Dissecção de ovário planário para análise ultraestrutural e coloração de anticorpos
10 de setembro de 2021
Este protocolo apresenta as etapas tomadas para dissecar ovários nas planárias de água doce, Schmidtea mediterranea. Os ovários dissecados são compatíveis para imunomarcação de anticorpos e análise ultraestrutural com microscopia eletrônica de transmissão para estudar a biologia celular dos oócitos e células somáticas, fornecendo uma profundidade e qualidade de imagem que antes eram inacessíveis.
O objetivo deste método é dissecar os ovários da planária Schmidtea mediterranea para análise celular e subcelular da biologia do oócito com coloração TEM ou anticorpo. Este protocolo usa uma breve etapa de fixação para facilitar a localização e dissecção dos ovários planários, o que fornecerá profundidade e qualidade de imagem que antes eram inacessíveis. A maior luta para alguém que nunca realizou essa técnica antes será localizar os ovários após a fixação.
Familiarizar-se com a anatomia das planárias sexuais antes do experimento será útil. Prepare-se para o experimento alimentando planárias sexuais com pasta de fígado orgânica duas vezes por semana para atingir a maturidade sexual. Trate vermes sexualmente maduros com 5% de N-acetil-L-cisteína, ou NAC, em um prato em temperatura ambiente por cinco minutos.
Substitua o NAC por 10 mililitros de paraformaldeído a 4% recém-preparado e fixe os vermes por uma hora em temperatura ambiente com agitação ocasional. Inicie a dissecção 10 minutos após adicionar 4% de paraformaldeído enquanto os vermes estão sendo corrigidos. Observe a pigmentação epitelial para localizar os cordões nervosos ventrais, que aparecem como duas linhas com pigmentação mais clara que vão dos gânglios cefálicos anteriores em direção à cauda.
Localize os ovários putativos observando a pigmentação e valide sua posição. Usando duas facas cirúrgicas, faça cortes posteriores e anteriores aos ovários para remover completamente os fragmentos de vermes anterior e posterior. Use uma faca para ancorar o verme e a outra faca para a dissecação.
Limpe a faca usada para fazer os cortes. Para separar os dois ovários, corte a linha do meio do fragmento do ovário e, em seguida, vire o fragmento com o lado ventral para baixo. Use dois pares de pinças pontiagudas tipo 5-SA para descascar o tecido dorsal e expor o intestino.
Remova suavemente os ramos intestinais que ficam acima dos tecidos ventrais com a ponta da pinça ou uma escova macia para expor o ovário. Remova os tecidos circundantes para retirar o ovário. Retire os ovários e transfira-os para um tubo de 1,5 mililitro para lavar com 1 mililitro de PBS.
Os padrões de pigmentação dorsal e ventral foram usados para localizar a posição dos ovários. O excesso de tecido foi aparado passo a passo. Uma vez que o ovário foi exposto, o tecido circundante foi aparado.
Ovários contendo vários tipos de células somáticas foram usados para análise ultraestrutural e coloração por imunofluorescência. Os ovários dissecados permitem imagens de alta qualidade da anatomia celular e subcelular dos oócitos. Este procedimento deve permitir que experimentos de interferência de RNA examinem as regulações moleculares da biologia do oócito.
Essa técnica levou à descoberta de um novo fenômeno nos oócitos de platelmintos em que o envelope nuclear se decompõe em vesículas encapsulando proteínas nucleares em vez de permanecer intacto, também conhecido como mitose fechada, ou quebrando em pedaços, também conhecido como mitose aberta.
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Visão Geral
Este protocolo descreve a dissecação de ovários no planário de água doce Schmidtea mediterranea, com o objetivo de permitir a análise celular e subcelular da biologia dos oócitos. O método melhora a qualidade e a profundidade da imagem por meio de técnicas como microscopia eletrônica de transmissão (TEM) e imunomarcação com anticorpos.
Componentes Principais do Estudo
Área de Pesquisa
- Biologia celular
- Análise de ovócitos
- Biologia de planárias
Contexto
- A anatomia de planárias sexuais é fundamental para uma dissecação eficaz.
