Name: Estudo do Desenvolvimento de Células Dendríticas por Short Hairpin RNA-Mediado Gene Knockdown em uma linha de célula hematopoiética e progenitora in vitro (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 12 s
Description: Aprenda a estudar o desenvolvimento de células dendríticas usando knockdown mediado por shRNA em células progenitoras hematopoiéticas imortalizadas. Este método permite identificar fatores de transcrição que regulam a diferenciação in vitro.

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Agradecemos o apoio técnico do Dr. Tz-Ling Chen. Agradecemos ao National RNAi Core Facility (Academia Sinica, Taiwan) por fornecer shRNA lentivirus (http://rnai.genmed.sinica.edu.tw). Este trabalho foi apoiado pelo Ministério da Ciência e Tecnologia de Taiwan (MOST 108-2320-B-002-037-MY3 e MOST 109-2320-B-002-054-MY3).

O manuseio do lentivírus é realizado de acordo com a regulamentação do Departamento de Saúde e Segurança Ambiental da Faculdade de Medicina da Universidade Nacional de Taiwan.
1. Preparação de linhas de células hematopoiéticas e progenitoras imortalizadas (iHSPCs)
<ol><li>Mantenha a linha celular iHSPC em meio RPMI completo 1640 contendo FL de 100 ng/mL e 1 μM β-estradiol.</li>
	<li>Passar as células a uma proporção de 1:10 a cada 3 dias. NOTA: Faça o meio RPMI 1640 completo suplementando com 10% de soro bovino fetal (FBS), 5 x 10-5 M β-mercaptoethanol e 10 μg/mL gentamicin. Recombinante murine FL também está disponível comercialmente.</li>
</ol>2. Transdução lentiviral
<ol><li>Placa iHSPCs a uma densidade de 1 x 105 células/bem em placas de 12 poços em 1 mL de meio completo contendo 100 ng/mL FL, 1 μM β-estradiol e 8 μg/mL polibrene. NOTA: A concentração de polibrene depende dos tipos celulares e geralmente está na faixa de 4-8 μg/mL.</li>
	<li>Adicione o lentivírus portador de shRNA em cada poço em uma multiplicidade de infecção (MOI) de 100. NOTA: O vetor lentiviral é pLKO.1-Puro com um marcador de seleção de puramicina (Figura 1). As sequências de alvos de shRNAs contra LacZ, Tcf4 e Id2, respectivamente, estão listadas na Tabela de Materiais. O MOI é definido pelo número de virions que são adicionados por célula durante a infecção. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62730/62730eq01.jpg">
</li>
	<li>Gire as placas a 1.100 x g por 90 min a 37 °C. NOTA: A infecção por giro é realizada usando um rotor de balde de balanço.</li>
	<li>Incubar a placa contendo células infectadas durante a noite a 37 °C em uma incubadora. NOTA: Se as células forem sensíveis à polibrene, refresque as células com o meio completo sem polibrene após a infecção por giro.</li>
	<li>Células de atualização com meio completo contendo FL de 100 ng/mL e 1 μM β-estradiol 24 h após a infecção.</li>
	<li>Adicione 6 μg/mL de puramicina ao meio para selecionar as células infectadas após mais 24 h. NOTA: O vetor lentiviral transduzido geralmente leva 48 h para expressar genes, incluindo gene resistente à puramicina. Certifique-se de que a concentração de puromicina seja otimizada para cada linha celular.</li>
	<li>Atualize o meio de seleção contendo FL de 100 ng/mL, 1 μM β-estradiol e 6 μg/mL puromicina a cada 3 dias e mantenha as células por pelo menos uma semana para expandir as células iHSPC transduzidas com facadas. NOTA: A seleção de puramicina geralmente tem efeito 48h depois, e o período de seleção depende de tipos de células.</li>
</ol>3. Medição da eficiência do knockdown por transcrição reversa e PCR em tempo real (RT-PCR)
