Name: Imagem pericínica cerebral de cálcio e hemodinâmica em camundongos transgênicos em Vivo (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 22 s
Description: Aprenda a imagem de cálcio em perícitos envoltórios cerebrais e hemodinâmica em camundongos transgênicos Acta2-RCaMP 1.07. Este protocolo de imagem de dois fótons permite estudar dinâmica de cálcio e fluxo sanguíneo em células murais.

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J. Meza é apoiado por bolsas da Mitacs e Research Manitoba. O financiamento para este trabalho foi fornecido pelos Institutos Canadenses de Pesquisa em Saúde, Pesquisa manitoba, Manitoba Medical Service Foundation, financiamento inicial da Universidade de Manitoba e Brain Canada através do Canada Brain Research Fund, com o apoio financeiro da Health Canada e da Azrieli Foundation. As opiniões aqui expressas não representam necessariamente as opiniões do Ministro da Saúde ou do Governo do Canadá.

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</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

O presente método fornece detalhes sobre a injeção da veia da cauda do rato com um cateter, aquisição de imagens de microscópio de dois fótons para pilhas de profundidade, filmes de sinalização de cálcio celular, criação de kymografos hemodinâmicos e análise de cálcio e hemodinâmica com nossos algoritmos de processamento de imagem17 (Figura 1). Existem várias vantagens para essas técnicas que melhoram o resultado da imagem in vivo e reduzem o tempo, os recursos e o estresse animal durante a sessão. Primeiro, o uso de um cateter para injeção de veias traseiras fornece mais controle sobre a agulha, a seringa e a quantidade de substância injetada na circulação do camundongo. Além disso, evita a injeção de corante no tecido da cauda, economizando reagentes caros. Em segundo lugar, usamos camundongos transgênicos que expressam sensores de cálcio geneticamente codificados em pericítes ensheathing e demonstram como localizá-los dentro da rede vascular cerebral com uma pilha z de profundidade, o que facilita a identificação e realocação de células em sessões de imagem subsequentes a longo prazo. Este é um fator importante nos estudos pericíte e garante classificação celular adequada6,7. Em terceiro lugar, fornecemos nossos parâmetros para a coleta de filmes de cálcio e dados de varredura de linha hemodinâmica que são um bom ponto de partida para medir sinais celulares dinâmicos. Finalmente, apresentamos nossos algoritmos de processamento de imagem17, uma caixa de ferramentas abrangente de processamento de imagem que contém múltiplas abordagens para pré-processamento de imagem (como descompramento espectral), análise de imagem de cálcio e análise hemodinâmica (diâmetro, velocidade, etc.). Esses algoritmos podem gerar parcelas para uma visualização rápida e fácil dos dados, minimizando o nível de experiência do usuário necessário para analisar resultados. Além disso, ele pode ser automatizado com algumas linhas de código para processar rapidamente vários conjuntos de dados com os mesmos parâmetros. Isso pode potencialmente melhorar a visualização de dados e o investimento temporal do pesquisador.
A chave para coletar bons dados de imagem de cálcio é ajustar a potência do laser e as configurações de PMT para aquisição clara de sinal de fluorescência, mas também coletar dados a uma taxa de quadros suficiente para capturar todo o evento de cálcio. Os dados deste protocolo foram adquiridos a 10-11 quadros por segundo, o que captura as oscilações mais lentas de cálcio em pericytes ensheathing. Há também várias etapas durante a análise que podem melhorar o resultado da análise. Em primeiro lugar, o descompreamento espectral é benéfico se houver sobreposição significativa entre os espectros de emissões de fluoroforos(Figura 2). Fluoresceíno-dextran foi utilizado neste protocolo por ser um conjugado dextran econômico e comercialmente disponível que é comumente usado para medições hemodinâmicas5. A desmixagem espectral ajuda a limpar os dados para maior detecção de sinais de cálcio, mas fluoroforos alternativos com espectros de emissões mais estreitos também poderiam ser usados. Em segundo lugar, selecionar manualmente estruturas celulares como ROIs (Figura 3) é útil para classificar eventos de cálcio em diferentes regiões subcelulares, como os ramos soma ou processo. A seleção de ROI baseada em atividade (Figura 4)16 fornece mais informações espaciais e temporais sobre eventos individuais de cálcio. Isso pode ser útil ao determinar a frequência de eventos de cálcio em uma determinada área ou a propagação de eventos para outras áreas celulares. O uso de software de programação para analisar dados de imagem pode economizar horas de tempo aos pesquisadores quando os dados são processados em lote, mas requer algum investimento inicial para ajustar os parâmetros para resultados ideais. Os fatores mais importantes são o tamanho esperado (em μm2) da região ativa, bem como a duração do sinal (tempo mínimo de sinal e tempo máximo de sinal devem ser definidos). Os pesquisadores devem examinar alguns exemplos de filmes da série T primeiro para determinar melhor quais parâmetros se encaixam em seus dados. Finalmente, dados de baixa qualidade adquiridos no microscópio podem dificultar muito a análise de cálcio e hemodinâmica(Figura 6). Portanto, deve-se tomar cuidado para otimizar as configurações de aquisição de microscópio no início. Com esses fatores em mente, este protocolo que pode ser adaptado para se adequar à imagem de cálcio ou análise de outros sinais celulares dinâmicos (por exemplo, sódio fluorescente, potássio, metabólito ou flutuações de tensão) em outros tecidos ou tipos de células.
Há várias limitações para este protocolo. Primeiro, os dados são coletados sob anestesia, que afeta a atividade cerebral e pode afetar o fluxo sanguíneo. Imagens semelhantes podem ser feitas em camundongos acordados que são treinados para aceitar a fixação da cabeça para resultados mais fisiológicos. Além disso, é importante lembrar que coletamos imagens bidimensionais de uma célula tridimensional e vaso sanguíneo in vivo. Portanto, só podemos capturar uma facção dos eventos de cálcio dentro dessas células ou o fluxo sanguíneo em uma única seção do vaso sanguíneo de cada vez.
Outra limitação a notar é que a imagem de cálcio de dois fótons é sensível aos artefatos de movimento, onde o movimento dentro e fora do plano focal pode ser confundido com flutuações de cálcio. Este protocolo foi realizado sob anestesia, que limita a circulação do animal; no entanto, os artefatos de movimento podem ser introduzidos pela frequência respiratória do camundongo, frequência cardíaca, possível inchaço tecidual, e no caso de pericytes ensheathing, contração do vaso ou vasomotion 4,6,18,19. Artefatos de movimento podem ser mitigados por várias estratégias. Os pacotes de processamento de imagem usados neste protocolo incluem uma etapa opcional de correção de movimento, que utiliza um mecanismo de convolução 2D para alinhar as imagens dentro da série T com base na vasculatura visível13,17. Quadros com alterações significativas no plano focal são identificados por este algoritmo e podem ser excluídos da análise. Além disso, é possível utilizar estratégias estatísticas dentro dos pacotes de processamento de imagens, como um escore Z ao gerar os traços de fluorescência para normalizar as flutuações de cálcio induzidas pelo movimento20. A abordagem mais robusta para explicar artefatos de movimento em imagens de dois fótons é combinar a expressão de dois indicadores fluorescentes dentro da mesma célula, como um indicador de cálcio (por exemplo, GCaMP) e um repórter fluorescente (por exemplo, mCherry) que é independente do cálcio. As flutuações no repórter fluorescente podem então ser atribuídas ao movimento e são subtraídas do sinal indicador de cálcio para normalizar artefatos de movimento.
O objetivo deste protocolo é fornecer uma compreensão clara de como coletar dados ideais de imagem de cálcio e fluxo sanguíneo in vivo e apresentar novos métodos e ferramentas de análise que os pesquisadores possam implementar para melhorar seus resultados. Essas técnicas podem ser aplicadas para estudar o papel de diferentes populações de pericítes no controle do fluxo sanguíneo ou em diferentes estados de doenças cerebrais. Esses parâmetros de imagem também podem ser usados para estudar o cálcio e o fluxo sanguíneo em outros tipos de células e sistemas de órgãos e princípios semelhantes se aplicam a outras técnicas dinâmicas de imagem que são possíveis por outros sensores geneticamente codificados, além do cálcio.

