Isolamento de células linfoides inatas uterinas para análise por citometria de fluxo

Este é um método para isolar células linfoides uterinas de camundongos grávidas e não grávidas. Este método pode ser usado para múltiplas aplicações a jusante, como fenotipagem FACS, classificação celular, ensaios funcionais, RNA-seq e proteômica. O protocolo aqui demonstra como fenótipo grupo 1 células linfoides inatas uterinas por citometria de fluxo.

Nosso método permite a avaliação da composição e características funcionais de diferentes subpopulações de linfócitos presentes no tecido uterino de animais gestantes e não gestantes. Este protocolo permite o isolamento de linfócitos uterinos, preservando a expressão superficial de proteína, viabilidade celular e funcionalidade. Portanto, é adequado para uma série de aplicações subsequentes.

A remoção do feto no início do experimento e a coleta de leucócitos são etapas tecnicamente desafiadoras. Como é um experimento demorado, uma atenção e foco particular são necessários uma vez que você tenha alcançado os passos de coloração de anticorpos. Para começar, transfira o tecido uteremado colhido de um c57 preto grávida de seis camundongos em uma placa de petri estéril, em seguida, usando instrumentos estéreis remover suavemente a gordura ao redor do tecido, tomando cuidado para não deixar o tecido secar.

Remova os fetos dissecando cada local de implantação com instrumentos estéreis e, em seguida, devolva o útero ao tubo original de coleta de cinco mililitros contendo um mililitro de mídia de coleta. Usando uma tesoura, pique o tecido no tubo de coleta e coloque o tubo em um banho de água de 37 graus Celsius. Em seguida, adicione três mililitros de mistura de digestão enzimática pré-aquecida ao tubo.

Incubar o tubo por 30 minutos a 37 graus Celsius com agitação para melhorar a atividade de digestão enzimática. Depois que a incubação estiver completa, o vórtice do tubo, e mantê-lo no gelo para inibir a atividade enzimática, em seguida, transfira o tecido digestivo para um tubo de centrífuga de 15 mililitros devidamente rotulado. Enxágüe o tubo de coleta de cinco mililitros com um total de 10 mililitros de solução EDTA PBS de gelo de cinco mililitros para coletar todo o tecido restante e transferi-lo para o tubo de centrífugo de 15 mililitros.

Centrifugar a amostra de tecido digerido por 10 minutos a 400 vezes G.Descarte o supernante, aperte suavemente a pelota e, em seguida, resuspended em 10 mililitros de solução EDTA PBS pré-aquecida de cinco mililitros. Para reduzir a aglomeração celular, incubar a amostra a 37 graus Celsius com agitação, seguida de vórtice no alto por 10 segundos. Para remover aglomerados celulares em tecido não associado, coloque um coador de 70 micrômetros em cima de um tubo de centrífuga de 50 mililitros estéreis, em seguida, usando o êmbolo de uma seringa estéril de um mililitro, forçar o tecido digerido através do coador para dentro do tubo.

Lave o coador várias vezes com um total de 10 mililitros de PBS frio para coletar todas as células, em seguida, gaste o tubo de centrífugo de 50 mililitros por 10 minutos a 400 vezes G.Depois de descartar o supernatante, as células linfoides inatas podem ser isoladas usando a opção A ou a opção B.Para a opção A, resuspenque a pelota em cinco mililitros de 80% isotônicos por chamada usando uma pipeta voy. Em seguida, usando a pipeta voy em velocidade lenta, sobreponha cuidadosamente oito mililitros, 40% por solução de chamada, na pelota resuspended em um tubo de centrífuga de 15 mililitros. Pipeta lentamente e continuamente, segurando o mililitro de 15 mililitros para cerca de um ângulo de 45 graus.

Sem perturbar a sobreposição, centrifugar o tubo por 20 minutos a 850 vezes G com aceleração média e quebras mínimas à temperatura ambiente. Uma vez que a centrifugação esteja completa, remova cuidadosamente o tubo da centrífuga sem perturbar as camadas por chamada. Em seguida, sem perturbar o anel de leucócitos na interface das duas soluções por chamada, use uma pipeta pasteur estéril para descartar todos, exceto 0,5 a um mililitro da camada superior por chamada.

