante e ultracentrífugas para separação em gradiente de densidade.
- Necessita padronização de protocolos de fracionamento entre equipes para isolamento comparável de frações de Rab11.
- Exige adaptação dos painéis de marcadores (por exemplo, Rab11, EEA1) para diferentes tipos celulares ou vias de tráfego.
- Limitado pela necessidade de marcadores de validação para confirmar a pureza das frações antes de aplicações posteriores.
Perguntas Frequentes sobre Biofármacos
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:33
Mammalian Cell Culture, Transfection and Cell Harvest
2:07
Density Gradient Column Preparation
2:46
Fractionation and Recovery of Recycling Endosome-Containing Fraction
3:17
Results: Density Gradient Ultracentrifugation for Investigating Endocytic Recycling in Mammalian Cells
4:47
Conclusion