A vasculatura do sistema nervoso central consiste em arterioles penetrantes, capilares e venules ascendentes. Dentro dessa rede, células mural como células musculares lisas vasculares encase arterioles e pericítos estendem processos celulares ao longo dos primeiros ramos arteriolos e capilares1. Os pericítos parecem ter vários papéis dentro do cérebro, incluindo a manutenção da barreira hemencefálica1,2, migração e motilidade3, propriedades potenciais de células-tronco, e a regulação do fluxo sanguíneo cerebral4,5,6. Muitos dos papéis funcionais dos pericítos têm sido ligados a flutuações no cálcio intracelular que podem regular a dilatação ou contração dessas células4,5,6.
Vários estudos recentes estabeleceram critérios para identificar diferentes tipos de pericítos cerebrais7,8. As células mural dentro dos primeiros 4 ramos de arterioles penetrantes são pericílitos envolventes com base em sua expressão da proteína contratil α-suave actina muscular (αSMA) e sua somata saliente e ovoid com processos que envolvem vasos7,8,9. Para visualizar flutuações de cálcio em pericytes ensheathing, este protocolo utiliza uma nova linha de mouse transgênico, Acta2-RCaMP1.07, também conhecida como Tg(RP23-370F21-RCaMP1.07)B3-3Mik/J10. Estes camundongos expressam o indicador de cálcio geneticamente codificado vermelho, RCaMP1.07, em células expressas αSMA (células musculares lisas vasculares e pericítos ensheathing). Colônias de reprodução são mantidas cruzando animais não-carga com hemizygotes. RCaMP1.07 é uma proteína fluorescente vermelha com domínio de ligação de calmodulina, que aumenta a fluorescência ao se ligar ao cálcio intracelular10,11. Este protocolo descreve os passos para a imagem combinada de cálcio de pericítes e medidas de fluxo sanguíneo por duas microscopia de fótons, incluindo procedimentos para injeção de veias traseiras de corantes fluorescentes, aquisição de imagens de microscópio em camundongos anestesiados e análise de dados com plataformas de programação(Figura 1). Essas técnicas são úteis para abordar questões sobre fisiologia celular mural, mas podem ser adaptadas para estudar transitórios de cálcio em qualquer tipo de célula no cérebro ou em outro sistema de órgãos.
Uma fêmea de 10 meses de idade Acta2-RCaMP1.07 foi usada para o experimento apresentado neste artigo. O camundongo foi submetido a cirurgia para janela craniana crônica e pós-implantação da cabeça dois meses antes. Os detalhes do protocolo cirúrgico são discutidos em estudos anteriores12,13 e procedimentos semelhantes foram realizados em outros protocolos publicados anteriormente14,15. A vasculatura é rotulada com fluoresceína-Dextran verde (70.000 MW, solução aniônica, 2,5% w/v) injetada por via intravenosa. Este corante é econômico e prontamente disponível a partir de fontes comerciais, mas tem um espectro de emissões mais amplo que pode se sobrepor à emissão de RCaMP e sangrar durante a aquisição de imagens de microscópio. As etapas para a desmragem espectral estão descritas na Seção 4 abaixo para contornar isso, mas outros corantes verdes com espectros de emissão mais estreitos, como os baseados no EGFP, também podem ser usados.

