Experimentos de RMN de alta pressão para detectar estados conformais de baixa mentira de proteína

Alta pressão é o método de escolha para mudar a população relativa de uma amostra conformacional de proteínas. É extremamente útil para isolar e caracterizar estados conformacionais de alta energia. Comparado com todos os métodos de perturbação, como pH ou temperatura, a perturbação da pressão é fácil de aplicar e totalmente reversível.

É também uma perturbação local, afetando principalmente regiões com cavidades de vidro ou volumes vazios. Para começar, introduza a amostra com a etiqueta de nitrogênio 15 no tubo de zircônia usando uma pipeta de vidro e garanta os assentos da amostra na parte inferior do tubo. Para evitar que a amostra se misture com o líquido de transmissão, sobreponha a amostra com 200 microliters de óleo mineral e, em seguida, encha o resto do tubo com líquido de transmissão.

Coloque um anel O de uso único em cima do tubo de zircônia e deslize o tubo para dentro da base. Em seguida, conecte o tubo à linha de corda de alta pressão e aperte a base à célula manualmente. Em seguida, aplique 14,7 metros de torque newton para evitar vazamentos com menor pressão.

Para verificar a integridade do conjunto da célula de pressão, pressurize o tubo até 300 barras fora do espectrômetro usando suporte celular e recipiente de contenção. Após 15 minutos, reinicie a pressão em uma barra e verifique se há vazamentos com uma limpeza limpa sem fiapos. Insira o tubo nãopressurizado no espectrômetro, guiando cuidadosamente a linha da corda.

Deslize o tubo para dentro do espectrômetro até que o tubo atinja a posição de sessão da amostra. Travar, shim, combinar e ajustar os canais de protium e nitrogênio e salvar os calços otimizados para o futuro. Configure espectroscopia otimizada de relaxamento transverso com espectroscopia hetero unia quântica e prossiga com a gravação de um experimento de referência nas condições atmosféricas.

Grave uma série de experimentos 2D de uma barra a 2,5 kilobars para cada 500 bares. Se as taxas precisas de dobramento ou desdobramento forem conhecidas, após cada incremento de 500 barras, deixe a amostra equilibrar por 15 a 20 minutos. Quando o ponto de inflexão da transição dobrável ou desdobramento chegar, registos adicionais para melhorar a precisão do ajuste.

Este protocolo foi usado para sondar a dependência de pressão do RRM2, o segundo motivo de reconhecimento de RNA heterogêneo da ribonucleoproteína nuclear A1. A espectroscopia otimizada de relaxamento transversal com espectroscopia de coerência única-quântica foi coletada em uma barra, 1,5 kilobars, duas kilobars e 2,5 kilobars. O RRM2 é quase completamente desdobrado dentro da faixa de 2,5 quilobar. Perfis individuais de intensidade de pressão foram ajustados de acordo com a equação mostrada aqui, para obter as mudanças correspondentes na energia livre padrão de Gibbs e volume associado à reação desdobramento.

Quando mapeados na estrutura de domínio, os resíduos com maior magnitude de variação de volume foram encontrados dentro do núcleo estrutural do domínio, enquanto aqueles com a menor magnitude de mudança de volume foram localizados principalmente nos loops de conexão entre os fios beta e a cadeia beta à hélice terminal C. Para sondar o grau de compressão e heterogeneidade conformacional do conjunto estatal dobrado, foram analisadas as mudanças químicas protium. Perfis individuais de mudanças químicas de prótio em função da pressão foram montados utilizando-se a equação mostrada, para extrair os coeficientes lineares e não lineares específicos do local.

Os resíduos com os maiores coeficientes não lineares foram encontrados principalmente no núcleo estrutural do domínio, enquanto os resíduos com os menores coeficientes não lineares foram localizados principalmente dentro de loops que ligavam os diferentes motivos estruturais. É importante configurar o tubo como um conjunto de pressão corretamente, para evitar vazamentos. Se um vazamento acontecer, a sonda provavelmente teria que ser removida para limpar qualquer vestígio de óleo mineral.