Name: Preparação de Vírus da Influenza Aviária H5 Pseudotipados com Método de Transfecção de Fosfato de Cálcio e Mensuração da Atividade Neutralizante de Anticorpos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-22T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 15 s
Description: Aprenda a preparar pseudovírus H5N1 de influenza aviária de alta patogenicidade usando transfecção com fosfato de cálcio em células HEK293 FT. Este método permite medir atividade neutralizante de anticorpos com segurança em laboratório de biossegurança nível dois.

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Este trabalho foi apoiado pelas bolsas de pesquisa do Projeto de Capacitação em Inovação da província de Jiangsu (BM2020019), Projeto Científico e Tecnológico de Shenzhen (No. JSGG20200225150702770), Programa de Pesquisa Estratégica Prioritária da Academia Chinesa de Ciências (XDB29030103), Projeto Científico e Tecnológico de Guangdong (No. 2020B1111340076) e o Programa de Pesquisa Aberta do Laboratório da Baía de Shenzhen (No. SZBL202002271003).

Todas as operações experimentais relacionadas a pseudovírus foram realizadas sob condição ABSL2 no Institut Pasteur da Academia Chinesa de Ciências de Xangai (IPS, CAS). Os experimentos com animais foram realizados com base nos protocolos animais aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais do IPS, CAS.
1. Embalagem de pseudovírus com transfecção cálcio-fosfato
<ol><li>Realizar suspensões unicelulares de células HEK293FT (9 x 105 por mL) em meio DMEM completo (Tabela 1). Adicionar 10 ml das suspensões unicelulares a um balão T75, incubar as células numa estufa a 37 °C, 5% de dióxido de carbono (CO2) durante 20 h antes da transfecção. NOTA: HEK293FT passagem baixa (<20 passagens) é recomendada. Certifique-se de que a monocamada celular seja 80-90% confluente.</li>
	<li>Substitua o meio por 10 mL de meio fresco completo contendo cloroquina (100 μM) 2 h antes da transfecção.</li>
	<li>Misturar os reagentes e o DNA plasmidial como mostrado na Tabela 2 e Figura 1: ddH 2 O, pCMV/R-HA, pCMV/R-NA, pHR-Luc, pCMV Δ 8,9, 2,5 M CaCl2e 2x tampão HEPES. Pipetar para cima e para baixo 5 vezes suavemente, incubar a mistura à temperatura ambiente (TR) por 20 min.</li>
	<li>Transfira a mistura para o meio acima das células e agite suavemente o frasco. Incubar as células na incubadora de células por 15 h.</li>
	<li>Substitua o meio por 15 mL de meio DMEM completo fresco. Incubar as células em estufa a 37 °C, 5% CO2 durante 65 horas. NOTA: A cor do meio será laranja claro ou levemente amarelo, e pelo menos 80% da célula deve mostrar o efeito citopático (CPE) sob o microscópio de luz invertida.</li>
	<li>Colher o sobrenadante e centrifugar-o a 2095 x g durante 20 min a 4 °C. Recolher o sobrenadante, alíquota-o e armazená-lo a -80 °C.</li>
</ol>2. Detecção da expressão das proteínas HA, NA e HIV-1 p24 do pseudovírus influenza
<ol><li>Detectar a expressão da proteína HA pelo ensaio de hemaglutinina (HA).<ol><li>Adicione 50 μL de PBS nas colunas 2-12, linhas A, B e C de uma placa de fundo redondo de 96 poços. Observação : linha A, B e C pertencem a 3 testes de replicação independentes e coluna 12 é usada como o controle negativo.</li>
		<li>Adicionar 100 μL de pseudovírus nos poços da coluna 1. Transferir 50 μL da coluna 1 para a coluna 2, misturar bem pipetando para cima e para baixo 5 vezes, efectuar as diluições duplas até à última coluna 11 e eliminar os 50 μL adicionais da coluna 11.</li>
		<li>Adicione 50 μL de eritrócitos a 0,5% em cada poço, pipete-o para cima e para baixo suavemente duas vezes. Incubar a placa por 30-60 min na RT ou até que as hemácias do controle negativo formem os pontos regulares no fundo do poço.</li>
		<li>Observar e registrar os títulos de AH do pseudovírus. NOTA: A unidade HA dos pseudovírus é o fator de diluição mais alto do vírus que pode causar 100% de hemaglutinação das hemácias.</li>
	</ol></li>
	<li>Detectar a expressão das proteínas HA e NA pelo ensaio de western-blot. NOTA: Todas as etapas do western-blot são realizadas de acordo com o manual de clonagem molecular (4ª edição).</li>
	<li>Detectar a expressão da proteína p24 do HIV-1 pelo kit ELISA p24 do HIV-1 (Tabela de Materiais).<ol><li>Adicionar 50 μL do tampão de lise em 450 μL de amostra de pseudovírus. Misture bem.</li>
		<li>Adicionar 300 μL do tampão de lavagem a cada poço da microplaca. Bata a placa invertida para remover completamente o tampão de lavagem. Repita a lavagem 5 vezes.</li>
