Name: Perfil espacial da expressão de proteínas e RNA em tecidos: uma abordagem para ajustar a microdissecção virtual (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-06T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 19 s
Description: Aprenda a selecionar regiões de interesse para tecnologias de omica espacial em amostras de tecido humano. Este protocolo automatizado melhora a robustez e reprodutibilidade em ensaios de proteômica e transcriptômica.

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Os autores reconhecem Thomas Wu por processar arquivos NGS. Agradecemos a James Ziai pelas discussões dos resultados e revisão do manuscrito e Meredith Triplet e Rachel Taylor pela revisão interna do manuscrito.

Todos os tecidos humanos foram adquiridos de biobancos comerciais ou bancos de tecidos credenciados sob a garantia de que a aprovação apropriada do Conselho de Revisão Institucional e o consentimento informado foram obtidos.
Observação : O protocolo é executado usando o Discovery Ultra e o GeoMx Digital Spatial Profiler. Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes sobre reagentes, equipamentos e software usados neste protocolo.
1. Protocolo de visualização automatizada para ensaios de proteômica espacial
<ol><li>Programa de autocoloração para aplicação de anticorpos de visualização fluorescente<ol><li>No software autostamant, clique no botão home e escolha Protocolos. Em seguida, clique em Criar/Editar Protocolos e selecione RUO DISCOVERY Universal como procedimento.</li>
		<li>Clique em Primeira Sequência > Desparafinização > Depar v2. Para Temperatura Média, escolha 72 graus C, clique em Pré-tratamento e selecione Condicionamento celular e Reservatório CC1. Para Very High Temperature, escolha 100 Deg C, clique em CC1 8 Min e continue clicando até que CC1 64 Min seja selecionado.</li>
		<li>Clique em Inibidor > Inibidor DISCOVERY e, para Tempo de Incubação, escolha 8 Minutos. Em seguida, clique em Anticorpo > High Temp Ab Incubation; para Baixa Temperatura, escolha 37 ° C; para Anticorpo, escolha o número do anticorpo no rótulo do dispensador (Anticorpo 6 neste exemplo); para Mais Tempo de Incubação, selecione 32 Minutos. NOTA: Este protocolo tem três números de anticorpos diferentes. O primeiro anticorpo é FAP, o segundo é Pan-Citoqueratina e o terceiro é o Anticorpo X.</li>
		<li>Clique em Multimer HRP > Multimer HRP Blocker, em seguida, para Antibody Blocking, escolha Gt Ig Block e, para Incubation Time, escolha 4 Minutes. Em seguida, em Multimer HRP Reagent, selecione OMap anti-Rb HRP e, para Tempo de Incubação, escolha 16 Minutos. Em seguida, clique em Cy5 e, para Tempo de Incubação Longo, escolha 0 H 8 Min.</li>
		<li>Clique em Dual Sequence e escolha Antibody Denaturation, em seguida, selecione Antibody Denature CC2-1 e, para Very High Temperature, escolha 100 Deg C. Certifique-se de que o tempo de incubação é de 8 min. Em seguida, clique em Inibidor de DS e selecione Neutralizar.</li>
		<li>Clique em DS Antibody, e para Very Low Temperature, escolha 37 Deg C. Em seguida, em Anticorpo, escolha o número do anticorpo no rótulo do dispensador (Anticorpo 3 neste exemplo) e, para Tempo de Incubação Plus, selecione 32 Minutos.</li>
		<li>Clique em DS Multimer HRP e escolha DS Multimer HRP Blocker. Em seguida, para Bloqueio de Anticorpos, selecione Gt Ig Block e, para Tempo de Incubação, escolha 4 Minutos. Em seguida, em Multimer HRP Reagent, selecione OMap anti-Ms HRP e, para Tempo de Incubação, escolha 16 Minutos. Em seguida, clique em DS Rhodamine 6G e, para Tempo de Incubação Longo, escolha 0 Hr 8 Min.</li>
		<li>Clique em Tripla Mancha e selecione TS Desnaturação de Anticorpos, em seguida, selecione Desnaturação de Anticorpos CC2-2 e, para Temperatura Muito Alta, selecione 100 Deg C. Certifique-se de que o tempo de incubação é de 8 min. Em seguida, clique em Inibidor de TS e selecione TS Neutralizar.</li>
		<li>Clique em TS Anticorpo e, para Temperatura Muito Baixa, selecione 37 graus C. Em seguida, em Anticorpo, selecione o número do anticorpo no rótulo do dispensador (Anticorpo 7 neste exemplo) e, para Tempo de Incubação Adicional, selecione 32 Minutos.</li>
		<li>Clique em TS Multimer HRP e escolha TS Multimer HRP Blocker. Em seguida, para Bloqueio de Anticorpos, selecione Gt Ig Block e, para Tempo de Incubação, escolha 4 Minutos. Em seguida, em Multimer HRP Reagent, selecione OMap anti-Rb HRP e, para Tempo de Incubação, escolha 16 Minutos. Em seguida, clique em TS FAM e, para Tempo de Incubação Longo, escolha 0 H 8 Min.</li>
		<li>Adicione um título ao protocolo. Selecione um número de protocolo, adicione um comentário e clique em Ativo seguido de Salvar.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparar diapositivos, imprimir etiquetas e iniciar a execução do autostainer<ol><li>O fornecedor de panificação adquiriu seções de tecido humano FFPE (fixadas em formalina e embutidas em parafina) em um forno ajustado a 70 °C por 20-60 min. Enquanto os slides estiverem assando, imprima as etiquetas clicando em Criar Etiqueta no software de coloração automática. Em seguida, clique em Protocolos, selecione o número do protocolo e clique em Fechar/Imprimir. Adicione informações relevantes na etiqueta do slide e clique em Imprimir.</li>
		<li>Retire as lâminas do forno e deixe-as esfriar até a temperatura ambiente (RT). Aplique as etiquetas de protocolo impressas anteriormente aos slides correspondentes.</li>
		<li>Carregar os dispensadores de anticorpos recarregáveis com anticorpos de acordo com o número do rótulo do anticorpo atribuído na etapa 1.1. Neste protocolo, use o Anticorpos 6 para PAF a 1 μg/mL, use o Anticorpo 3 para Pan-Citoqueratina a 0,1 μg/mL e use o Anticorpo 7 para o Anticorpo X a 2,5 μg/mL. Diluir cada anticorpo no diluente especificado e preparar os dispensadores de anticorpos recarregáveis.</li>