<table><tbody><tr><td>Acta2-RCaMP1.07</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>28345</td><td>No protocolo de vídeo, o modelo animal utilizado é uma fêmea de camundongo de 10 meses e 1 dia de idade.</td></tr><tr><td>Aplicadores (Regulares)</td><td>Bisco</td><td>X-80250P</td><td></td></tr><tr><td>Pacote BioFormats para MATLAB</td><td>NA</td><td>NA NA</td><td>Denominado neste protocolo como "pacotes de processamento de imagem".&nbsp; Disponível em: https://docs.openmicroscopy.org/bio-formats/</td></tr> <tr><td>CHIPS MATLAB toolbox</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Denomitaded neste protocolo como "algoritmos de processamento de imagem". Barrett MJP, Ferrari KD, Stobart JL, Holub M, Weber B. CHIPS: uma caixa de ferramentas extensível para análise de imagens celulares e hemodinâmicas de dois fótons. Neuroinformática. 2018; 16(1):145-147. DOI:10.1007/s12021-017-9344-y. Disponível em: https://github.com/EIN-lab/CHIPS</td></tr><tr><td>Clear Ultrasound Gel, viscosidade média</td><td>HealthCare Plus</td><td>UGC250</td><td></td></tr><tr><td>Dextran, fluoresceína, 70.000 MW, aniônico</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D1823</td><td></td></tr><tr><td>Dextran, Texas Red, 70.000 MW, neutro</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D1830</td><td></td></tr><tr><td>Eye Lube Plus</td><td>Optixcare</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>FIJI</td><td>Imagem J</td><td>NA</td><td>Denominado neste protocolo como "software processador de imagem".&nbsp; Disponível em: https://imagej.net/Fiji/Downloads</td></tr><tr><td>GCaMP6sfl/fl</td><td>The Jackson Laboratory Head</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Post plataforma de fixação</td><td>Universidade de Zurique</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Cetamina (Narketan 100 mg/mL)</td><td>Vetoquinol</td><td>440893</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB R2020b</td><td></td><td>NA</td><td>Denominado neste protocolo como "plataforma de programação". Disponível em: https://www.mathworks.com/downloads/</td></tr> <tr><td>Agulha 0.3mmx25mm</td><td>BD PrecisionGlide</td><td>305128</td><td></td></tr><tr><td>Objetiva XLUMPLFLN20XW</td><td>Olympus</td><td>NA</td><td>https://www.olympus-lifescience.com/en/objectives/lumplfln-w/</td></tr> <tr><td>PDGFR&beta;-CreERT2</td> Tubo de Polietileno <td>30201</td><td></td><td>do Laboratório Jackson</td></tr><tr><td>, PE10 I.D. 28mm (0.11") O.D. 61mm (.024&rdquo;)</td>BD <td>Intramedic</td><td>427401</td><td></td></tr><tr><td>Prairie View</td><td>Microscopia de Fluorescência Bruker</td><td>NA</td><td>https://www.bruker.com/en/products-and-solutions/fluorescence-microscopy/multiphoton-microscopes/ultima-in-vitro.html</td></tr><tr><td>Ultima Microscópio Multifotônico In Vitro</td><td>Bruker Microscopia de Fluorescência</td><td>NA</td><td>https://www.bruker.com/en/products-and-solutions/fluorescence-microscopy/multiphoton-microscopes/ultima-in-vitro.html</td></tr><tr><td>Aquecedor sob o tanque</td><td>Reptitherm UTH</td><td>E169064</td><td></td></tr><tr><td>xilazina (Rompun 20 mg / mL)</td><td>Bayer HealthCare</td><td>2169592</td><td></td></tr></tbody></table>