		<li>Adicionar 200 μL do padrão e amostras a cada poço separadamente. Incubá-los a 37 °C durante a noite ou durante 2 h.</li>
		<li>Aspirar o conteúdo da placa e lavá-la conforme descrito no passo 2.3.2. NOTA: Deixe um poço da placa de ensaio vazio para usar como substrato em branco.</li>
		<li>Adicionar 200 μL dos anticorpos do detector p24 a cada poço. Incubá-los a 37 °C durante 1 h. Aspirar e lavar a placa conforme descrito no passo 2.3.2.</li>
		<li>Adicionar 100 μL da solução de trabalho estreptavidina-peroxidase a cada poço e incubá-los a 37 °C durante 30 min. Aspirar e lavar a placa conforme descrito no passo 2.3.2.</li>
		<li>Adicionar 100 μL da solução de trabalho do subestado a cada poço, incluindo o poço em branco do substrato, e incubá-los a 37 °C durante 30 min. NOTA: A cor azul se desenvolverá nos poços.</li>
		<li>Adicionar 100 μL do tampão de paragem a cada poço. NOTA: A cor azul mudará para amarelo imediatamente.</li>
		<li>Leia a densidade óptica a 450 nm em 15 minutos. Registrar os títulos de p24 do pseudovírus</li>
	</ol></li>
</ol>3. Titulação de pseudovírus
<ol><li>Faça suspensões de célula única de células MDCK (5 x 104 por mL) em meio DMEM completo, adicione 1250, 2500, 5000, 10000, 20000 e 40000 células a diferentes poços de uma placa de fundo plano de 96 poços. Incubar as células em estufa a 37 °C, 5% CO2 durante 20 horas.</li>
	<li>Retire o pseudovírus da geladeira de -80 °C, descongele-o no gelo e vortexe o pseudovírus.</li>
	<li>Adicione 6 pseudovírus HAU (6x unidades HA) a cada poço de placa de fundo redondo de 96 poços e reabasteça cada poço com DMEM completo até 120 μL.</li>
	<li>Pipetar para cima e para baixo a mistura 5 vezes para misturar completamente. Incubar a placa de mistura numa incubadora a 37 °C, 5 % de CO2 durante 1 hora.</li>
	<li>Transferir 100 μL da mistura para as células na placa de 96 poços. Coloque a placa de cultura celular de volta na incubadora por 48 h, 60 h e 72 h após a infecção pelo vírus.</li>
	<li>Retire a placa da incubadora e realize o ensaio de luciferase (Tabela de Materiais).</li>
	<li>Retire o meio dos orifícios da placa com cuidado. Enxaguar as células com 200 μL de PBS e remover o PBS tanto quanto possível. OBS: Vire a chapa e descarte o sobrenadante dando um tapa reverso em papel absorvente. Se a linha celular de teste não puder se fixar firmemente ao fundo, remova a aspiração do meio cuidadosamente.</li>
	<li>Adicionar 50 μL do tampão de lise a cada poço e balançar a placa de cultura várias vezes. Conservar o prato a -80 °C durante a noite. NOTA: Misture 1 volume de tampão de lise 5x com 4 volumes de água para fazer o tampão de lise 1x. Equilibre o tampão de lise de 1x para RT antes de usar. Balançar a placa para garantir que as células sejam cobertas com o tampão de lise completamente. O único processo de congelamento-descongelamento pode ajudar a célula a ser lisada completamente.</li>
	<li>Retire o prato, equilibre em TR por 2 h. Observação : a célula deve ser lisada completamente.</li>
	<li>Agite a placa várias vezes suavemente e transfira todos os lisados celulares para placas opacas de 96 poços.</li>
	<li>Adicionar 50 μL do substrato a cada poço, balançar a placa várias vezes suavemente e misturar bem o substrato e o tampão de lise.</li>
	<li>Meça a luz produzida dentro de 5 min usando um luminômetro. Registre os títulos de luciferase do pseudovírus. NOTA: Quando um substrato adequado é adicionado, a luz é emitida como subproduto através de uma reação química na qual a luciferina é convertida em oxiluciferina pela enzima luciferase. A quantidade de luz produzida é proporcional à quantidade da enzima luciferase.</li>
</ol>4. Preparação de soros imunes
NOTA: O soro imune será usado para experimentos relacionados a células, e a operação experimental deve ser realizada em condições assépticas.
<ol><li>Preparar 12 camundongos BALB/c fêmeas de oito semanas de idade. Divida igualmente os ratos em dois grupos. OBS: Um grupo era o grupo DDV e o outro era o grupo controle negativo.</li>
	<li>Imunização do grupo DDV: Primer duas vezes por via intramuscular com 100 μg de um plasmídeo de DNA otimizado para códon que codifica a proteína A/Thailand/(KAN-1)/2004 (TH) HA na semana 0 e na semana 3 e aumentar uma vez por via intraperitoneal com 512 partículas semelhantes ao vírus HAU TH (VLP) na semana 6.</li>