<ol><li>Extrair RNA total de 1 x 107 shLacZ, shTcf4 e células shId2 estáveis de knockdown iHSPC usando reagente de extração de RNA comercial e precipitar RNA da camada aquosa com isopropanol, seguido pela lavagem do precipitado RNA com 75% de etanol.</li>
	<li>Dissolva o RNA (~ 5 μg) com 5 μL de H2O tratado com DEPC e ajuste a concentração para 1 μg/μL.</li>
	<li>Pegue 1-3 μg de RNA, misture com H2O tratado com DEPC a um volume final de 17,4 μL, adicione 1 μL de 1 unidade/μL RNase-free DNase I e incubar por 20 min a 37 °C. NOTA: Este passo é digerir o DNA genômico nas amostras de RNA.</li>
	<li>Adicione 1 μL de 20 mM EDTA às amostras de RNA, incubar a 65 °C por 10 minutos para inativar DNase I e colocar as amostras de RNA imediatamente a 4 °C.</li>
	<li>Adicione 11,6 μL da mistura de reação contendo 1 μL de primers oligo (dT) (45 μM), 6 μL de tampão de 5x 1º fio, 3 μL de dNTP (2 mM), 0,6 μL de inibidor de RNase (50 Unit/μL) e 1 μL de transcriptase reversa (200 Unit/μL) para as amostras de RNA e incubar a 40 °C por 1 h.</li>
	<li>Pare a reação aquecendo a 70 °C por 10 min e dilua a mistura de reação com 30 μL de H2O.</li>
	<li>Tome 2 μL da mistura de reação RT diluída como um modelo de DNA e PCR amplificá-lo usando primers contra Tcf4 ou Id2 (ver Tabela 1 para condições termociclistas). NOTA: As sequências de primer estão incluídas na Tabela de Materiais.</li>
</ol>4. Diferenciação in vitro das linhas de células de knockdown estável iHSPC
<ol><li>Mantenha o knockdown único estável de LacZ (shLacZ), Tcf4 (shTcf4) ou Id2 (shId2) em iHSPCs em meio completo contendo 100 ng/mL de FL e 1 μM β-estradiol.</li>
	<li>Colete iHSPCs shLacZ, shTcf4 e shId2 não diferenciados em um tubo de 15 mL e centrífuga por 5 min a 500 x g para pelotizar as células.</li>
	<li>Descarte o supernatante e adicione 10 mL de PBS para lavar as células. Repita este passo duas vezes.</li>
	<li>Resuspend e semente as células iHSPC a uma densidade de 2 x 105 células/mL em uma placa de 12 poços em 1 mL de meio completo contendo apenas 100 ng/mL FL.</li>
	<li>Adicione 1 mL de meio completo fresco contendo 100 ng/mL FL três dias depois.</li>
	<li>Analise as células diferenciadas (shLacZ, shTcf4 e shId2 iHSPCs) por citometria de fluxo dois dias depois.</li>
</ol>5. Análise citométrica de fluxo dos DCs diferenciados
<ol><li>Colete as células em tubos de 1,5 mL, encaixe as células para cima e para baixo 2-3 vezes na placa, e centrífuga por 5 min a 500 x g à temperatura ambiente (RT). NOTA: Os DCs diferenciados in vitro se prenderão ligeiramente às placas. A tubulação suave ajudará a recuperar os DCs das placas.</li>
	<li>Descarte o supernatante e resuspenque as células em 50 μL de tampão FACS. Em seguida, adicione 50 μL de anti-CD16/32 hybridoma supernante e incubar por 5-10 min no gelo. NOTA: O anticorpo de bloqueio fc previne a ligação inespecífica de anticorpos aos receptores Fc expressos em algumas células mielóides e células B e está comercialmente disponível através de vários fornecedores.</li>
	<li>Adicione anticorpos fluorescentes conjugados por corante (0,04 μg para cada anticorpo) diretamente às células e incubar por 15 minutos no gelo no escuro. Os anticorpos utilizados são APC/cy7 anti-mouse CD11c, FITC anti-mouse CD11b e PE anti-mouse B220. NOTA: os pDCs são definidos como CD11c+CD11b-B220+, e os cDCs são definidos como CD11c+CD11b+B220-.</li>
	<li>Lave as células com 1 mL de tampão FACS e centrífuga por 5 min a 500 x g em RT.</li>
	<li>Resuspense as células em 100 μL de tampão FACS e analise por citometria de fluxo.</li>
</ol>