		<li>Reúna os dispensadores de reagentes pré-cheios de bloqueio, detecção e amplificação mencionados acima e coloque-os em uma bandeja de reagentes. Carregue slides nas bandejas de slides (até 30 slides por execução) e clique em Executando seguido de Sim. Observe que o DAPI não é usado para contracoloração nuclear.</li>
		<li>Confirme o início da execução verificando a duração da execução no software de retenção automática. O protocolo leva ~ 11 h para conclusão e pode ser executado durante a noite.</li>
		<li>No dia seguinte, garanta a conclusão da corrida observando luzes verdes piscando nos slots da bandeja deslizante. Em seguida, retire as lâminas do instrumento e lave-as vigorosamente em 1x Buffer de Reação até que a solução de cobertura líquida seja completamente removida.</li>
	</ol></li>
	<li>Protocolo de plataforma de perfil espacial para ensaio proteômico<ol><li>Siga o protocolo de proteômica espacial indicado na nota abaixo. Inclua as seguintes alterações no protocolo para habilitar o procedimento de rotulagem automatizada de 3 plexos.</li>
		<li>Execute as etapas 1.2.1-1.2.6 no dia anterior ao início do protocolo de proteômica espacial e vá direto para a etapa de recuperação de antígenos do protocolo de proteômica espacial após a execução da etapa 1.2.6. Omita o procedimento de visualização descrito no protocolo de proteômica de perfil espacial.</li>
		<li>Substitua o SYTO 13 pelo SYTO 64 a 5000 nM para permitir a integração do fluoróforo. Diluir SYTO 64 em 1x TBS e incubar em uma câmara de umidade por 15 min.</li>
		<li>Ao configurar os parâmetros de varredura na plataforma de perfil espacial, selecione os filtros e canais de foco de acordo com os fluoróforos usados no painel de visualização para permitir a integração de 3 plexos. Use FITC para DISCOVERY FAM e defina a exposição para 200 ms, use Cy3 para DISCOVERY Rhodamine 6G e defina a exposição para 200 ms, use Texas Red para SYTO 64 e defina a exposição para 50 ms (especifique isso como o canal de foco) e, finalmente, use Cy5 para DISCOVERY Cy5, defina a exposição para 200 ms, e salvar alterações. NOTA: Instruções detalhadas do protocolo proteômico de perfil espacial são encontradas na guia Suporte do site oficial, selecionando Documentação > Manuais do Usuário. Aqui, procure o protocolo de proteína para nCounter usando Bond RX.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Seleção de ROI para ensaios de transcriptômica espacial
<ol><li>Asse as seções de pellets de células FFPE em um forno ajustado a 70 °C por 20-60 min. Siga o protocolo NGS da plataforma de perfil espacial indicado na nota abaixo e digitalize slides na plataforma de perfil espacial, selecionando tamanhos de 50 μm e 300 μm. A seguinte recomendação é destacada para o ensaio de transcriptômica espacial:<ol><li>Ao preparar a biblioteca, se vários tamanhos de ROIs foram selecionados, junte ROIs de tamanhos semelhantes para criar uma biblioteca por tamanho. Isso é para garantir que profundidades de sequenciamento suficientes sejam alcançadas para todos os ROIs sem viés de tamanho. NOTA: Instruções detalhadas da plataforma de perfil espacial são encontradas na guia Suporte do site oficial, selecionando Documentação > Manuais do Usuário. Aqui, procure o protocolo de RNA para aplicações NGS usando Bond RX.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Nerurkar, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+spatial+profiling+of+cancer+tissues+in+the+era+of+immunotherapy%3A+The+potential+and+promise%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Transcriptional spatial profiling of cancer tissues in the era of immunotherapy: The potential and promise.</a> Cancers. 12 (9), 2572(2020).</li>
<li>Decalf, J., Albert, M. L., Ziai, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+tools+for+pathology%3A+a+user%27s+review+of+a+highly+multiplexed+method+for+in+situ+analysis+of+protein+and+RNA+expression+in+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">New tools for pathology: a user's review of a highly multiplexed method for in situ analysis of protein and RNA expression in tissue.</a> Journal of Pathology. 247 (5), 650-661 (2019).</li>
<li>McGinnis, L. M., Ibarra-Lopez, V., Rost, S., Ziai, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+and+research+applications+of+multiplexed+immunohistochemistry+and+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Clinical and research applications of multiplexed immunohistochemistry and in situ hybridization.</a> Journal of Pathology. 254 (4), 405-417 (2021).</li>
<li>NanoString. GeoMx Digital Spatial Profiler. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://nanostring.com/products/geomx-digital-spatial-profiler/geomx-dsp-overview">https://nanostring.com/products/geomx-digital-spatial-profiler/geomx-dsp-overview</a> (2022).</li>
<li>NanoString. GeoMx Digital Spatial Profiler. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://nanostring.com/wp-content/uploads/BR_MK0981_GeoMx_Brochure_r19_FINAL_Single_WEB.pdf">https://nanostring.com/wp-content/uploads/BR_MK0981_GeoMx_Brochure_r19_FINAL_Single_WEB.pdf</a> (2022).</li>
<li>McCart Reed, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+spatial+profiling+application+in+breast+cancer%3A+a+user%27s+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Virchows+Arch%3A+An+International+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Digital spatial profiling application in breast cancer: a user's perspective.</a> Virchows Arch: An International Journal of Pathology. 477 (6), 885-890 (2020).</li>