	<li>Imunização do grupo controle: Primer duas vezes por via intramuscular com 100 μg de DNA plasmidial vetorial vazio na semana 0 e na semana 3 e aumentar uma vez por via intraperitoneal com VLP de vômito do HIV-1 na semana 6.</li>
	<li>Coletar o sangue do camundongo 2 semanas após a última imunização. OBS: Aqui, os camundongos foram anestesiados com pentobarbital sódico (65 mg/kg) no momento da coleta de sangue. Após a coleta de sangue da veia submandibular, os camundongos foram eutanasiados imediatamente com CO2.</li>
	<li>Mantenha o sangue em RT por 2 h, depois 4 °C durante a noite. Centrifugar a 900 x g durante 10 min a 4 °C e recolher o sobrenadante. Inative o soro colocando-o a 56 °C por 30 min.</li>
	<li>Conservar os soros imunitários num frigorífico a -80 °C para utilização. NOTA: Consulte a Figura Suplementar 1 para obter o fluxograma que descreve os principais procedimentos de imunização de camundongos.</li>
</ol>5. Ensaio de neutralização de pseudovírus (NP)
<ol><li>Fazer suspensões de célula única de células MDCK (5 x 104 por mL) em meio DMEM completo e adicionar 100 μL da suspensão celular a cada poço de uma placa de fundo plano de 96 poços. Incubar as células em estufa a 37 °C, 5% CO2 durante 20 horas.</li>
	<li>Retire o pseudovírus e os soros da geladeira de -80 °C, descongele-o no gelo e vomite completamente.</li>
	<li>Diluir os soros no meio completo 20 vezes e adicionar 100 μL de meio DMEM completo aos poços de uma placa de fundo redondo de 96 poços das colunas 2-10.</li>
	<li>Adicionar 200 μL dos soros diluídos para os poços da coluna 2, transferir 100 μL da coluna 2 para a coluna 3, diluir os soros como 1:20, 1:40, 1:80, etc., para 1:10240 sucessivamente da coluna 2 para a coluna 10 e eliminar os 100 μL da coluna 10.</li>
	<li>Adicionar 100 μL de meio completo DMEM aos poços da coluna 11 como controlo negativo.</li>
	<li>Adicionar 100 μL de pseudovírus a cada poço, pipetar a mistura 5 vezes mais e incubar a placa de mistura a 37 °C, 5% CO2 durante 1 h.</li>
	<li>Transferir 100 μL da mistura da placa de fundo redondo de 96 poços para o poço correspondente da placa de cultura celular de 96 poços. Colocar a placa de volta na incubadora (37 °C, 5% CO2) por 60 h.</li>
	<li>Retire a placa da incubadora. Execute o ensaio de luciferase conforme descrito nas etapas 3.7-3.12.</li>
</ol>6. Ensaio de ligação de pseudovírus
<ol><li>Faça suspensões de célula única de células MDCK (4 x 104 por mL) em meio DMEM completo e adicione suspensões de células de 100 μL a cada poço em uma placa de fundo plano de 96 poços. Incubar as células a 37 °C, 5% CO2 durante 20 h.</li>
	<li>Incubar o pseudovírus com soros em DMEM contendo 1% de BSA a 4 °C durante a noite. NOTA: O volume da mistura é de 100 μL.</li>
	<li>Bloquear as células MDCK com 100 μL por poço de DMEM contendo 1% de BSA a 4 °C por 1 h.</li>
	<li>Inocular a mistura de pseudovírus e soro (100 μL) na monocamada de MDCK e incubá-la a 4 °C por 2 h.</li>
	<li>Lave a placa celular 4 vezes com PBS contendo 1% de BSA para remover qualquer vírus não ligado.</li>
	<li>Lisar as células com 100 μL de tampão de lise luciferase em TR por 30 min.</li>
	<li>Quantificar a quantidade de vírus ligado nas células com um kit ELISA p24 para VIH-1, conforme descrito acima (secção 2.3).</li>
</ol>7. Avaliação da entrada viral
<ol><li>Fazer suspensões de célula única de células MDCK (5 x 104 por mL) em meio DMEM completo e adicionar 100 μL da suspensão celular a cada poço de uma placa de fundo plano de 96 poços. Incubar as células a 37 °C, 5% CO2 durante 20 h antes do ensaio.</li>
	<li>Inocular o pseudovírus (100 μL) em uma monocamada de MDCK em uma placa de 96 poços a 4 °C por 6 h.</li>
	<li>Lavar a placa celular 4 vezes com PBS contendo 1% de BSA para remover pseudovírus não ligados.</li>
	<li>Adicionar 100 μL dos soros imunes diluídos em série ou soros de camundongos com vacinação simulada em DMEM contendo 1% de BSA à monocamada e incubar a célula a 4 °C por 2 h.</li>
	<li>Remova o sobrenadante celular e lave a placa de cultura celular 4 vezes com PBS contendo BSA a 1%.</li>
	<li>Adicionar DMEM fresco às células e incubar durante 60 h numa incubadora a 37 °C, 5% CO2 .</li>
	<li>Medir a atividade relativa da luciferase (RLA) das células, conforme descrito nas etapas 3.7-3.12. NOTA: A entrada viral, indicada pela RLA, foi expressa como uma porcentagem da leitura obtida na ausência de soros, que foi definida como 100%.</li>
</ol>