<ol><li>Steinman, R. M., Witmer, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphoid+dendritic+cells+are+potent+stimulators+of+the+primary+mixed+leukocyte+reaction+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Lymphoid dendritic cells are potent stimulators of the primary mixed leukocyte reaction in mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 75 (10), 5132-5136 (1978).</li>
<li>Guilliams, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cells%2C+monocytes+and+macrophages%3A+a+unified+nomenclature+based+on+ontogeny%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Dendritic cells, monocytes and macrophages: a unified nomenclature based on ontogeny.</a> Nature Reviews Immunology. 14 (8), 571-578 (2014).</li>
<li>Blasius, A. L., Cella, M., Maldonado, J., Takai, T., Colonna, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Siglec-H+is+an+IPC-specific+receptor+that+modulates+type+I+IFN+secretion+through+DAP12%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Siglec-H is an IPC-specific receptor that modulates type I IFN secretion through DAP12.</a> Blood. 107 (6), 2474-2476 (2006).</li>
<li>Swiecki, M., Colonna, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unraveling+the+functions+of+plasmacytoid+dendritic+cells+during+viral+infections%2C+autoimmunity%2C+and+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Unraveling the functions of plasmacytoid dendritic cells during viral infections, autoimmunity, and tolerance.</a> Immunology Reviews. 234 (1), 142-162 (2010).</li>
<li>Liu, Y. -J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IPC%3A+Professional+Type+1+interferon-producing+cells+and+plasmacytoid+dendritic+cell+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">IPC: Professional Type 1 interferon-producing cells and plasmacytoid dendritic cell precursors.</a> Annual Review of Immunology. 23 (1), 275-306 (2005).</li>
<li>Panda, S. K., Kolbeck, R., Sanjuan, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmacytoid+dendritic+cells+in+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Plasmacytoid dendritic cells in autoimmunity.</a> Current Opinion in Immunology. 44, 20-25 (2017).</li>
<li>Durai, V., Murphy, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functions+of+murine+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Functions of murine dendritic cells.</a> Immunity. 45 (4), 719-736 (2016).</li>
<li>Mashayekhi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD8%CE%B1%28%2B%29+dendritic+cells+are+the+critical+source+of+interleukin-12+that+controls+acute+infection+by+Toxoplasma+gondii+tachyzoites%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">CD8α(+) dendritic cells are the critical source of interleukin-12 that controls acute infection by Toxoplasma gondii tachyzoites.</a> Immunity. 35 (2), 249-259 (2011).</li>
<li>Anderson, D. A., Dutertre, C. -A., Ginhoux, F., Murphy, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+models+of+human+and+mouse+dendritic+cell+development+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Genetic models of human and mouse dendritic cell development and function.</a> Nature Reviews Immunology. 21 (2), 101-115 (2021).</li>
<li>Plantinga, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conventional+and+monocyte-derived+CD11b%28%2B%29+dendritic+cells+initiate+and+maintain+T+helper+2+cell-mediated+immunity+to+house+dust+mite+allergen%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Conventional and monocyte-derived CD11b(+) dendritic cells initiate and maintain T helper 2 cell-mediated immunity to house dust mite allergen.</a> Immunity. 38 (2), 322-335 (2013).</li>
<li>Persson, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IRF4+transcription-factor-dependent+CD103%28%2B%29CD11b%28%2B%29+dendritic+cells+drive+mucosal+T+helper+17+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">IRF4 transcription-factor-dependent CD103(+)CD11b(+) dendritic cells drive mucosal T helper 17 cell differentiation.</a> Immunity. 38 (5), 958-969 (2013).</li>
<li>Kumamoto, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD301b%2B+dermal+dendritic+cells+drive+T+helper+2+cell-mediated+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">CD301b+ dermal dendritic cells drive T helper 2 cell-mediated immunity.</a> Immunity. 39 (4), 733-743 (2013).</li>
<li>Cisse, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+factor+E2-2+is+an+essential+and+specific+regulator+of+plasmacytoid+dendritic+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Transcription factor E2-2 is an essential and specific regulator of plasmacytoid dendritic cell development.</a> Cell. 135 (1), 37-48 (2008).</li>
<li>Grajkowska, L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isoform-specific+expression+and+feedback+regulation+of+E+protein+TCF4+control+dendritic+cell+lineage+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Isoform-specific expression and feedback regulation of E protein TCF4 control dendritic cell lineage specification.</a> Immunity. 46 (1), 65-77 (2017).</li>
<li>Jackson, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Id2+expression+delineates+differential+checkpoints+in+the+genetic+program+of+CD8%CE%B1%2B+and+CD103%2B+dendritic+cell+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Id2 expression delineates differential checkpoints in the genetic program of CD8α+ and CD103+ dendritic cell lineages.</a> The EMBO Journal. 30 (13), 2690-2704 (2011).</li>
<li>Suzuki, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+roles+of+interferon+regulatory+factor+4+in+CD11bhighCD8alpha-+dendritic+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Critical roles of interferon regulatory factor 4 in CD11bhighCD8alpha- dendritic cell development.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 101 (24), 8981-8986 (2004).</li>
<li>Rodrigues, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+progenitor+lineages+contribute+to+the+heterogeneity+of+plasmacytoid+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Distinct progenitor lineages contribute to the heterogeneity of plasmacytoid dendritic cells.</a> Nature Immunology. 19 (7), 711-722 (2018).</li>
<li>Brown, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+basis+of+mouse+and+human+dendritic+cell+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Transcriptional basis of mouse and human dendritic cell heterogeneity.</a> Cell. 179 (4), 846-863 (2019).</li>
<li>Redecke, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+progenitor+cell+lines+with+myeloid+and+lymphoid+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic progenitor cell lines with myeloid and lymphoid potential.</a> Nature Methods. 10 (8), 795-803 (2013).</li>
<li>Abe, A., Miyanohara, A., Friedmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polybrene+increases+the+efficiency+of+gene+transfer+by+lipofection%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Polybrene increases the efficiency of gene transfer by lipofection.</a> Gene Therapy. 5 (5), 708-711 (1998).</li>
<li>Sorgi, F. L., Bhattacharya, S., Huang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protamine+sulfate+enhances+lipid-mediated+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Protamine sulfate enhances lipid-mediated gene transfer.</a> Gene Therapy. 4 (9), 961-968 (1997).</li>
<li>Kirkling, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch+signaling+facilitates+in+vitro+generation+of+cross-presenting+classical+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Notch signaling facilitates in vitro generation of cross-presenting classical dendritic cells.</a> Cell Reports. 23 (12), 3658-3672 (2018).</li>
<li>Pearce, E. J., Everts, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cell+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Immunology%22%5BJournal%5D)">Dendritic cell metabolism.</a> Nature Reviews. Immunology. 15 (1), 18-29 (2015).</li>
<li>Wculek, S. K., Khouili, S. C., Priego, E., Heras-Murillo, I., Sancho, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+Control+of+Dendritic+Cell+Functions%3A+Digesting+Information%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Metabolic Control of Dendritic Cell Functions: Digesting Information.</a> Frontiers in Immunology. 10 (775), (2019).</li>
<li>Saxton, R. A., Sabatini, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mTOR+signaling+in+growth%2C+metabolism%2C+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">mTOR signaling in growth, metabolism, and disease.</a> Cell. 168 (6), 960-976 (2017).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Vetores de shRNA baseados em lentivírus são frequentemente usados para silenciamento genético por transdução viral em células e permitem integração estável no genoma hospedeiro. No entanto, várias eficiências de transdução em diferentes tipos de células precisam ser consideradas, e uma série de abordagens foram tomadas para superar esse problema. 
Polybrene é um polímero policalítico que pode neutralizar as cargas na membrana celular, aumentando assim a ligação da virion às células durante a <...