- Alimentar as planárias com pasta orgânica de fígado promove a maturidade sexual.
- Os ovários são localizados com base nos padrões de pigmentação epitelial.
Métodos Utilizados
- Métodos de dissecação cirúrgica
- Planária de água doce Schmidtea mediterranea
- Microscopia eletrônica de transmissão (TEM) e coloração por imunofluorescência
Resultados Principais
- Localização e dissecção eficientes de ovários de planárias sexuais.
- Imagem de alta qualidade de estruturas celulares e tipos de células somáticas.
- O método possibilita experimentos de interferência de RNA para estudar regulações moleculares.
Conclusões
- Este estudo fornece uma técnica inovadora para a análise de células reprodutivas em planárias.
- Ele aprofunda o entendimento da biologia dos ovócitos e apoia futuros estudos genéticos.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
O acesso direto aos ovários intactos de planárias permite a análise de alta resolução do desenvolvimento das células germinativas, apoiando a redução de riscos mecanicistas na fase inicial de descoberta. Este protocolo facilita a obtenção de imagens quantitativas e a investigação molecular da biologia dos ovócitos, aumentando a confiança preditiva em estudos da linhagem germinativa. A abordagem está apta a contribuir para a validação de alvos e a genômica funcional em fluxos de trabalho de biologia reprodutiva.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvos
- Permite a investigação precisa do desenvolvimento das células germinativas e dos processos meióticos.
- Permite a validação funcional de perturbações gênicas por meio de interferência de RNA em ovócitos.
- Melhora a clareza mecanicista na seleção e redução de riscos de alvos reprodutivos.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Fornece preparação padronizada de ovários intactos para análises posteriores de imagem e ensaios baseados em anticorpos.
- Facilita a análise quantitativa reprodutível de estruturas celulares e subcelulares.
- Permite avaliação robusta da função gênica sob condições experimentais controladas.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha-se com modelos relevantes para a doença no estudo da epigenética germinativa e da arquitetura celular.
- Apoia a continuidade desde a descoberta até a validação pré-clínica de alvos reprodutivos.
- Oferece insights preditivos sobre mecanismos conservados da biologia do ovócito.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este protocolo de dissecção integra-se nas fases iniciais de descoberta e validação de alvos, permitindo análises ultraestruturais e de imuno-histoquímica posteriores. Ele suporta fluxos de trabalho desde a verificação de hipóteses até a avaliação da função gênica em sistemas germinativos.
- Biologia do Descobrimento: Facilita estudos baseados em hipóteses sobre a especificação das células germinativas e a regulação meiótica.
- Triagem: Fornece tecido ovariano pronto para ensaios, destinado à imagem quantitativa e à triagem com anticorpos.
- Análises: Fornece leituras celulares e subcelulares de alta resolução para análise comparativa.
- Pesquisa Translacional: Conecta descobertas básicas com a avaliação pré-clínica de alvos reprodutivos.
- Reutilização Empresarial: Estabelece um protocolo reutilizável para diversos estudos da linhagem germinativa e de perturbação gênica.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a ambiguidade na validação de alvos em células germinativas.
- Valor Operacional: Padroniza os fluxos de trabalho de dissecação e imagem de ovário para garantir reprodutibilidade.
- Valor Estratégico: Permite decisões informadas de prosseguir ou não prosseguir em portfólios de biologia reprodutiva.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco de alvos na linhagem germinativa e estudos de função gênica.
Considerações de Implementação
- Requer experiência em anatomia de planárias e técnicas de dissecação.
- Exige acesso à infraestrutura de microscopia eletrônica de transmissão e imunomarcação.
- Exige padronização entre equipes para preparação de tecidos e obtenção de imagens reprodutíveis.
- Pode ser necessária adaptação para outros sistemas modelo de invertebrados ou linhagem germinativa.
- Limitado pelo pequeno número e localização profunda dos ovócitos de planárias.