<ol><li>Wang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+prime+and+virus-like+particle+boost+from+a+single+H5N1+strain+elicits+broadly+neutralizing+antibody+responses+against+head+region+of+h5+hemagglutinin%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">DNA prime and virus-like particle boost from a single H5N1 strain elicits broadly neutralizing antibody responses against head region of h5 hemagglutinin.</a> The Journal of Infectious Diseases. 209 (5), 676-685 (2014).</li>
<li>Wang, G., Yin, R., Zhou, P., Ding, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combination+of+the+immunization+with+the+sequence+close+to+the+consensus+sequence+and+two+DNA+prime+plus+one+VLP+boost+generate+H5+hemagglutinin+specific+broad+neutralizing+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Combination of the immunization with the sequence close to the consensus sequence and two DNA prime plus one VLP boost generate H5 hemagglutinin specific broad neutralizing antibodies.</a> Plos One. 12 (5), 0176854(2017).</li>
<li>Li, Q., Liu, Q., Huang, W., Li, X., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+status+on+the+development+of+pseudoviruses+for+enveloped+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Reviews+in+Medical+Virology%22%5BJournal%5D)">Current status on the development of pseudoviruses for enveloped viruses.</a> Reviews in Medical Virology. 28 (1), 1963(2018).</li>
<li>Duvergé, A., Negroni, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudotyping+lentiviral+vectors%3A+When+the+clothes+make+the+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Pseudotyping lentiviral vectors: When the clothes make the virus.</a> Viruses. 12 (11), 1311(2020).</li>
<li>Carnell, G. W., Ferrara, F., Grehan, K., Thompson, C. P., Temperton, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudotype-based+neutralization+assays+for+influenza%3A+A+systematic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Pseudotype-based neutralization assays for influenza: A systematic analysis.</a> Frontiers in Immunology. 6 (161), (2015).</li>
<li>Trombetta, C., Perini, D., Mather, S., Temperton, N., Montomoli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview+of+serological+techniques+for+influenza+vaccine+evaluation%3A+Past%2C+present+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccines%22%5BJournal%5D)">Overview of serological techniques for influenza vaccine evaluation: Past, present and future.</a> Vaccines. 2 (4), 707-734 (2014).</li>
<li>Wei, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+influenza+vaccines%3A+opportunities+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Next-generation influenza vaccines: opportunities and challenges.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 19 (4), 239-252 (2020).</li>
<li>Krammer, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influenza%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Disease+Primers%22%5BJournal%5D)">Influenza.</a> Nature Reviews Disease Primers. 4 (3), (2018).</li>
<li>Wei, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+broadly+neutralizing+H1N1+influenza+antibodies+by+vaccination%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Induction of broadly neutralizing H1N1 influenza antibodies by vaccination.</a> Science. 27 (329), 1060-1064 (2010).</li>
<li>Chernov, V. M., Chernova, O. A., Sanchez-Vega, J. T., Kolpakov, A. I., Ilinskaya, O. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycoplasma+contamination+of+cell+cultures+vesicular+traffic+in+bacteria+and+control+over+infectious+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Naturae%22%5BJournal%5D)">Mycoplasma contamination of cell cultures vesicular traffic in bacteria and control over infectious agents.</a> Acta Naturae. 6 (3), 41-51 (2014).</li>
<li>Michael, R. G., Joseph, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMichael%2C+RG+%22Molecular+Cloning%3A+A+Laboratory+Manual+%28Fourth+Edition%29%22">Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Fourth Edition)</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. (2012).</li>
<li>Kumar, P., Nagarajan, A., Uchil, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfection+of+mammalian+cells+with+calcium+phosphate-DNA+coprecipitates%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Transfection of mammalian cells with calcium phosphate-DNA coprecipitates.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2019 (10), (2019).</li>
<li>Robert, E. K., Chen, C. A., Okayama, H., John, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+phosphate+transfection%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Calcium phosphate transfection.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 9, (2003).</li>
<li>Robert, E. K., Chen, C. A., Okayama, H., John, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfection+of+DNA+into+eukaryotic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Transfection of DNA into eukaryotic cells.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 9, 11-19 (1996).</li>
<li>Kachkin, D. V., Khorolskaya, J. I., Ivanova, J. S., Rubel, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+method+for+isolation+of+plasmid+DNA+for+transfection+of+mammalian+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+and+Protocols%22%5BJournal%5D)">An efficient method for isolation of plasmid DNA for transfection of mammalian cell cultures.</a> Methods and Protocols. 3 (4), 69(2020).</li>
<li>Luciferase assay system. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.promega.com.cn/products/luciferase-assays/reporter-assays/luciferase-assay-system">https://www.promega.com.cn/products/luciferase-assays/reporter-assays/luciferase-assay-system</a> (2021).</li>
<li>Corning 96-Well Solid Black or White Polystyrene Microplates. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.fishersci.com/shop/products/costar-96-well-black-white-solid-plates">https://www.fishersci.com/shop/products/costar-96-well-black-white-solid-plates</a> (2021).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