Os DCs são os principais reguladores da imunidade inata e adaptativa1. Os DCs são classificados principalmente em duas populações funcionalmente distintas, ou seja, pDCs e cDCs. Além disso, os cDCs compreendem dois subconjuntos, ou seja, cDCs tipo I e tipo II ou cDC1s e cDC2s, respectivamente2. pDCs, expressando BST2, Siglec-H, e níveis intermediários de CD11c em camundongos3,4, são as células que podem segregar grandes quantidades de IFN-I durante inflamação e infecção viral5. Devido à sua robusta capacidade de produção ifn-I, eles também são suspeitos de desempenhar um papel fundamental na progressão de doenças autoimunes, incluindo lúpus eritematoso sistêmico (SLE)6. cDC1s, definidos pela expressão superficial de XCR1, CD8a, CLEC9A e CD103 em camundongos7, são especializados na ativação e polarização de células CD8+ (CTLs) citotóxicas através da apresentação cruzada de antígenos, iniciando assim a imunidade tipo I em resposta a patógenos intracelulares e câncer8,9. Por outro lado, cDC2s, expressando CD11b e CD172α (também conhecido como Sirpα) em humanos e camundongos, podem ativar células T CD4+ e promover a resposta imune tipo II contra alérgenos e parasitas10, bem como modular a imunidade tipo III após o reconhecimento extracelular de bactérias e microbiota11,12.
A diversificação de DCs é determinada por um grupo de TFs de células-tronco hematopoiéticas e progenitoras (HSPCs) no BM. E2-2 (codificado por Tcf4) é um regulador mestre para diferenciação e função dos pDCs13,14. Em contraste, o inibidor da ligação de DNA 2 (ID2) impulsiona a especificação do CDC e inibe o desenvolvimento do PDC através do bloqueio da atividade proteica E15. Além disso, o desenvolvimento de cDC1s requer IRF8 e BATF3, enquanto a diferenciação de cDC2s depende muito do IRF416. Trabalhos recentes têm explorado a heterogeneidade dos pDCs17 e cDCs e sua regulamentação transcricional18. Devido à complexidade da rede DC, há uma necessidade não atendida de estabelecer uma plataforma para identificar outros TFs que controlam o desenvolvimento e funcionalidade dos DCs.
Aqui, utilizamos um iHSPC que foi gerado expressando translocação nuclear regulamentada por estrogênio de Hoxb8 em células BM (também conhecidas como células Hoxb8-FL)19. os iHSPCs podem proliferar e permanecer em um estágio indiferenciado na presença de ligantes β-estradiol e Flt3 (FL), enquanto eles começam a se diferenciar em diferentes tipos de DC na presença de FL após a retirada de β-estradiol19. Com base nesse recurso, podemos derrubar genes de interesse no estágio progenitor, seguido por examinar o efeito sobre a diferenciação in vitro de pDCs e cDCs. Portanto, este método é uma ferramenta poderosa para descobrir os genes que regulam o desenvolvimento e a função dos DCs.