Enquanto tenta manter a quantidade de solução por chamada sugada para dentro da pipeta ao mínimo, colete cuidadosamente o anel de leucócitos e transfira as células para um novo tubo de centrífuga de 15 mililitros rotulado. Adicione 10 mililitros de meio RPMI estéril suplementado com 10% de calor e FBS ativado às células, depois centrifugar as células por cinco minutos a 500 vezes G e quatro graus Celsius. Descarte o supernatante e prossiga para a lise de glóbulos vermelhos.

Para isolar as células usando a opção B, depois de passar o tecido digerido através do coador celular e centrifugar o resultado em suspensão celular como demonstrado anteriormente, resuspenque a pelota com oito mililitros de 35% isotônicos por chamada e meio RPMI, e transfira as células para um tubo de 15 mililitros. Centrifugar o tubo a 940 vezes G por 10 minutos em temperatura ambiente com aceleração média e quebras mínimas. Em seguida, usando um aspirador ou pipeta voy, aspire o supernatante cuidadosamente antes de reutilizar a pelota em 14 mililitros de meio RPMI complementado com 10% de calor e FBS ativado.

Centrifugar a amostra novamente por cinco minutos a 500 vezes G e quatro graus Celsius, em seguida, descartar o sobrenante por aspiração e proceder à lise de glóbulos vermelhos. Para lise os glóbulos vermelhos, resuspenque a amostra em três mililitros de uma solução de lise de glóbulos vermelhos X e incubar por três minutos à temperatura ambiente, em seguida, adicione 10 mililitros de PBS na amostra para parar a reação. Centrifugar o tubo a 400 vezes G durante cinco minutos após descartar o supernaspe, adicione outros 10 mililitros de PBS e repita a centrofugação.

Resuspenque a pelota em um mililitro de meio RPMI suplementado com FBS inativado de calor de 10%, em seguida, passe a suspensão em célula através de um coador celular estéril de 70 micrômetros. Após a contagem das células, ajuste a concentração da suspensão celular para uma a 2 milhões de células em 100 microlitres de PBS e prossiga para a análise de coloração e facs. Os ILCs do grupo uterino incluem células NK convencionais, células NK residentes em tecidos e ILCs do grupo um com suas porcentagens variando durante a vida e a gravidez.

Esses subconjuntos podem ser discriminados usando citometria de fluxo por células de gating primeiro em sua capacidade de dispersar a luz, em seguida, isolando cd único comprável 45 cd positivo três cd negativo 19 células negativas, e, em seguida, identificando ilCs do grupo um que são NK 1.1 e NKP 46 positivo. Dentro do grupo um, os EMs negativos CD49A positivos são as células NK convencionais. Cd49A células positivas ems positivas são células NK residentes em tecido.

E as células negativas do CD49 são ILCs uterinos do grupo um. A coloração de linfócitos esplênicos e uterinos com anticorpos anti NK P46 e anti NK 1.1 mostra que os linfócitos esplênicos expressam maiores quantidades de NKP 46 em sua superfície do que sua contraparte uterina. Na dissociação do tecido enzimático, os epítopos superficiais podem ser alterados dependendo das enzimas utilizadas no meio de digestão.

Por exemplo, a coloração para o receptor MHC CD49 NKG2A é ruim quando o TM liberase é usado. No entanto, a digestão com a liberase DH preserva o reconhecimento de NKG2A pelo clone de anticorpos 1611. Cerca de 6,5% dos ILCs do grupo um presentes em amostras de tecido uterino no dia da gestação 8,5 são derivados do sangue.

Contaminantes sanguíneos podem ser excluídos através da coloração intravital com anticorpos anti CD45 conjugados com fluorocromo. Ao configurar para reuniões de tempo, você deve levar em consideração que os ratos são noturnos. Portanto, eles devem ser configurado o mais tarde possível no período da tarde, pois o acasalamento ocorrerá durante a noite.

Além disso, ao selecionar fêmeas, você deve garantir que elas não tenham um septo vaginal. Normalmente fazemos análises de citometria de fluxo para olhar para muitas proteínas do lado de fora das células e dentro das células. Também fazemos extração de ácido nucleico para estudar a expressão genética, incluindo o sequenciamento do RNA.

E também conseguimos em torno de ensaios funcionais para estudar as respostas de células linfoides inatas uterinas.