imagem pericínica cerebral de cálcio e hemodinâmica em camundongos transgênicos em vivo

Brain Pericyte Calcium and Hemodynamic Imaging in Transgenic Mice In Vivo

Os recentes avanços na biologia proteica e na genética dos camundongos tornaram possível medir flutuações intracelulares de cálcio das células cerebrais in vivo e correlacionar isso com a hemodinâmica local. Este protocolo utiliza camundongos transgênicos que foram preparados com uma janela craniana crônica e expressam o indicador de cálcio geneticamente codificado, RCaMP1.07, sob o promotor de actina muscular α-suave para rotular especificamente células mural, como células musculares lisas vasculares e pericítos ensheathing. São delineadas etapas sobre como preparar um cateter de veia da cauda para injeção intravenosa de corantes fluorescentes para rastrear o fluxo sanguíneo, bem como como medir o cálcio pericítil cerebral e hemodinâmica do vaso sanguíneo local (diâmetro, velocidade de glóbulos vermelhos, etc.) por duas microscopia de fótons in vivo através da janela craniana em camundongos anesthetizados cetamina/xilazina. Finalmente, são fornecidos detalhes para a análise de flutuações de cálcio e filmes de fluxo sanguíneo através dos algoritmos de processamento de imagem desenvolvidos por Barrett et al. 2018, com ênfase em como esses processos podem ser adaptados a outros dados de imagem celular.