<li>McNamara, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+proteomic+characterization+of+HER2-positive+breast+tumors+through+neoadjuvant+therapy+predicts+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cancer%22%5BJournal%5D)">Spatial proteomic characterization of HER2-positive breast tumors through neoadjuvant therapy predicts response.</a> Nature Cancer. 2 (4), 400-413 (2021).</li>
<li>Kim, S. W., Roh, J., Park, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemistry+for+pathologists%3A+Protocols%2C+pitfalls%2C+and+tips%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pathology+and+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemistry for pathologists: Protocols, pitfalls, and tips.</a> Journal of Pathology and Translational Medicine. 50 (6), 411-418 (2016).</li>
<li>Muñoz, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecularly+targeted+photothermal+ablation+improves+tumor+specificity+and+immune+modulation+in+a+rat+model+of+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Communications+Biology%22%5BJournal%5D)">Molecularly targeted photothermal ablation improves tumor specificity and immune modulation in a rat model of hepatocellular carcinoma.</a> Communications Biology. 3 (1), 783(2020).</li>
<li>Coleman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyaluronidase+impairs+neutrophil+function+and+promotes+Group+B+Streptococcus+invasion+and+preterm+labor+in+nonhuman+primates%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Hyaluronidase impairs neutrophil function and promotes Group B Streptococcus invasion and preterm labor in nonhuman primates.</a> mBio. 12 (1), 03115-03120 (2021).</li>
<li>Gupta, S., Zugazagoitia, J., Martinez-Morilla, S., Fuhrman, K., Rimm, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+quantitative+assessment+of+PD-L1+using+digital+spatial+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Investigation%3B+A+Journal+of+Technical+Methods+and+Pathology%22%5BJournal%5D)">Digital quantitative assessment of PD-L1 using digital spatial profiling.</a> Laboratory Investigation; A Journal of Technical Methods and Pathology. 100 (10), 1311-1317 (2020).</li>
<li>Carter, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics+and+spatially+defined+immune+%28micro%29landscapes+of+early-stage+PD-L1-positive+triple-negative+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Characteristics and spatially defined immune (micro)landscapes of early-stage PD-L1-positive triple-negative breast cancer.</a> Clinical Cancer Research. 27 (20), 5628-5637 (2021).</li>
<li>Busse, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoprofiling+in+neuroendocrine+neoplasms+unveil+immunosuppressive+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Immunoprofiling in neuroendocrine neoplasms unveil immunosuppressive microenvironment.</a> Cancers. 12 (11), 3448(2020).</li>
<li>Kulasinghe, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+of+lung+SARS-CoV-2+and+influenza+virus+infection+dissects+virus-specific+host+responses+and+gene+signatures%5BTitle%5D)+AND+%22European+Respiratory+Journal%22%5BJournal%5D)">Profiling of lung SARS-CoV-2 and influenza virus infection dissects virus-specific host responses and gene signatures.</a> European Respiratory Journal. 59 (1), (2021).</li>
<li>Li, X., Wang, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+bulk%2C+single-cell+to+spatial+RNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Oral+Science%22%5BJournal%5D)">From bulk, single-cell to spatial RNA sequencing.</a> International Journal of Oral Science. 13 (36), (2021).</li>
<li>Merritt, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+digital+spatial+profiling+of+proteins+and+RNA+in+fixed+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Multiplex digital spatial profiling of proteins and RNA in fixed tissue.</a> Nature Biotechnology. 38 (5), 586-599 (2020).</li>
<li>Van, T. M., Blank, C. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+user%27s+perspective+on+GeoMxTM+digital+spatial+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Immuno-Oncology+Technology%22%5BJournal%5D)">A user's perspective on GeoMxTM digital spatial profiling.</a> Immuno-Oncology Technology. 1, 11-18 (2019).</li>
<li>Introduction to GeoMx Normalization: Protein. White Paper. Nanostring. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://nanostring.com/wp-content/uploads/MK2593_GeoMx_Normalization-Protein.pdf">https://nanostring.com/wp-content/uploads/MK2593_GeoMx_Normalization-Protein.pdf</a> (2020).</li>
<li>Bergholtz, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Best+practices+for+spatial+profiling+for+breast+cancer+research+with+the+geomx+spatial+profiler%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Best practices for spatial profiling for breast cancer research with the geomx spatial profiler.</a> Cancers. 13 (17), 4456(2021).</li>
<li>Hwang, W. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-nucleus+and+spatial+transcriptomics+of+archival+pancreatic+cancer+reveals+multi-compartment+reprogramming+after+neoadjuvant+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22BioRxiv%22%5BJournal%5D)">Single-nucleus and spatial transcriptomics of archival pancreatic cancer reveals multi-compartment reprogramming after neoadjuvant treatment.</a> BioRxiv. , (2020).</li>
<li>Jerby-Arnon, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opposing+immune+and+genetic+mechanisms+shape+oncogenic+programs+in+synovial+sarcoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Opposing immune and genetic mechanisms shape oncogenic programs in synovial sarcoma.</a> Nature Medicine. 27 (2), 289-300 (2021).</li>
</ol>