HEK293FT células são geralmente usadas como células de empacotamento para produzir pseudovírus. A detecção regular de micoplasma é essencial durante a cultura celular. A contaminação por micoplasma pode diminuir drasticamente o rendimento do pseudovírus e, às vezes, próximo de zero. Comparadas com outras contaminações, as contaminações por micoplasma não levam a alterações no valor de pH ou turbidez do meio de cultura celular. Mesmo uma alta concentração de micoplasma não é visível a olho nu ou ao microscópio. Três métod...

Desde 1996, os vírus H5 da linhagem A/ganso/Guangdong/1/96 da gripe aviária de alta patogenicidade (HPAI) têm causado surtos contínuos de gripe em aves de capoeira e aves selvagens, sendo responsáveis por enormes perdas socioeconômicas na indústria avícola global. Algumas vezes, os seres humanos também se infectam com ela, diante de uma alta taxa de letalidade 1,2. No entanto, a pesquisa do vírus da IAAP é frequentemente dificultada, uma vez que não pode ser manuseada fora dos laboratórios de nível de biossegurança 3. Para resolver essa questão, pseudovírus são adotados como uma alternativa aos vírus selvagens em alguns experimentos de estudos de IAAP H5. Os pseudovírus são seguros o suficiente para serem praticados em laboratórios de nível 2 de biossegurança.
Os pseudovírus H5 da GAAP pertencem a vírus quiméricos que consistem em núcleos de vírus substitutos, envelopes lipídicos com glicoproteínas de superfície de vírus influenza e genes repórteres. Os núcleos de pseudovírus são geralmente derivados do vírus da imunodeficiência humana lentiviral (HIV), retrovírus como o vírus da leucemia murina (MLV) e o vírus da estomatite vesicular (VSV)3. Especificamente, o sistema de embalagem do HIV-1 é amplamente utilizado para produzir pseudovírus influenza, onde os genes primários fornecidos são gag e pol. O gene da mordaça do HIV expressa proteínas centrais. O gene pol expressa a integrase e a transcriptase reversa, ambas necessárias para a expressão do gene repórter em células transduzidas. Mimetizando o genoma do vírus substituto, o gene repórter é abraçado no núcleo do pseudovírus na forma de RNA. O gene repórter expressará a proteína nas células hospedeiras. Os níveis de expressão gênica dos genes repórteres podem ser usados para medir a eficiência da infecção por pseudovírus 3,4. O repórter primário é a luciferase de vagalume para medir as unidades de luminescência relativa (RLU) ou atividade relativa de luciferase (RLA) em células transduzidas. Outros repórteres como lacZ, Gaussia e Renilla luciferase também são usados, só que em menor grau5.
Os pseudovírus são ferramentas ideais para o estudo de anticorpos neutralizantes contra o vírus H5 HAPI. Para medir a potência do anticorpo neutralizante, ensaios de neutralização de pseudovírus (NP)6 são usados. A hemaglutinina (HA) e a neuraminidase (NA) são glicoproteínas da superfície do vírus influenza A 7,8. O AH é composto por um domínio da cabeça globular para ligação ao receptor e um domínio do tronco para fusão da membrana. A proteína NA tem atividade de sialidase para facilitar a liberação do vírus 7,8. Um ensaio de NP pode medir anticorpos neutralizantes direcionados às proteínas HA. Anticorpos neutralizantes direcionados para a região da cabeça e tronco do AH também podem ser detectados por ensaios de adesão e entrada viral. Em comparação com vírus selvagens, os experimentos de neutralização de pseudovírus têm valores de detecção mais sensíveis, podem ser manuseados com segurança em um laboratório de biossegurança de nível 2 e geralmente são mais fáceis de operar na prática.
Este protocolo apresenta em detalhes os procedimentos e etapas críticas das preparações de pseudovírus H5 da GAAP e ensaios de NP. Além disso, discute a solução de problemas, limitação e modificações desses ensaios. Neste estudo, a cepa A/Thailand/1(KAN)-1/2004(TH) do vírus H5N1 da GAAP foi usada como exemplo. Para a obtenção dos soros imunes utilizados nos ensaios, esse protocolo selecionou a proteína HA originária da cepa TH como imunogênio para imunizar camundongos.