<table><tbody><tr><td><forte>Anticorpos</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>APC/Cy7 anti-camundongo CD11c Anticorpo</td><td>Biolegend</td><td>117324</td><td>(Clone: N418)</td></tr><tr><td>FITC anti-camundongo/humano CD11b Anticorpo</td><td>Biolegend</td><td>101206</td><td>(Clone: M1/70)</td></tr><tr><td>PE anti-camundongo/humano B220 Anticorpo</td><td>Biolegend</td><td>103208</td><td>(Clone: RA3-6B2)</td></tr><tr><td><forte>Cultura de células</ forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,5 mL Micro tubo</td><td>&nbsp; ExtraGene</td><td>TUBE-170-C</td><td></td></tr><tr><td>Placa tratada com cultura de tecidos de 12 poços</td><td>Falcon</td><td>353043</td><td></td></tr><tr><td>Soro bovino fetal (FBS)</td> <td>Corning</td><td>35-010-CV</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Gibco</td><td></td><td>médio 11875-085</td><td></td></tr><tr><td>Reagente</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&beta;-estradiol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E2758-250MG</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoetanol (&beta;-ME)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>FACS tampão</td><td>caseiro</td><td></td><td>Fórmula: 1xPBS+0,5 %FBS+0,1%NaN3</td></tr><tr><td>Flt3 ligante (FL)</td><td>Polybrene caseiro</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>TR-1003-G</td><td></td></tr><tr><td>Puromicina</td><td>Invivogen</td><td>ant-pr-1</td><td></td></tr><tr><td>TRIsure</td><td>BIOLINE</td><td>BIO-38032</td><td></td></tr><tr><td>shRNA (Taregt sequence/clone ID)</td><td>Company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>shId2&nbsp; (GCTTATGTCGAATGATAGCAA/TRCN0000054390)</td><td>O Consórcio RNAi (TRC)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>shLacZ (CGCGATCGTAATCACCCGAGT/TRCN0000072224)</td><td>O Consórcio RNAi (TRC)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>shTcf4 (GCTGAGTGATTTACTGGATTT/TRCN0000012094)</td><td>O Consórcio RNAi (TRC)</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

estudo do desenvolvimento de células dendríticas por short hairpin rna-mediado gene knockdown em uma linha de célula hematopoiética e progenitora in vitro