Fluoresceíno-dextran possui um amplo espectro de emissões que pode sangrar até o canal vermelho, impactando a detecção de RCaMP em pericytes ensheathing(Figura 2A). A desmontagem espectral após a aquisição de dados no programa de software reduz o sangramento de fluoresceína através(Figura 2B, menor), aumentando a detecção de sinal de cálcio em etapas subsequentes de análise.
A análise de cálcio com os algoritmos de processamento de imagem utilizados neste protocolo permite várias abordagens diferentes para identificar ROIs e flutuações intracelulares de cálcio (ou seja, sinais de cálcio). A seleção de estruturas celulares manualmente permite a detecção de flutuações de cálcio dentro dessas regiões (Figura 3A), incluindo diferentes tipos de picos de sinal, como picos únicos e vários picos, após os traços de cálcio normalizados serem filtrados por baixo passe e passe de banda(Figura 3B). Além disso, os ROIs são identificados por agrupar pixels ativos onde a intensidade da fluorescência muda ao longo do tempo usando algoritmos de processamento de imagem desenvolvidos por Ellefsen et al. 201416 e Barrett et al. 201817 (Figura 4). Isso pode ser aplicado a qualquer sinal celular dinâmico ajustando o tempo, limiar e parâmetros espaciais para abranger o tamanho e a forma esperados do sinal. A diminuição do limiar de identificação de sinal encontra mais regiões de interesse(Figura 4B).
Kymogramas hemodinâmicos brilhantes e claros podem ser analisados para medir o diâmetro e a velocidade de RBC em vasos sanguíneos próximos a pericítos ensheathing(Figura 5A,B). O diâmetro é calculado a partir da largura total a metade do máximo da fluorescência (Figura 5C). A velocidade RBC é aproximada das listras feitas de RBCs não rotuladas, onde o ângulo é entrada em uma transformação radon para calcular a velocidade, fluxo (células/s) e densidade linear (células/mm; Figura 5D). Kymographs de má qualidade onde há saturação de fluorescência, má relação sinal para ruído ou movimento do campo de imagem(Figura 6A) cria parcelas não confiáveis com pontos de erro (cruzes vermelhas) onde os dados não podem ser determinados(Figura 6B, C). A qualidade dos dados adquiridos é fundamental para um bom resultado e seguir as etapas descritas neste protocolo garante bons resultados.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62725/62725fig01.jpg"> Figura 1. Resumo do protocolo. O protocolo apresenta os passos para adquirir e analisar imagens fluorescentes de cálcio de pericytes e dados de fluxo sanguíneo de vasos sanguíneos próximos em camundongos anestesiados. O protocolo é dividido em 4 etapas. 1) Preparação do procedimento: configuração de equipamentos e preparação de cateter; 2) Injeção da veia da cauda; 3) Aquisição de dados por microscopia de dois fótons; 4) Análise de dados com algoritmos de processamento de imagens. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62725/62725fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62725/62725fig02.jpg"> Figura 2. Descompra de fluoroforos espectrais. A) Imagem média representativa da pericyte ensheathing RCaMP e fluoresceína-dextran rotulada vaso sanguíneo a partir de uma aquisição da série T. Barra de escala= 10 μm.B) Superior: Ao considerar canais individuais, o sangramento do Canal 2 é aparente no Canal 1 (à esquerda). Mais baixo: Após a desmlicagem espectral, o sangramento é reduzido e o sinal de RCaMP é mais proeminente na estrutura pericyte. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62725/62725fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62725/62725fig03.jpg"> Figura 3. ROIs selecionados à mão e traços otimizados de cálcio. A) Regiões de interesse selecionadas no software de processamento de imagens usadas (formas arco-íris) podem ser usadas para identificar traços de sinal de cálcio. B) Os picos de sinal a partir de traços normalizados são identificados por passe baixo e passe de banda filtrando os dados. Definimos o limiar de sinal como 3 vezes o desvio padrão do período de linha de base (primeiros 30 quadros) e quaisquer picos acima desse limiar foram considerados um sinal (traço inferior). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62725/62725fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62725/62725fig04.jpg"> Figura 4. ROIs automatizados e baseados em atividade para análise de cálcio. Os mesmos dados foram analisados com um limiar de 7 vezes o desvio padrão da linha de base (A) e 3 vezes o desvio padrão da linha de base (B). A diminuição do limiar para identificação de pixels ativos encontra mais ROIs (B) e picos de sinal (gráfico de tortas) dentro dos pericílitos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62725/62725fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62725/62725fig05.jpg"> Figura 5. Medições hemodinâmicas de kymógrafo. A) Exemplo de varredura de linha através da nave. B) Exemplo de kymógrafos bem definidos para diâmetro (esquerda) e velocidade (direita). As listras negras dentro da faixa direita de fluorescência correspondem a RBCs.C) Análise de diâmetro com flutuações claras de vasomotion. D) Análise de velocidade com gráficos para eixo Y= fluxo RBC (células/s), densidade de linha (células/mm), velocidade (mm/s) e ângulo de raia (grau), relação sinal/ruído (unidades arbitrárias, a.u.), eixo X=tempo (seg). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62725/62725fig05large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62725/62725fig06.jpg"> Figura 6. Representação de medidas hemodinâmicas de má qualidade. A) Exemplos de kymogramas de má qualidade com saturação de fluorescência, má relação sinal/ruído ou movimento do campo de imagem durante a aquisição. B e C) Parcelas semelhantes à Figura 7 de dados de diâmetro e velocidade que possuem pontos de erro (pontos vermelhos) devido à má qualidade dos kymógrafos. (imagem E, eixo Y=Diâmetro (μm), eixo X=tempo (seg); imagem F, eixo Y= fluxo RBC (células/s), densidade de linha (células/mm), velocidade (mm/s) e ângulo de raia (grau), relação sinal/ruído (a.u.), eixo X=tempo (seg). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62725/62725fig06large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Este protocolo apresenta etapas para adquirir e analisar imagens fluorescentes de cálcio de pericytes e dados de fluxo sanguíneo de vasos sanguíneos próximos em camundongos anestesiados. Essas técnicas são úteis para estudos de fisiologia celular mural e podem ser adaptadas para investigar transitórios de cálcio em qualquer tipo de célula.

Imagem pericínica cerebral de cálcio e hemodinâmica em camundongos transgênicos em Vivo

Recent advances in protein biology and mouse genetics have made it possible to measure intracellular calcium fluctuations of brain cells in vivo and to ...