Veronica Ibarra-Lopez, Sangeeta Jayakar, Yeqing Angela Yang, Zora Modrusan e Sandra Rost são funcionárias e acionistas da Genentech, membro do Grupo Roche. Outras empresas que fazem parte da Roche produzem reagentes e instrumentos utilizados neste manuscrito. Ciara Martin é funcionária em tempo integral da NanoString Technologies Inc, que produz reagentes e instrumentos usados neste manuscrito.

Até o momento, anticorpos fluorescentes diretamente conjugados em um protocolo manual são mais comumente utilizados como painéis de visualização para ensaios de proteômica espacial ou transcriptômica espacial 9,10. No entanto, o uso de anticorpos fluorescentes diretamente conjugados pode ser um desafio para marcadores menos abundantes, limitando a seleção de anticorpos adequados. Este protocolo mostra que a marcação de marcadores de visualização pode ser automati...

Os avanços nas técnicas de multiplexação continuam a fornecer melhores ferramentas de caracterização para alvos presentes em tumores. O microambiente tumoral (EMT) é um sistema complexo de células tumorais, infiltrando células imunes e estroma, onde a informação espacial é fundamental para melhor compreender e interpretar os mecanismos de interação entre biomarcadores de interesse1. Com técnicas emergentes, como o GeoMx Digital Spatial Profiler (DSP) e o 10x Visium, vários alvos podem ser detectados e quantificados simultaneamente dentro de seu contexto espacial. O uso de protocolos de imunofluorescência que facilitam a visualização tecidual pode melhorar ainda mais as capacidades de perfil espacial dessas tecnologias.
A tecnologia Spatial Omics em que nos concentramos para o desenvolvimento deste método consiste em ensaios espaciais de proteômica e transcriptômica onde oligonucleotídeos são ligados a anticorpos ou sondas de RNA através de um ligador fotoclivista sensível a UV. As lâminas histológicas são marcadas com esses anticorpos ou sondas oligoconjugados e, em seguida, fotografadas na plataforma de perfil espacial. Em seguida, ROIs de diferentes tamanhos e formas são selecionados para iluminação, e os oligonucleotídeos fotoclivados são aspirados e coletados em uma placa de 96 poços. Os oligonucleotídeos fotoclivados são preparados para serem quantificados com o sistema Nanostring nCounter ou o Next Generation Sequencing (NGS)2,3 (Figura 1)4,5.
As distribuições celulares variam dentro dos tecidos, e a capacidade de caracterizar locais específicos das células usando marcadores selecionados e diferentes tamanhos de ROI é de grande importância para entender completamente o ambiente tecidual e identificar características específicas. Na tecnologia Spatial Omics mencionada aqui, o protocolo de visualização padrão usa anticorpos diretamente conjugados e é um protocolo manual. Os marcadores padrão para distinguir entre tumor e estroma são pancitoqueratina (panCK) e CD456,7, mas marcadores adicionais são necessários para atingir populações celulares específicas de interesse. Além disso, o uso de anticorpos fluorescentes diretamente conjugados carece de amplificação, o que limita a seleção de anticorpos a marcadores abundantes. Além disso, os ensaios manuais estão sujeitos a mais variabilidade do que os fluxos de trabalho automatizados8. Portanto, é desejável ter um protocolo de visualização personalizável, automatizado e amplificado para a seleção de ROI.
Aqui, o estudo demonstra que, para ensaios de proteômica espacial, a tecnologia TSA pode ser usada para protocolos de visualização em uma plataforma automatizada, resultando em um ensaio mais direcionado e padronizado. Além disso, os ensaios baseados em TSA permitem o uso de marcadores de baixa expressão, aumentando a gama de alvos que podem ser selecionados para visualização. Um ensaio de 3 plexos para panCK, PAF e Anticorpo X foi desenvolvido usando uma plataforma automatizada onde panCK e PAF foram usados para diferenciar entre tumor e estroma, respectivamente. O anticorpo X é uma proteína estromal frequentemente encontrada em tumores, mas sua biologia e impacto na imunidade antitumoral não são totalmente compreendidos. Caracterizar o contexto imunológico em áreas ricas em anticorpos X pode elucidar seu papel na imunidade antitumoral e na resposta terapêutica, bem como seu potencial como alvo de medicamentos.
Embora os painéis automatizados personalizados de visualização TSA tenham se mostrado bem-sucedidos para ensaios de proteômica espacial, a aplicação desses ensaios para ensaios de transcriptômica espacial não pôde ser confirmada. Isso provavelmente se deve aos reagentes e ao protocolo utilizado para os protocolos de visualização automatizada, que parecem comprometer a integridade do RNA. Reconhecer que um protocolo de rotulagem automatizado para marcadores de visualização pode ser usado para ensaios de proteômica espacial, mas não para ensaios de transcriptômica espacial, fornece orientação importante sobre os projetos de ensaios da tecnologia Spatial Omics.
Além disso, o estudo demonstra que o ensaio de transcriptômica espacial pode ser usado para traçar o perfil de alvos em regiões tão pequenas quanto 50 μm de diâmetro, ou aproximadamente 15 células. Duas ROIs de tamanhos diferentes foram selecionadas para testar a capacidade do ensaio de também detectar transcritos em pequenas ROIs. Para cada região de interesse, oligos correspondentes a 1.800 alvos de mRNA foram coletados e transformados em bibliotecas de acordo com o protocolo da plataforma de perfil espacial. As bibliotecas foram indexadas individualmente, posteriormente agrupadas e sequenciadas. Isso permitiu a avaliação da eficiência do agrupamento e da capacidade de identificar populações celulares específicas em pequenas ROIs.
Este trabalho mostra que, para ensaios de proteômica espacial, um protocolo automatizado para orientar a seleção de ROI em marcadores específicos de interesse pode ser usado para direcionar seletivamente a interrogação de áreas teciduais relevantes e caracterizar o ambiente espacial do tecido. Além disso, demonstramos que ROIs menores podem ser usadas para ensaios transcriptômicos espaciais para detectar e caracterizar populações celulares específicas.