Study of Dendritic Cell Development by Short Hairpin RNA-Mediated Gene Knockdown in a Hematopoietic Stem and Progenitor Cell Line In vitro

As células dendríticas (DCs) são células importantes que apresentam antígenos que conectam respostas imunes inatas e adaptáveis. Os DCs são heterogêneos e podem ser divididos em DCs convencionais (cDCs) e DCs plasmacitóides (pDCs). cDCs é especializado em apresentar antígenos e ativar células T ingênuas. Por outro lado, os pDCs podem produzir grandes quantidades de interferons tipo I (IFN-I) durante a infecção viral. A especificação dos DCs ocorre em um estágio inicial de progenitores de DC na medula óssea (MM) e é definida por uma rede de fatores de transcrição (TFs). Por exemplo, cDCs altamente expressam ID2, enquanto pDCs altamente expressos E2-2. Uma vez que cada vez mais subconjuntos de DCs estão sendo identificados, há um crescente interesse em entender TFs específicos controlando o desenvolvimento de DC. Aqui, estabelecemos um método para tela de TFs críticos para a diferenciação de DCs in vitro , fornecendo lentivírus carregando RNA de grampo de cabelo curto (shRNA) em uma linha de células hematopoiéticas e progenitoras imortalizadas (iHSPCs). Após a seleção e diferenciação in vitro , o potencial de CDC e pDC das linhas celulares de knockdown estáveis são analisados por citometria de fluxo. Essa abordagem fornece uma plataforma para identificar genes potencialmente regendo os destinos dc de progenitores in vitro.

O mapa do vetor lentiviral pLKO.1-Puro é mostrado (Figura 1). Após a entrega do lentivírus que expressa shRNA contra LacZ (um controle não direcionado), Tcf4 e Id2 em iHSPCs, a eficiência de knockdown confirmada pelo RT-qPCR revelou que a expressão de Tcf4 foi reduzida em shTcf4 iHSPCs, em comparação com shLacZ iHSPCs (Figura 2A). Por outro lado, a diminuição da expressão do Id2 também foi observada ...

Aqui fornecemos um protocolo para triagem de potenciais fatores de transcrição envolvidos no desenvolvimento de células dendríticas (DC) usando transdução lentiviral de shRNA para obter linhas celulares de knockdown estáveis para diferenciação in vitro DC.

Estudo do Desenvolvimento de Células Dendríticas por Short Hairpin RNA-Mediado Gene Knockdown em uma linha de célula hematopoiética e progenitora in vitro

Dendritic cells (DCs) are important antigen-presenting cells that connect innate and adaptive immune responses. DCs are heterogeneous and can be divided ...