A vasculatura cerebral é uma complexa rede de arterias penetrantes, capilares e venules ascendentes. Estes vasos são envoltos por células mural, como pericytes ensheathing, que expressam actina muscular suave alfa, e são encontrados dentro dos quatro primeiros ramos de arterials penetrantes. Utilizamos acta2-RCaMP 1.07 camundongos transgênicos, para visualizar transitórios de cálcio nessas células, através da expressão do indicador de cálcio geneticamente codificado RCaMP.O cálcio desempenha um papel forte na contração dessas células e no controle do fluxo sanguíneo. Pericytes capilares são encontrados mais a jusante na rede vascular e podem ser rotulados em outros modelos transgênicos. No entanto, focamos em pericytes ensheathing neste método.Nossos camundongos foram implantados cirurgicamente com uma janela craniana crônica que permite acesso à vasculatura cerebral para imagem. Aqui, descrevemos os passos necessários de preparação e a injeção da veia da cauda seguidas pelos dois métodos de imagem de fótons e analíticos necessários para a aquisição de dados de cálcio pericíte e informações sobre o fluxo sanguíneo em animais anestesiados. Os seguintes itens são necessários para uma injeção de cateter de veias da cauda: seringas de insulina, um pedaço de 15 centímetros de tubo PE10, agulhas de calibre 30, gaze, soro fisiológico, fórceps, corante de fluoresceína verde, alicate e tesoura.Também temos uma agulha com anestesia de cetamina Xylazine que injetaremos antes da imagem, pois é melhor que isoflurane para medições de fluxo sanguíneo. Usando o alicate, quebre uma agulha calibre 30 do cubo. Insira cuidadosamente a agulha na extremidade do pedaço de tubo PE10 preso a uma seringa salina cheia.Este é o cateter para injeção. Anestesiar um rato com isoflurane e aplicar gel I-Lube. Coloque um campo de luvas com água morna na cauda para dilatar a veia lateral.Depois de limpar a cauda com etanol, insira a agulha na veia e injete suavemente soro fisiológico através do cateter para garantir que a agulha seja colocada corretamente. Troque a seringa no cateter por uma seringa cheia de corante de fluoresceína dextran. Injete lentamente o corante para garantir que não haja bolhas no tubo.Substitua a seringa dextran pela seringa salina e enxágue a tubulação até que não haja corante no tubo. Retire a agulha e pressione com gaze. Injete anestesia de cetamina Xylazine para imagem.Com a cabeça do mouse fixada em uma almofada de aquecimento, limpe a janela craniana com aplicadores dentários. Aplique gel de ultrassom na janela e foque através do objetivo do microscópio de dois fótons. Para duas imagens de fótons, usamos um microscópio com laser de safira de titânio afinado para fluorescentes, excitação e tubos fotomultiplier para detecção de emissões.No software do microscópio, defina o comprimento de onda para 990 nanômetros para excitar tanto rcamp quanto fluoresceína dextran. Em seguida, ajuste a potência do laser ajustando a tensão celular do pockel e a sensibilidade do detector PMT. Podem ser vistas varreduras ao vivo com esses parâmetros e maior resolução, células mural positivas RCaMP e o plasma de sangue fluorescentemente rotulado.Recomenda-se a aquisição de uma pilha de profundidade para localizar adequadamente os pericítos na rede vascular. Quando estiver focado no topo do tecido perto dos vasos po, coloque isso como o ponto zero e o topo da pilha da série Zed, em seguida, concentre-se no tecido para a profundidade desejada e ajuste isso como a parte inferior da pilha. A potência do laser deve ser ajustada para aumentar à medida que o microscópio se move mais fundo através da pilha.Abrindo a série Zed no software de processamento de imagens, mescla os dois canais como imagens coloridas e digitalize através da pilha para pericytes e vasos sanguíneos de interesse. Selecione regiões de interesse que contenham pericítos e salve as posições para ajudar a localizar esses pontos novamente em sessões futuras de imagem. Para coletar e mover um evento de cálcio pericíte, aumente a taxa de quadros de aquisição para mais de 10 quadros por segundo.Defina a duração da imagem para 60 segundos e atualize o caminho de salvamento com um nome de arquivo único. Zoom opticamente no vaso para dar conta da resolução mais baixa e para obter uma visão mais próxima do pericyte. Adquira a série T.Para medir o diâmetro do vaso sanguíneo e a velocidade dos glóbulos vermelhos, selecione a varredura de linha para iniciar uma varredura unidimensional com o microscópio. Primeiro defina a duração da varredura em milissegundos. Em seguida, desenhe uma linha que bissecte o navio de interesse e se move paralelamente ao longo da nave.Isso vai gerar um kymograph do diâmetro do vaso à esquerda e listras dos glóbulos vermelhos movendo-se através do vaso à direita. Consulte a tabela de materiais para obter uma lista completa de programas e pacotes utilizados neste protocolo. Primeiras regiões de interesse selecionadas manualmente no software de processamento de imagens.Carregue o arquivo da série T, pegue a média da pilha e faça uma imagem colorida. Selecione a ferramenta polígono e delineie as estruturas de pericítos de ensheathing visíveis, como soma e processos. Dê a cada região de interesse um nome único e salve-os como uma pasta zip que pode ser carregada mais tarde no software de programação.Abra o software de programação e certifique-se de que as pastas dos pacotes de processamento de imagens estejam no caminho. Importe a série T de cálcio para o