<table><tbody><tr><td>1% Chiken Erythrocyte</td><td>Bio-channel</td><td>BC-RBC-C001</td><td>Reagente</td></tr><tr><td>96 placas de cultura de células de poços (fundo plano)</td><td>Thermo fisher scientific</td><td>167008</td><td>material consumível</td></tr><tr><td>96 placas de cultura de células (fundo redondo)</td><td>Thermo fisher scientific</td><td>163320</td><td>material consumível</td></tr><tr><td>Allegra X-15R</td><td>Beckman coulter</td> <td>-</td> <td>Equipamento / Centrífuga</td></tr><tr><td>Seringas de insulina BD</td><td></td><td>BD 324910</td><td>material consumível</td></tr><tr><td>Cloreto de cálcio anidro</td><td>AMRESCO</td><td>1B1110-500G</td><td>Reagente</td></tr><tr><td>difosfato de cloroquina</td><td>Selleck</td><td>S4157</td><td>Reagente</td></tr><tr><td>Dulbecco ' s Modificado Eagle Médio (DMEM)</td> <td>Gibco</td><td>12100-046</td><td>Reagente</td></tr><tr><td>Fetal Soro</td><td>Bovino Gibco</td><td>16000-044</td><td>Reagente</td></tr><tr><td>HEK293FT</td><td>Gibco</td><td>R700-07</td><td>Linha celular</td></tr><tr><td>HEPES FREE ACID</td><td>AMRESCO</td><td>0511-250G</td><td>Reagente</td></tr><tr><td>HIV-1 p24 Antígeno ELISA</td><td>ZeptoMetrix</td><td>801111</td><td>Kit de reagentes</td></tr><tr><td>Luciferase Asme Sistema de ensaio Freezer Pacote</td><td>Promega</td><td>E4530</td><td>Kit de reagentes</td></tr><tr><td>MDCK.1</td><td>ATCC</td><td>CRL-2935</td><td>Linha celular</td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga 1,5 mL</td><td>Thermo fisher scientific</td><td>509-GRD-Q</td><td>material consumível</td></tr><tr><td>Nunc Tubos de centrífuga cônicos 15 mL</td><td>Thermo fisher scientific</td><td>339650</td><td>material consumível</td></tr><tr><td>Nunc Tubos de centrífuga cônicos 50 mL</td><td>Thermo fisher scientific</td><td>339652</td><td>material consumível</td></tr><tr><td>Nunc EasYFlask 75 cm2</td><td>Thermo fisher scientific</td><td>156499</td><td>material consumível</td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>Reagente</td></tr><tr><td>Pontas de Pipeta (10 &mu; L)</td> <td>Thermo fisher scientific</td><td>TF102-10-Q</td><td>material consumível</td></tr><tr><td>Pontas de pipeta (100 &mu; L)</td> <td>Thermo fisher scientific</td><td>TF113-100-Q</td><td>pontas de pipeta de material consumível</td></tr><tr><td>(1000 &mu; L)</td> <td>Thermo fisher scientific</td><td>TF112-1000-Q</td><td>material consumível</td></tr><tr><td>Pipetas sorológicas (5 mL)</td> <td>Thermo fisher scientific</td><td>170355N</td><td>material consumível</td></tr><tr><td>Pipetas sorológicas (10 mL)</td> <td>Thermo fisher scientific</td><td>170356N</td><td>material consumível</td></tr><tr><td>Tripsina / EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200-072</td><td>Reagente</td></tr><tr><td>Varioskan Flash</td><td>Thermo fisher científico</td><td>--</td><td>Equipamento/leitor de microplacas</td></tr><tr><td>Incubadora de camisa de água</td><td>Thermo fisher scientific</td><td>3111</td><td>Incubadora de equipamentos/células</td></tr><tr><td>Sal de sódio de pentobarbital</td><td>Sigma</td><td>57-33-0</td><td>Reagente</td></tr></tbody></table>

preparação de vírus da influenza aviária h5 pseudotipados com método de transfecção de fosfato de cálcio e mensuração da atividade neutralizante de anticorpos