<table><tbody><tr><td>10x Tris tampão salino (TBS)</td><td>Cell Signaling Technologies</td><td>12498S</td><td>Diluído para 1x TBS em água tratada com DEPC</td></tr><tr><td>Anticorpo X (não divulgado)</td><td></td><td></td><td>anticorpo cego devido à confidencialidade</td></tr><tr><td>Água tratada com DEPC</td><td>ThermoFisher</td><td>AM9922</td><td>Outro pode ser usado</td></tr><tr><td>DISCOVERY Cell Conditioning ( CC1)</td><td>Ventana</td><td>950-500</td><td></td></tr><tr><td>DISCOVERY Cy5 Kit</td><td>Ventana</td><td>760-238</td><td>Referido como Cy5</td></tr><tr><td>DISCOVERY FAM Kit</td><td>Ventana</td><td>760-243</td><td>Referido como FAM</td></tr><tr><td>DISCOVERY Goat Ig Block</td><td>Ventana</td><td>760-6008</td><td>Referido como Gt Ig Block</td></tr><tr><td>DISCOVERY OmniMap anti-Ms HRP</td><td>Ventana</td><td>760-4310</td><td>Referido como OMap anti-Ms HRP</td></tr><tr><td>DISCOVERY OmniMap anti-Rb HRP</td><td>Ventana</td><td>760-4311</td><td>Referido como OMap anti-Rb</td></tr><tr><td>HRP DISCOVERY Rhodamine 6G Kit</td><td>Ventana</td><td>760-244</td><td>Referido como Rodamina 6G</td></tr><tr><td>DISCOVERY ULTRA Sistema Automatizado de Preparação de Lâminas</td><td>Ventana</td><td>05 987 750 001 / N750-DISU-FS</td><td>Referido como corador automático no manuscrito</td></tr><tr><td>FAP [EPR20021] Anticorpo</td><td>Abcam Ab207178</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GeoMx Digital Spatial Profiler</td><td>NanoString</td><td>GMX-DSP-1Y</td><td>Referido como plataforma de perfil espacial no manuscrito</td></tr><tr><td>Câmara de umidade</td><td>Simport</td><td>M920-2</td><td>Outro pode ser usado</td></tr><tr><td>Pan-citoqueratina [AE1/AE3] Anticorpo</td><td>Abcam</td><td>Ab27988</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade Mountant</td><td>ThermoFisher</td><td>P36934</td><td></td></tr><tr><td>Python</td><td>Python</td><td></td><td>Análise estatística</td></tr><tr><td>Tampão de reação (10x)</td><td>Ventana</td><td>950-300</td><td></td></tr><tr><td>Software de análise estatística</td><td>GraphPad</td><td>Prism 7</td><td>Análise estatística</td></tr><tr><td>SYTO 64</td><td>ThermoFisher</td><td>S11346</td><td></td></tr><tr><td>ULTRA Cell Conditioning (ULTRA CC2)</td><td>Ventana</td><td>950-223</td><td></td></tr><tr><td>Ventana Anticorpo Diluente com Caseína</td><td>Ventana</td><td>760-219</td><td>Referido como diluente especificado no manuscrito</td></tr><tr><td>Ventana Dispensador primário de anticorpos</td><td>Ventana</td><td></td><td>O número de catálogo depende do número do dispensador</td></tr></tbody></table>

perfil espacial da expressão de proteínas e rna em tecidos: uma abordagem para ajustar a microdissecção virtual

Spatial Profiling of Protein and RNA Expression in Tissue: An Approach to Fine-Tune Virtual Microdissection