software de programação e defina o que está em cada canal. Neste caso, é um sinal celular no canal um e plasma de sangue no canal dois.Plote os dados como um filme dentro do software de programação para facilitar a visualização. Para remover fluorescentes verdes do fluoresceína dextran que sangra através do canal RCaMP vermelho, un-mixe os canais no pacote de processamento de imagem. Primeiro selecione uma região que contenha apenas fluoróforo 1, RCaMP neste caso.Segunda escolha uma região que só contém fluoróforo 2, fluoresceína no plasma. Por fim, selecione uma área de fundo que não tenha fluoróforo. Isso gera uma matriz de contribuição espectral, que é aplicada a cada pixel em cada canal.Melhora significativamente a localização do sinal RCaMP, o que aumentará a detecção de eventos de cálcio nessas estruturas. Existem várias maneiras pelas quais os dados de imagem de cálcio podem ser analisados dentro dos pacotes de processamento de imagens. Primeiro execute a análise de sinalização celular no filme de cálcio não misturado e carregue as regiões de interesse da pasta zip que foram selecionadas dos pericítes manualmente.Defina o fator escala para um porque as regiões não precisam ser redimensionadas. Após o processamento, gere parcelas de cada ROY e os traços de cálcio normalizados em cores diferentes. Se o código não detectar a maioria dos eventos de cálcio nos traços individuais, modifique os parâmetros incorporados dentro da caixa de otimização, como a diminuição do limiar para o passe curto de dados filtrados para três vezes o desvio padrão do período de linha de base, que são os primeiros 30 quadros da série T.Para detectar e classificar os sinais, o traço de cálcio normalizado é filtrado por passagem longa e passagem de banda, o que ajuda a suavizar os dados para amplitude e com estimativas, mas também para determinar se os sinais são picos únicos, vários picos ou platôs. Exaú-los como um arquivo CSV para análise estatística posterior. Execute a análise de sinalização celular uma segunda vez no filme de cálcio não misturado e selecione a região automatizada de identificação de juros com base na atividade e mudança de fluorescentes em três dimensões, X, Y e tempo.Traçar os resultados do processo para visualizar as regiões de interesse identificadas são cores diferentes. Se o algoritmo não detectar ROYs claramente visíveis olho no filme, modifique os parâmetros incorporados, como o aumento do filtro gaussiano que suaviza os dados a tempo e diminui o limiar para encontrar ROYs para três vezes o desvio padrão da linha de base. Plote os ROYs como um filme para visualização posterior.Exaú-los como um arquivo CSV para análise estatística posterior. Importe o arquivo de dados kymograph de linha para o software de programação e defina o que está em cada canal. Execute a função de análise de diâmetro na varredura de linha, que abre uma caixa para selecionar a área que corresponde ao diâmetro no kymograph.Desenhe uma caixa fora dos limites fluorescentes do kymógrafo, que corresponde ao diâmetro do vaso. Processe essa classe de dados para medir a largura total em metade máxima para o diâmetro do vaso e gerar um lote. Em seguida, execute a taxa de velocidade na análise de transformação e desenhe uma caixa dentro da borda dos fluorescentes de kymograph.Processe essa classe de dados para calcular a velocidade, o fluxo e a densidade linear dos glóbulos vermelhos. Saída os resultados do fluxo sanguíneo como um arquivo CSV para análise mais aprofundada. Selecionar estruturas celulares manualmente permite a detecção de flutuações de cálcio dentro dessas regiões, incluindo diferentes tipos de picos de sinal, como picos únicos e vários picos, depois que os traços de cálcio normalizados são baixos passes e passagem de banda filtrados.Além disso, regiões de interesse são identificadas pelo agrupamento de pixels ativos onde a intensidade dos fluorescentes muda ao longo do tempo usando algoritmos de processamento de imagem. Isso pode ser aplicado a qualquer sinal celular dinâmico ajustando o tempo, limiar e parâmetros espaciais para abranger o tamanho e a forma esperados do sinal. A diminuição do limite para identificação de sinal encontra mais regiões de interesse.Kymographs hemodinâmicos claros são analisados para medir o diâmetro e a velocidade dos glóbulos vermelhos em vasos sanguíneos perto de pericytes ensheathing. O diâmetro é calculado a partir da largura total na metade do máximo das fluorescentes. A velocidade dos glóbulos vermelhos é aproximada das listras feitas de glóbulos vermelhos sem rótulo, onde o ângulo é entrada em uma transformação de radon para calcular a velocidade.Kymographs de má qualidade, onde há saturação fluorescente, má relação sinal/ruído, ou movimento do campo de imagem, cria parcelas não confiáveis com pontos de erro, indicados como cruzes vermelhas, onde os dados não podem ser determinados. A qualidade dos dados adquiridos é fundamental para um bom resultado e seguir as etapas descritas neste protocolo garante bons resultados. Neste vídeo, descrevemos o procedimento para imagens combinadas de cálcio de pericítos ensheathing cerebral e medidas de fluxo sanguíneo por duas microscopia de fótons.Essas técnicas são úteis para abordar questões sobre fisiologia celular mural e localização dentro da rede vascular cerebral, mas podem ser adaptadas para estudar transitórios de cálcio em qualquer tipo de célula no cérebro ou em outro sistema de órgãos.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