Preparation of Pseudo-Typed H5 Avian Influenza Viruses with Calcium Phosphate Transfection Method and Measurement of Antibody Neutralizing Activity

Desde 1996, os vírus H5 da linhagem A/ganso/Guangdong/Guangdong/1/96 da gripe aviária de alta patogenicidade (HPAI) têm causado surtos de gripe em aves de capoeira e aves selvagens. Ocasionalmente, os seres humanos também são vítimas dela, o que resulta em alta mortalidade. No entanto, a pesquisa do vírus da GAAP é frequentemente dificultada, considerando que deve ser manuseada dentro de laboratórios de nível de biossegurança 3. Para resolver essa questão, pseudovírus são adotados como uma alternativa aos vírus selvagens em alguns experimentos de estudos de IAAP H5. Os pseudovírus provam ser as ferramentas ideais para estudar anticorpos neutralizantes contra os vírus H5 da GAAP. Este protocolo descreve os procedimentos e etapas críticas das preparações de pseudovírus H5 GAAP e ensaios de neutralização de pseudovírus. Além disso, discute a solução de problemas, limitação e modificações desses ensaios.

Expressão das proteínas p24 HA, NA e HIV-1 do pseudovírus influenza Para identificar a eficiência da embalagem viral, os estoques de pseudovírus influenza foram detectados pela primeira vez pelo ensaio de AH (Figura 2A). As unidades de AH por mililitro de pseudovírus influenza são 643 (Tabela 3). Ensaios de western-blot e ELISA sanduíche foram usados para testar a expressão das proteínas HA, NA e HIV-1 p24. Em seguida, foram calculadas as proporções de un...

Aqui descrevemos um protocolo para empacotamento de pseudovírus e a medição da atividade neutralizante de anticorpos.

Preparação de Vírus da Influenza Aviária H5 Pseudotipados com Método de Transfecção de Fosfato de Cálcio e Mensuração da Atividade Neutralizante de Anticorpos

Since 1996, A/goose/Guangdong/1/96-lineage highly pathogenic avian influenza (HPAI) H5 viruses have been causing flu outbreaks in poultry and wild birds. ...

Este protocolo descreve os procedimentos e as etapas críticas das preparações de pseudovírus H5 de alta patogenicidade para influenza aviária e ensaios de neutralização de pseudovírus. Além disso, discute a limitação da solução de problemas e as modificações desses ensaios. Patógenos de alta patogenicidade devem ser realizados no laboratório de biossegurança de nível três, enquanto pseudovírus podem ser manuseados com segurança em laboratório de biossegurança de nível dois.Para começar, faça uma suspensão de célula única de células HEK293 FT em um meio DMEM completo. Adicionar 10 mililitros da suspensão de célula única a um balão T75, seguido de incubação a 37 graus Celsius. Duas horas antes da transfecção, substitua o meio antigo por 10 mililitros de meio fresco completo por cloroquina.Misture os reagentes e o DNA plasmidial conforme descrito no manuscrito e transfira essa mistura para o meio acima das células e rocha suavemente. Após a incubação, substitua o meio por 15 mililitros de meio DMEM completo fresco. Após 65 horas, colher o sobrenadante por centrifugação.Colete o sobrenadante e alíquota. Para detectar a expressão da proteína hemaglutinina, adicione 50 microlitros de PBS

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Fonte: Chang, X., et al. Preparação de Vírus Pseudotipados da Influenza Aviária H5 pelo Método de Transfecção com Fosfato de Cálcio e Medição da Atividade Neutralizante de Anticorpos. J. Vis. Exp. (2021)Este vídeo demonstra a produção de pseudovírus da influenza em células humanas utilizando a transfeção de plasmídeo mediada por fosfato de cálcio, permitindo a geração segura de partículas virais de ciclo único para aplicações posteriores, como ensaios de neutralização de anticorpos em condições...

Produção de Pseudovírus Utilizando Transfecção de Plasmídeos em Células Humanas

Source: Chang, X., et al. Preparation of Pseudo-Typed H5 Avian Influenza Viruses with Calcium Phosphate Transfection Method and Measurement of Antibody Neutralizing Activity. J. Vis. Exp. (2021)This video demonstrates a luciferase-based pseudovirus titration assay to determine the optimal target cell density for maximum infection. By comparing luminescence across cell densities, the method ensures high assay sensitivity and reproducibility for downstream applications.