A multiplexação permite a avaliação de vários marcadores no mesmo tecido, proporcionando contexto espacial. As tecnologias Spatial Omics permitem a multiplexação de proteínas e RNA, alavancando anticorpos e sondas oligo-marcados foto-cliváveis, respectivamente. Os oligos são clivados e quantificados a partir de regiões específicas em todo o tecido para elucidar a biologia subjacente. Aqui, o estudo demonstra que protocolos automatizados de visualização de anticorpos personalizados podem ser utilizados para orientar a seleção de ROI em conjunto com ensaios de proteômica espacial. Este método específico não mostrou desempenho aceitável com ensaios de transcriptômica espacial. O protocolo descreve o desenvolvimento de um ensaio de imunofluorescência (FI) de 3 plexos para visualização de marcadores em uma plataforma automatizada, usando amplificação de sinal de tiramida (TSA) para amplificar o sinal fluorescente de um determinado alvo de proteína e aumentar o pool de anticorpos para escolher. O protocolo de visualização foi automatizado usando um ensaio de 3 plexos completamente validado para garantir a qualidade e a reprodutibilidade. Além disso, a troca de DAPI por corantes SYTO foi avaliada para permitir a obtenção de imagens de ensaios de FI baseados em TSA na plataforma de perfil espacial. Além disso, testamos a capacidade de selecionar pequenas ROIs usando o ensaio de transcriptômica espacial para permitir a investigação de áreas de interesse altamente específicas (por exemplo, áreas enriquecidas para um determinado tipo de célula). Foram coletadas ROIs de 50 μm e 300 μm de diâmetro, o que corresponde a aproximadamente 15 células e 100 células, respectivamente. As amostras foram transformadas em bibliotecas e sequenciadas para investigar a capacidade de detectar sinais de pequenas ROIs e regiões específicas do perfil do tecido. Determinamos que as tecnologias de proteômica espacial se beneficiam altamente de protocolos automatizados e padronizados para orientar a seleção de ROI. Embora esse protocolo de visualização automatizada não fosse compatível com ensaios de transcriptômica espacial, pudemos testar e confirmar que populações celulares específicas podem ser detectadas com sucesso mesmo em pequenas ROIs com o protocolo de visualização manual padrão.

Protocolo de visualização automatizada para orientar a seleção de ROI Neste artigo, apresentamos o uso de um protocolo IF automatizado e personalizado baseado em TSA para visualizar o tecido e selecionar ROIs específicas. O desenvolvimento do painel de visualização usando melanoma e pele humana normal como tecidos de controle consistiu em testes de estabilidade de epítopos, ajuste fino das intensidades dos marcadores e avaliação de sangramento através de controles de deixar um de fora. Para testar se ...

Aqui, descrevemos um protocolo para ajuste fino de regiões de interesse (ROIs) para tecnologias de Ômica Espacial para melhor caracterizar o microambiente tumoral e identificar populações celulares específicas. Para ensaios proteômicos, protocolos personalizados automatizados podem orientar a seleção de ROI, enquanto os ensaios transcriptômicos podem ser ajustados utilizando ROIs tão pequenos quanto 50 μm.

Perfil espacial da expressão de proteínas e RNA em tecidos: uma abordagem para ajustar a microdissecção virtual

Multiplexing enables the assessment of several markers on the same tissue while providing spatial context. Spatial Omics technologies allow both protein ...