Células dendríticas, ou DCs, são células imunes chave que ligam o sistema imunológico inato e adaptável. Embora os DCs sejam heterogêneos, este método nos ajuda a entender quais genes, incluindo fatores de transcrição, podem regular o desenvolvimento de DC. Esta técnica fornece uma maneira simples e rápida de identificar um gene que controla o desenvolvimento de DC a partir de seu progenitor in vitro.Para começar, mantenha as células hematopoiéticas e progenitoras imortalizadas ou iHSPCs em meio RPMI 1640 completo, complementados com 100 nanogramas por mililitro do ligante FLT3 e um estradiol beta micromolar. Para transdução lentiviral, emplaque os iHSPCs em 12 placas de poço a uma densidade de uma vez 10 para as quintas células por poço e um mililitro de meio completo contendo o ligante FLT3, beta estradiol e polibreno. Em seguida, adicione o lentivírus carregando o RNA de grampo de cabelo curto em cada poço em uma multiplicidade de infecção de 100.Em seguida, gire a placa a 1100 vezes g e 37 graus Celsius por 90 minutos, em seguida, incubar as células infectadas durante a noite a 37 graus Celsius. No dia seguinte, remova a polibrene coletando as células em tubos de 15 mililitros em centrifugação, seguindo a substituição da mídia por um meio completo fresco contendo o ligante FLT3 e beta estradiol. Após mais 24 horas, adicione seis microgramas por mililitro de puromicina ao meio para selecionar as células infectadas.Substitua o meio de seleção a cada três dias e mantenha as células por pelo menos uma semana para expandir os iHSPCs transduzidos. Gerar e manter iHSPCs de knockdown estáveis para LacZ, Tcf4 e Id2 em meio completo suplementado com o ligante FLT3 e beta estradiol. Para iniciar a diferenciação in vitro colete os iHSPCs indiferenciados em tubos de 15 mililitros e pelota as células por centrifugação.Após a centrifugação, descarte o supernasce e lave as células duas vezes com 10 mililitros de PBS. Após a segunda lavagem, resuspenque as células em meio completo contendo apenas o ligante FLT3 e depois semeá-las a uma densidade de duas vezes 10 a 5 vende por mililitro em uma placa de 12 poços. Após três dias, adicione um mililitro de meio completo fresco contendo o ligante FLT3.Após mais dois dias, prossiga para analisar as células diferenciadas por citometria de fluxo. Para análise citométrica de fluxo, pipete as células para cima e para baixo duas a três vezes na placa e, em seguida, coletar as células em tubos de 1,5 mililitro. Centrifugar os tubos e descartar o supernascer antes de reutilizar as células em 50 microliters de tampão de fax.Em seguida, adicione 50 microliters de anti-CD16 por 32 hibridoma supernante e incubar por cinco a 10 minutos no gelo. Em seguida, adicione anticorpos fluorescentes conjugados por corante diretamente às células e incubar por 15 minutos no gelo no escuro. Após a incubação, lave as células com um mililitro de tampão de fax e centrifugar a amostra.Após a centrifugação, resuspenja as células em 100 microliters de tampão de fax e analise as amostras por citometria de fluxo. Após o knockdown mediado pelo RNA de LacZ, Tcf4 e Id2 no iHSPCS, a confirmação da eficiência de knockdown pela RTQ-PCR mostrou que a expressão de IHSPCs knockdown Tcf4 e Tcf4 foi reduzida em comparação com a do LacZ knockdown iHSPCs. Resultados semelhantes foram observados para a expressão Id2 nos iHSPCs de knockdown Id2.Após a eliminação de LacZ por cinco dias, a frequência de células positivas cd11c, que representam a população de células dendríticas, foi de cerca de 95% No entanto, derrubando Tcf4 ou Id2 diminuiu ligeiramente a geração de células dendríticas CD11c positivas. Uma análise mais aprofundada das células dendríticas CD11c-positivas derivadas dos iHSPCs de knockdown de LacZ revelou que 70% eram células dendríticas convencionais, enquanto 22% eram células dendríticas plasidóides. Os iHSPCs knockdown Tcf4 geraram uma porcentagem significativamente menor de células dendríticas platicóides que o Knockdown LacZ controla.Em contraste, os iHSPCs de knockdown Id2 geraram uma porcentagem significativamente menor de células dendríticas convencionais do que os controles de knockdown de LacZ, mas uma porcentagem maior de células dendríticas placitoides. As infecções por spin aumentam a eficiência de transdução do shRNA portador de lentivírus para os iHSPCs. Essa técnica aborda o papel dos fatores de transcrição e facilita o estudo de outros genes na sinalização de citocinas transdução ou metabolismo, que provavelmente estarão envolvidos no desenvolvimento de DC.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Este vídeo demonstra o processo de diferenciação mielóide células dendríticas da medula óssea de ratos. Isolamento de rato tíbia e fêmur, e processamento de medula óssea são demonstradas. Fotos demonstrando a morfologia das células antes e depois da diferenciação, e figuras representando fenótipo celular e IL-12 maturação de produção a seguir usando CpG são mostrados.

Cultura de células dendríticas mielóides a partir de precursores da medula óssea

Apresentação de antígenos em órgãos linfóides secundários pelas células dendríticas é crucial para o início da célula T mediada resposta imune adaptativa. Aqui demonstramos a cultura de medula óssea células dendríticas derivadas de camundongos, ativação e de rotulagem para os dois fótons de imagem.