Determining Optimal Target Cell Density Using a Luciferase-Based Pseudovirus Infection Assay

Source: Chang, X., et al. Preparation of Pseudo-Typed H5 Avian Influenza Viruses with Calcium Phosphate Transfection Method and Measurement of Antibody Neutralizing Activity. J. Vis. Exp. (2021).This video demonstrates a luciferase-based assay to quantify pseudovirus infection in epithelial cells. The pseudovirus encodes the luciferase gene, which is expressed in infected cells. After washing, and cells are incubated with lysis buffer at an ultra-low temperature, and then thawed to induce lysis.

Assessing Pseudovirus Infection Using Luciferase Reporter Assay

Este vídeo demonstra ensaios de microneutralização para medir anticorpos neutralizantes usando células renais caninas Madin-Darby que superexpressam ácido siálico ligado a α2,6 em soros humanos. Este ensaio é frequentemente usado para sorologia humana para...

Um ensaio de microneutralização para medir títulos de anticorpos neutralizantes em soro humano

Este vídeo demonstra uma técnica para gerar variantes de escape de anticorpos monoclonais neutralizantes do vírus influenza. A suspensão do vírus neutralizado por anticorpos é injetada em ovos de galinha embrionados para propagar variantes de escape seletivamente. Isso resulta em uma população de vírus predominantemente de variantes de escape, confirmada por meio de um ensaio de hemaglutinação.

Geração de variantes de escape do vírus influenza contra anticorpos neutralizantes

Este estudo descreve uma   -Imagem baseada ensaio de micro-neutralização para analisar as relações antigênicas entre vírus. O protocolo emprega um digitalizador de mesa e tem quatro passos, incluindo titulação, a quantificação de titulação, neutralização, e quantificação de neutralização. O ensaio funciona bem com pdm09 corrente circulante vírus influenza A (H1N1), A (H3N2), e B vírus.

Optimização de um Micro-quantitativa Ensaio de neutralização

Vírus da influenza A (IAVs) são importantes patógenos respiratórios humanos. Para entender a patogenicidade de IAVs e realizar testes pré-clínicos de vacina romance abordagens, modelos animais, imitando a fisiologia humana são necessários. Aqui, descrevemos técnicas para avaliar a patogênese do IAV, respostas humorais e eficácia de vacina usando um modelo do rato da infecção.

Estudos de vírus da influenza A em um modelo do rato da infecção

Nós descrevemos um método pelo qual podemos identificar resíduos críticos necessários para a ligação de anticorpos monoclonais humanos ou murino que se destinam a hemaglutinina viral do vírus da influenza A. O protocolo pode ser adaptado para outras glicoproteínas de superfície do vírus e suas correspondentes anticorpos neutralizantes.

Geração de variantes de fuga de neutralizar os anticorpos monoclonais de vírus da gripe

Anticorpos neutralizantes gripe correlacionam com proteção de infecções de gripe. Microneutralization ensaios medem anticorpos neutralizantes em soros humanos e são frequentemente utilizados para sorologia humana da gripe. Descrevemos um ensaio de microneutralization usando células MDCK-SIAT1 para medir os anticorpos neutralizantes para contemporâneas 3C.2a e 3C.3a A(H3N2) vírus após vacinação gripe ou infecção.

Medição da gripe neutralizando Antibody Responses to A(H3N2) vírus em soros humanos por Microneutralization ensaios usando as células MDCK-SIAT1

Este protocolo descreve um processo experimental para produzir partículas pseudodigitadas virais infecciosas de alto titer (pp) com glicoproteínas envelope de duas cepas de gripe A e como determinar sua infectividade. Este protocolo é altamente adaptável para desenvolver pps de qualquer outro tipo de vírus envolvidos com glicoproteínas envelope diferentes.

Produção de partículas pseudodigitadas de gripe infecciosa de alto titer com glicoproteínas envelope de vírus H5N1 e H7N9 altamente patogênicos

O protocolo descreve um método para cultivar células T aviárias in vitro , isolando células T de memória de patos infectados, permitindo a geração de células T específicas de pato altamente purificadas. Além disso, um método de coloração de citocinas intracelulares (ICS) foi estabelecido para medir com precisão a secreção de IFN-γ em células T de pato.

In vitro Cultura para células T de pato específicas para H5N1 e detecção de respostas imunes usando o método de coloração de citocinas intracelulares

Aprenda a preparar pseudovírus H5N1 de influenza aviária de alta patogenicidade usando transfecção com fosfato de cálcio em células HEK293 FT. Este método permite medir atividade neutralizante de anticorpos com segurança em laboratório de biossegurança nível dois.

Preparação de Vírus da Influenza Aviária H5 Pseudotipados com Método de Transfecção de Fosfato de Cálcio e Mensuração da Atividade Neutralizante de Anticorpos (Vídeo) | JoVE Journal

Preparação de Vírus da Influenza Aviária H5 Pseudotipados com Método de Transfecção de Fosfato de Cálcio e Mensuração da Atividade Neutralizante de Anticorpos

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