A preparação do tecido é descrito para visualização e manipulação experimental da microcirculação vida. Anestesiados em camundongos machos, o fino, altamente vascularizado do músculo cremaster está preparado para microscopia intravital para estudar redes microvasculares incluindo arteríolas, vênulas e capilares. Esta preparação é facilmente adaptada para ratos e hamsters.

O Mouse Preparação Muscle Cremaster for Imaging intravital da Microcirculação

Este artigo detalha o procedimento de dissecação, a configuração instrumental, e as condições experimentais durante o mapeamento óptico de potencial transmembrana (Vm) e transientes de cálcio intracelular (CAT) em Langendorff isolados intactos corações perfundidos mouse.

Mapeamento de potenciais de ação óptica e transientes de cálcio no coração de rato

Descrevemos um procedimento experimental para medir a atividade neuronal através de janelas ópticas duas acima bilateral corticies somatossensorial primária (S1) em Thy1-GCaMP6s de ratos transgênicos usando 2-fóton (2P) microscopia na vivo.

Imagem de atividade Neural no córtex somatossensorial primário usando Thy1-GCaMP6s de ratos transgênicos

Aqui, apresentamos um protocolo para imagens e quantificar a dinâmica do cálcio em populações heterogêneas de células, como células de ilhotas pancreáticas. Os repórteres fluorescentes são entregues na camada periférica de células dentro da ilhota, que é então imobilizada e imagemda, e a análise por célula da dinâmica da intensidade da fluorescência é realizada.

Dinâmica de cálcio de imagem em subpopulações de células de ilhotas pancreáticas do rato

Pericytes capilares cerebrais são atores essenciais na regulação das propriedades da barreira hemencefálica e do fluxo sanguíneo. Este protocolo descreve como pericytos capilares cerebrais podem ser isolados, cultivados, caracterizados em relação ao tipo celular e aplicados para investigações de sinalização intracelular de cálcio com sondas fluorescentes.

Cultura de Pericytes Capilares Cerebrais para Medições citosóicas de cálcio e estudos de imagem de cálcio

Apresentado aqui é um protocolo para estudar a microcirculação coronária no tecido cardíaco murino vivo por ex vivo monitoramento da pressão e fluxo de perfusão arterial que mantém a pressão, bem como componentes de árvores vasculares, incluindo os leitos capilares e pericitos, já que a artéria septal é canulada e pressurizada.

Medição dinâmica e imagem de capilares, arterioles e pericias em coração de rato

A imagem in vivo é uma ferramenta poderosa para o estudo da biologia na saúde e na doença. Este protocolo descreve imagens transpupilares da retina de camundongos com um microscópio padrão de dois fótons. Também demonstra diferentes métodos de imagem in vivo para marcar fluorescentemente múltiplas coortes celulares da retina.

Imagem transpupilar de dois fótons in vivo da retina do rato

Apresentamos um protocolo para expor o tronco cerebral do rato adulto do lado ventral. Usando uma lente de índice gradiente-refrativo com um microscópio em miniatura, a imagem de cálcio pode ser usada para examinar a atividade de somata neural inferior de oliva in vivo.

In vivo Imagem de cálcio em rato de azeitona inferior

O presente protocolo descreve a confecção de uma grande janela craniana (6 x 3 mm2) usando envoltório de alimentos, silicone transparente e vidro de cobertura. Esta janela craniana permite experiências de imagem de cálcio in vivo de campo largo e de dois fótons no mesmo rato.

In vivo Imagem de cálcio de campo amplo e de dois fótons de um rato usando uma grande janela craniana

Este protocolo descreve a exposição cirúrgica do gânglio da raiz dorsal (DRG) seguida de GCaMP3 (indicador Ca2+ codificado geneticamente; Green Fluorescent Protein-Calmodulin-M13 Protein 3) Imagem de Ca2+ dos conjuntos neuronais usando camundongos Pirt-GCaMP3 enquanto se aplica uma variedade de estímulos na pata traseira ipsilateral.

In vivo Imagem com cálcio de conjuntos neuronais em redes de neurônios sensoriais primários em gânglios intactos da raiz dorsal

Este protocolo descreve imagens de cálcio GCaMP in vivo de neurônios intactos do gânglio do trigêmeo (TG). Esta descrição inclui cirurgia de exposição TG, imagem de microscopia confocal in vivo de neurônios TG, aplicação de estímulos somáticos durante imagens microscópicas de neurônios TG e análise de dados de imagem de cálcio GCaMP in vivo .

In vivo Imagem de cálcio de conjuntos neuronais em redes de neurônios sensoriais primários em gânglios trigêmeos intactos

Aprenda a imagem de cálcio em perícitos envoltórios cerebrais e hemodinâmica em camundongos transgênicos Acta2-RCaMP 1.07. Este protocolo de imagem de dois fótons permite estudar dinâmica de cálcio e fluxo sanguíneo em células murais.

Imagem pericínica cerebral de cálcio e hemodinâmica em camundongos transgênicos em Vivo

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