Estudo do Desenvolvimento de Células Dendríticas por Short Hairpin RNA-Mediado Gene Knockdown em uma linha de célula hematopoiética e progenitora in vitro

Células dendríticas, ou DCs, são células imunes chave que ligam o sistema imunológico inato e adaptável. Embora os DCs sejam heterogêneos, este método nos ajuda a entender quais genes, incluindo fatores de transcrição, podem regular o desenvolvimento de DC. Esta técnica fornece uma maneira simples e rápida de identificar um gene que controla o desenvolvimento de DC a partir de seu progenitor in vitro.

Para começar, mantenha as células hematopoiéticas e progenitoras imortalizadas ou iHSPCs em meio RPMI 1640 completo, complementados com 100 nanogramas por mililitro do ligante FLT3 e um estradiol beta micromolar. Para transdução lentiviral, emplaque os iHSPCs em 12 placas de poço a uma densidade de uma vez 10 para as quintas células por poço e um mililitro de meio completo contendo o ligante FLT3, beta estradiol e polibreno. Em seguida, adicione o lentivírus carregando o RNA de grampo de cabelo curto em cada poço em uma multiplicidade de infecção de 100.

Em seguida, gire a placa a 1100 vezes g e 37 graus Celsius por 90 minutos, em seguida, incubar as células infectadas durante a noite a 37 graus Celsius. No dia seguinte, remova a polibrene coletando as células em tubos de 15 mililitros em centrifugação, seguindo a substituição da mídia por um meio completo fresco contendo o ligante FLT3 e beta estradiol. Após mais 24 horas, adicione seis microgramas por mililitro de puromicina ao meio para selecionar as células infectadas.

Substitua o meio de seleção a cada três dias e mantenha as células por pelo menos uma semana para expandir os iHSPCs transduzidos. Gerar e manter iHSPCs de knockdown estáveis para LacZ, Tcf4 e Id2 em meio completo suplementado com o ligante FLT3 e beta estradiol. Para iniciar a diferenciação in vitro colete os iHSPCs indiferenciados em tubos de 15 mililitros e pelota as células por centrifugação.

Após a centrifugação, descarte o supernasce e lave as células duas vezes com 10 mililitros de PBS. Após a segunda lavagem, resuspenque as células em meio completo contendo apenas o ligante FLT3 e depois semeá-las a uma densidade de duas vezes 10 a 5 vende por mililitro em uma placa de 12 poços. Após três dias, adicione um mililitro de meio completo fresco contendo o ligante FLT3.

Após mais dois dias, prossiga para analisar as células diferenciadas por citometria de fluxo. Para análise citométrica de fluxo, pipete as células para cima e para baixo duas a três vezes na placa e, em seguida, coletar as células em tubos de 1,5 mililitro. Centrifugar os tubos e descartar o supernascer antes de reutilizar as células em 50 microliters de tampão de fax.

Em seguida, adicione 50 microliters de anti-CD16 por 32 hibridoma supernante e incubar por cinco a 10 minutos no gelo. Em seguida, adicione anticorpos fluorescentes conjugados por corante diretamente às células e incubar por 15 minutos no gelo no escuro. Após a incubação, lave as células com um mililitro de tampão de fax e centrifugar a amostra.

Após a centrifugação, resuspenja as células em 100 microliters de tampão de fax e analise as amostras por citometria de fluxo. Após o knockdown mediado pelo RNA de LacZ, Tcf4 e Id2 no iHSPCS, a confirmação da eficiência de knockdown pela RTQ-PCR mostrou que a expressão de IHSPCs knockdown Tcf4 e Tcf4 foi reduzida em comparação com a do LacZ knockdown iHSPCs. Resultados semelhantes foram observados para a expressão Id2 nos iHSPCs de knockdown Id2.

Após a eliminação de LacZ por cinco dias, a frequência de células positivas cd11c, que representam a população de células dendríticas, foi de cerca de 95% No entanto, derrubando Tcf4 ou Id2 diminuiu ligeiramente a geração de células dendríticas CD11c positivas. Uma análise mais aprofundada das células dendríticas CD11c-positivas derivadas dos iHSPCs de knockdown de LacZ revelou que 70% eram células dendríticas convencionais, enquanto 22% eram células dendríticas plasidóides. Os iHSPCs knockdown Tcf4 geraram uma porcentagem significativamente menor de células dendríticas platicóides que o Knockdown LacZ controla.

Em contraste, os iHSPCs de knockdown Id2 geraram uma porcentagem significativamente menor de células dendríticas convencionais do que os controles de knockdown de LacZ, mas uma porcentagem maior de células dendríticas placitoides. As infecções por spin aumentam a eficiência de transdução do shRNA portador de lentivírus para os iHSPCs. Essa técnica aborda o papel dos fatores de transcrição e facilita o estudo de outros genes na sinalização de citocinas transdução ou metabolismo, que provavelmente estarão envolvidos no desenvolvimento de DC.