Este protocolo ajuda a orientar a seleção de regiões de interesse para tecnologias ômicas espaciais, o que permite uma caracterização mais direcionada de tecidos ou populações celulares. Um protocolo automatizado para seleção de ROI em ensaios proteômicos é mais robusto e reprodutível do que protocolos manuais, e o uso de ROIs de 50 micrômetros para ensaios transcriptômicos permite o perfil de populações celulares específicas. Comece programando o autostainer para aplicar anticorpos de visualização fluorescente.No software autostamant, clique no botão home e escolha Protocolos. Em seguida, clique em Criar/Editar Protocolos e selecione RUO Discovery Universal como procedimento. Clique em Primeira Sequência e, em seguida, selecione Deparaffinazation, seguido por Depar v2.Para Temperatura Média, escolha 72 graus Celsius, clique em Pré-tratamento e selecione Condicionamento Celular e Reservatório CC1. Para Very High Temperature, escolha 100 graus Celsius, clique em CC1 oito minutos e continue clicando até que CC1 64 minutos seja selecionado. Clique em Inibidor, selecione Inibidor DISCOVERY e, para Tempo de Incubação, escolha oito minutos.Em seguida, clique em Anticorpo, seguido de Incubação de Anticorpo de Alta Temperatura. Para Baixa Temperatura, escolha 37 graus Celsius. Para Anticorpos, escolha o ANTICORPO 6 no rótulo do dispensador.Para Mais Tempo de Incubação, selecione 32 minutos. Clique em Multimer HRP e, em seguida, selecione Multimer HRP Blocker. Em seguida, para Bloqueio de Anticorpos, escolha Gt Ig Block.E para Tempo de Incubação, escolha quatro minutos. Em seguida, em Multimer HRP Reagent, selecione OMap Anti-Rb HRP e, para Tempo de incubação, escolha 16 minutos. Em seguida, clique em Cy5 e, para Tempo de Incubação Longo, escolha zero hora, oito minutos.Clique em Dual Sequence e escolha Antibody Denaturation. Em seguida, selecione Antibody Denature CC2-1 e, para uma temperatura muito alta, escolha 100 graus Celsius. Certifique-se de que o tempo de incubação seja de oito minutos.Em seguida, clique em Inibidor de DS e selecione Neutralizar. Clique em DS Antibody e, para Very Low Temperature, escolha 37 graus Celsius. Em seguida, em Anticorpo, escolha ANTICORPO 3 no rótulo do dispensador.E para Mais Tempo de Incubação, selecione 32 minutos. Clique em DS Multimer HRP e escolha DS Multimer HRP Blocker. Em seguida, para Bloqueio de Anticorpos, selecione Gt Ig Block e, para Tempo de Incubação, escolha quatro minutos.Em seguida, em Multimer HRP Reagent, selecione OMap anti-Ms HRP e, para Tempo de incubação, escolha 16 minutos. Em seguida, clique em DS Rhodamine 6G e, para Tempo de Incubação Longo, escolha zero hora, oito minutos. Clique em Tripla Mancha e selecione Desnaturação de Anticorpos TS, em seguida, selecione Desnaturação de Anticorpos CC2-2 e, para Temperatura Muito Alta, selecione 100 graus Celsius.Certifique-se de que o tempo de incubação seja de oito minutos. Em seguida, clique em Inibidor de TS e selecione TS Neutralizar. Clique em TS Anticorpo e, para Temperatura Muito Baixa, selecione 37 graus Celsius.Em seguida, em Anticorpo, selecione o ANTICORPO 7 no rótulo do dispensador e, para Tempo de Incubação Adicional, selecione 32 minutos. Clique em TS Multimer HRP e escolha TS Multimer HRP Blocker. Em seguida, para Bloqueio de Anticorpos, selecione Gt Ig Block e, para Tempo de Incubação, escolha quatro minutos.Em seguida, em Multimer HRP Reagent, selecione OMap Anti-Rb HRP e, para Tempo de incubação, escolha 16 minutos. Em seguida, clique em TS FAM e, para Tempo de Incubação Longo, escolha zero hora, oito minutos. Clique em Salvar e adicione um título ao protocolo.Selecione um número de protocolo, adicione um comentário e clique em Ativo, seguido de Salvar. Asse as seções de tecido humano embutidas em parafina fixadas em formalina adquiridas pelo fornecedor em um forno ajustado a 70 graus Celsius por 20 a 60 minutos. Enquanto os slides estiverem assando, imprima as etiquetas clicando em Criar Etiqueta no software de coloração automática.Em seguida, clique em Protocolos, selecione o número do protocolo e clique em Fechar/Imprimir. Adicione informações relevantes na etiqueta do slide e clique em Imprimir. Retire as lâminas do forno e deixe-as esfriar até a temperatura ambiente.Aplique as etiquetas de protocolo impressas anteriormente aos slides correspondentes. Carregue os dispensadores de anticorpos recarregáveis com anticorpos de acordo com os números do rótulo do anticorpo. Diluir cada anticorpo no diluente especificado e preparar os dispensadores de anticorpos recarregáveis.Reúna dispensadores de reagentes pré-preenchidos com bloqueio, detecção e amplificação e coloque-os na bandeja do reagente do instrumento. Carregue slides nas gavetas de slides e clique em Execução, seguido de Sim. Confirme o início da execução verificando a duração da execução no software de retenção automática.No dia seguinte, garanta a conclusão da corrida observando luzes verdes piscando nos slots da gaveta deslizante. Em seguida, retire as lâminas do instrumento e enxágue as lâminas vigorosamente em tampão de reação 1x até que a solução de deslizamento da tampa líquida seja completamente removida. Substitua o SYTO 13 pelo SYTO 64 a 5.000 nanomolares para permitir a integração do fluoróforo.Diluir SYTO 64 em 1x TBS e incubar em uma câmara de umidade por 15 minutos. Use o FITC para DISCOVERY Fam e defina a exposição para 200 milissegundos. Use Cy3 para DISCOVERY Rhodamine 6G e defina a exposição para 200 milissegundos.Use Texas Red para SYTO 64 e defina a exposição para 50 milissegundos. Especifique SYTO 64 como o canal de foco e, finalmente, use Cy5 para DISCOVERY Cy5. Defina a exposição para 200 milissegundos e salve as alterações.Asse as seções de pellets de células embutidas em parafina fixadas em formalina em um forno ajustado a 70 graus Celsius por 20 a 60 minutos. Digitalize slides na plataforma de perfil espacial e selecione tamanhos de 50 micrômetros e 300 micrômetros. O protocolo de visualização automatizada foi desenvolvido incluindo controles de deixar um de fora para confirmar que não houve sangramento dos canais vizinhos.O mapa de calor log 2 de todos os marcadores incluídos no ensaio de proteômica espacial comparando o protocolo manual de pan-citoqueratina CD 45 em preto com o protocolo automatizado de 3-plex em cinza mostra um valor de Spearman R de 0,88. Dos 31 anticorpos utilizados nos ensaios, 23 anticorpos apresentaram um valor de Spearman R maior ou igual a 0,5. O mapa de calor log 2 dos alvos selecionados incluídos no ensaio de transcriptômica espacial comparando o protocolo manual de pan-citoqueratina CD 45 em preto com o protocolo automatizado de 3-plex em cinza mostrou diferenças nesses valores.Os dados de sequenciamento para o protocolo de visualização automatizada de 3 plexos apresentaram valores inferiores quando comparados ao protocolo de visualização manual de pan-citoqueratina CD 45, o que também se reflete nos baixos valores de R de Spearman de 0,15. Além disso, uma perda de faixa dinâmica foi observada ao usar o protocolo automatizado de visualização de 3 plexos. A detecção de pequenas ROIs no protocolo de transcriptômica espacial foi realizada pela seleção de regiões circulares de interesse a 50 micrômetros e 300 micrômetros de diâmetro, contagens de RNA para alvos selecionados em diferentes linhagens celulares foram comparáveis entre as duas regiões de interesse após a normalização.Este protocolo para painéis de visualização automatizada pode ser adaptado por pesquisadores através da troca de marcadores, a fim de desenvolver painéis que definem com precisão ROIs para responder às suas questões de proteômica espacial.