Geração de Medula Óssea Derivado Células Dendríticas murino para uso em dois fótons de imagem

Apresentamos nosso protocolo nucleofection high-throughput otimizado como uma forma eficiente de transfecting humanos primários derivados de monócitos com células dendríticas ou DNA plasmídeo ou siRNA sem causar maturação das células. Nós ainda fornecer provas para silenciar siRNA sucesso do gene alvo RIG-I em ambos os mRNA e os níveis de proteína.

Protocolo otimizado para transfecção eficiente de células dendríticas, sem maturação das células

Lentivirus mediada Durante Knockdown Ex Vivo Eritropoese de Células-Tronco Hematopoéticas

Este vídeo descreve um protocolo para a geração de células dendríticas - células-chave apresentadoras de antígenos que ativam as células T - da medula óssea de um camundongo adulto.

Geração de células dendríticas derivadas da medula óssea: um método para gerar células dendríticas a partir da medula óssea de camundongos

Neste vídeo, demonstramos um método para realizar a transdução de vetores lentivirais shRNA para obter linhagens celulares knockdown estáveis em células-tronco hematopoiéticas e progenitoras imortalizadas (iHSPCs).

Nocaute de gene mediado por RNA de grampo curto em iHSPCs in vitro: um sistema de expressão de shRNA baseado em lentivírus em iHSPCs para knockdown de expressão gênica específica

Este vídeo demonstra um ensaio in vitro para gerar células dendríticas plasmocitoides (pDCs) a partir de células progenitoras linfóides comuns (CLPs). Após a co-cultura de CLPs purificados com células alimentadoras irradiadas com γ na presença de ligante tirosina quinase-3 (FL) semelhante a Fms, os CLPs se diferenciam em pDCs não aderentes, cuja presença é confirmada por citometria de fluxo.

Geração in vitro de células dendríticas plasmocitoides a partir de progenitores linfóides comuns

Este protocolo descreve os procedimentos experimentais para avaliar a diferenciação de células dendríticas plasmacytoid em placas de Peyer de progenitores de células dendriticas comuns, utilizando técnicas que envolvem o isolamento de FACS mediada por células, a transferência de genes hidrodinâmico, e análise de fluxo de subconjuntos imunes em placas de Peyer.

Avaliando o Desenvolvimento da murino células dendríticas plasmocitóides em placas de Peyer Usando transferência adoptiva de Progenitores hematopoiéticos

A manipulação da expressão gênica temporal na diferenciação de células-tronco embrionárias (ESCs) pode ser alcançada usando sistemas gênicos induzíveis. No entanto, a geração dessas linhagens celulares é cara e demorada. Este protocolo alcança a expressão rápida de um transgene na diferenciação de células derivadas de ES e subsequente análise da diferenciação hematopoiética a jusante.

Retroviral Infecção murina Embryonic Stem Cell Derived Cells embrioides corpo de Análise da diferenciação hematopoética

RNA-de sequenciamento e bioinformática análises foram utilizados para identificar fatores de transcrição significativamente e diferencialmente expressos em subpopulações Lin-CD34 + e Lin-CD34 @ de EMLcells do mouse. Estes fatores de transcrição pode desempenhar um papel importante na determinação da chave entre as células Lin-CD34 @ auto-renovação Lin-CD34 + e parcialmente diferenciados.

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Neste estudo, apresentamos um sistema de cultura in vitro que pode gerar pDCs de forma eficiente por co-cultura de progenitores linfóides comuns com células alimentadoras de AC-6 na presença do ligante Flt3.

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Aprenda a estudar o desenvolvimento de células dendríticas usando knockdown mediado por shRNA em células progenitoras hematopoiéticas imortalizadas. Este método permite identificar fatores de transcrição que regulam a diferenciação in vitro.

Estudo do Desenvolvimento de Células Dendríticas por Short Hairpin RNA-Mediado Gene Knockdown em uma linha de célula hematopoiética e progenitora in vitro (Vídeo) | JoVE Journal

Estudo do Desenvolvimento de Células Dendríticas por Short Hairpin RNA-Mediado Gene Knockdown em uma linha de célula hematopoiética e progenitora in vitro

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