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

Pesquisa sobre o Câncer

Microdissecção a laser foi aplicado para analisar perfil de expressão gênica em compartimentos específicos de Drosophila disco asa submetido a RNAi...

Microdissecção a laser Aplicada ao perfil de expressão gênica de subconjunto de células a partir do Drosophila Asa Disco

Descrevemos um protocolo para microdisseção a laser de subsegmentos do rim humano, incluindo o glomerulus, túbulo proximal, membro ascendente espesso, coletor de duto e interstício. O RNA é então isolado dos compartimentos obtidos e o sequenciamento de RNA é realizado para determinar alterações na assinatura transcriômica dentro de cada subsegmento.

Aplicação de microdisseção a laser para descobrir transcrição regional em tecido renal humano

A retina exibe uma organização espacial complexa em toda a sua estrutura laminar. As técnicas modernas de transcriptômica espacial e sequenciamento requerem seções de tecido &lt; 20 μm de espessura, limitando sua aplicabilidade na pesquisa da retina. Este método de crioseccionamento recém-congelado produz seções finas na face da retina do camundongo, preservando as relações espaciais planares, permitindo um mapeamento molecular abrangente entre as lâminas.

En face Crioseccionamento de retina de camundongo para análise molecular espacial de alta dimensão

Este artigo apresenta um protocolo para realizar um perfil transcriptômico espacial abrangente do RNA do hospedeiro, viral, fúngico e microbioma a partir de seções de tecido embebidas em parafina fixadas em formalina usando Stereo-seq, que permite o mapeamento de alta resolução de diversos transcriptomas, preservando a arquitetura do tecido.

Perfil espacial abrangente de transcriptomas agnósticos de espécies via Stereo-seq

Esse protocolo inclui um fluxo de trabalho passo a passo para amostras vasculares calcificadas: manuseio de tecidos, descalcificação, validação de RNA, detecção de níveis de calcificação e estratégias de seleção por região de interesse no Nanostring GeoMx Digital Spatial Profiler (DSP). O objetivo é apresentar um método abrangente para preservar a morfologia do tecido vascular e o RNA para análise transcriptômica espacial confiável.

Preparação e Processamento de Artérias Calcificadas com Morfologia e RNA Preservados para Perfil Espacial Digital

Este protocolo descreve um método para isolar RNA de regiões histológicas definidas de tecido hepático de camundongo, fixado com paraformaldeído, composto de Temperatura Ótima de Corte, utilizando microdissecação por captura a laser, permitindo análise direcionada de expressão gênica a jusante.

Microdissecação por captura a laser de tecido hepático de camundongo fixado com paraformaldeído para análise de RNA

Este estudo apresenta um protocolo multioma espacial Trekker–CUT&amp;Tag que combina codificação de barras espacial direta de uma seção de tecido com análise multioma de célula única. Essa abordagem permite o perfilamento espacialmente resolvido de uma única célula da expressão gênica e a modificação da histona H3K27ac simultaneamente, oferecendo insights mecanicistas sobre a regulação gênica no contexto da microanatomia tecidual.

Perfilamento Multiômico Integrado de Célula Única Espacialmente Resolvido do Transcriptoma e Alvos Epigenômicos em Seções de Tecido Congelado

Este protocolo demonstra como gerar tumores clonais fluorescente marcada, geneticamente definidas no Drosophila olho / discos imaginais antenares (DAE). Ele descreve como dissecar o EAD e do cérebro a partir do terceiro larvas e como processá-los para visualizar e quantificar as mudanças de expressão gênica e invasão tumoral.

o<em&gt; Drosophila</em&gt; Imaginal Modelo Disc Tumor: visualização e quantificação da expressão gênica e invasão tumoral Usando Mosaicos Genéticos

Atualmente, coloração imunofluorescente sobre células fixas é o método de escolha para determinação dos níveis de expressão de proteínas quando informações morfológicas também são necessárias. Este protocolo apresentado neste documento prevê-se um método alternativo de imunocitoquímica em blocos de parafina.

Determinação do nível de expressão da proteína em pilhas cultivadas por imunocitoquímica em blocos de parafina

O procedimento a seguir descreve um método para o controle espacial e temporal da iniciação do tumor melanocítico na pele dorsal murina, utilizando um modelo de camundongo geneticamente projetado. Este protocolo descreve macroscópica assim como a iniciação Cutaneous microscópica da melanoma.

Controle espacial e temporal da iniciação de melanoma murino de células-tronco de melanócitos mutantes

Aprenda a selecionar regiões de interesse para tecnologias de omica espacial em amostras de tecido humano. Este protocolo automatizado melhora a robustez e reprodutibilidade em ensaios de proteômica e transcriptômica.

Perfil espacial da expressão de proteínas e RNA em tecidos: uma abordagem para ajustar a microdissecção virtual

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