Estudo do Desenvolvimento de Células Dendríticas por Short Hairpin RNA-Mediado Gene Knockdown em uma linha de célula hematopoiética e progenitora in vitro
7 de março de 2022
Aqui fornecemos um protocolo para triagem de potenciais fatores de transcrição envolvidos no desenvolvimento de células dendríticas (DC) usando transdução lentiviral de shRNA para obter linhas celulares de knockdown estáveis para diferenciação in vitro DC.
Células dendríticas, ou DCs, são células imunes chave que ligam o sistema imunológico inato e adaptável. Embora os DCs sejam heterogêneos, este método nos ajuda a entender quais genes, incluindo fatores de transcrição, podem regular o desenvolvimento de DC. Esta técnica fornece uma maneira simples e rápida de identificar um gene que controla o desenvolvimento de DC a partir de seu progenitor in vitro.
Para começar, mantenha as células hematopoiéticas e progenitoras imortalizadas ou iHSPCs em meio RPMI 1640 completo, complementados com 100 nanogramas por mililitro do ligante FLT3 e um estradiol beta micromolar. Para transdução lentiviral, emplaque os iHSPCs em 12 placas de poço a uma densidade de uma vez 10 para as quintas células por poço e um mililitro de meio completo contendo o ligante FLT3, beta estradiol e polibreno. Em seguida, adicione o lentivírus carregando o RNA de grampo de cabelo curto em cada poço em uma multiplicidade de infecção de 100.
Em seguida, gire a placa a 1100 vezes g e 37 graus Celsius por 90 minutos, em seguida, incubar as células infectadas durante a noite a 37 graus Celsius. No dia seguinte, remova a polibrene coletando as células em tubos de 15 mililitros em centrifugação, seguindo a substituição da mídia por um meio completo fresco contendo o ligante FLT3 e beta estradiol. Após mais 24 horas, adicione seis microgramas por mililitro de puromicina ao meio para selecionar as células infectadas.
Substitua o meio de seleção a cada três dias e mantenha as células por pelo menos uma semana para expandir os iHSPCs transduzidos. Gerar e manter iHSPCs de knockdown estáveis para LacZ, Tcf4 e Id2 em meio completo suplementado com o ligante FLT3 e beta estradiol. Para iniciar a diferenciação in vitro colete os iHSPCs indiferenciados em tubos de 15 mililitros e pelota as células por centrifugação.
Após a centrifugação, descarte o supernasce e lave as células duas vezes com 10 mililitros de PBS. Após a segunda lavagem, resuspenque as células em meio completo contendo apenas o ligante FLT3 e depois semeá-las a uma densidade de duas vezes 10 a 5 vende por mililitro em uma placa de 12 poços. Após três dias, adicione um mililitro de meio completo fresco contendo o ligante FLT3.
Após mais dois dias, prossiga para analisar as células diferenciadas por citometria de fluxo. Para análise citométrica de fluxo, pipete as células para cima e para baixo duas a três vezes na placa e, em seguida, coletar as células em tubos de 1,5 mililitro. Centrifugar os tubos e descartar o supernascer antes de reutilizar as células em 50 microliters de tampão de fax.
Em seguida, adicione 50 microliters de anti-CD16 por 32 hibridoma supernante e incubar por cinco a 10 minutos no gelo. Em seguida, adicione anticorpos fluorescentes conjugados por corante diretamente às células e incubar por 15 minutos no gelo no escuro. Após a incubação, lave as células com um mililitro de tampão de fax e centrifugar a amostra.
Após a centrifugação, resuspenja as células em 100 microliters de tampão de fax e analise as amostras por citometria de fluxo. Após o knockdown mediado pelo RNA de LacZ, Tcf4 e Id2 no iHSPCS, a confirmação da eficiência de knockdown pela RTQ-PCR mostrou que a expressão de IHSPCs knockdown Tcf4 e Tcf4 foi reduzida em comparação com a do LacZ knockdown iHSPCs. Resultados semelhantes foram observados para a expressão Id2 nos iHSPCs de knockdown Id2.
Após a eliminação de LacZ por cinco dias, a frequência de células positivas cd11c, que representam a população de células dendríticas, foi de cerca de 95% No entanto, derrubando Tcf4 ou Id2 diminuiu ligeiramente a geração de células dendríticas CD11c positivas. Uma análise mais aprofundada das células dendríticas CD11c-positivas derivadas dos iHSPCs de knockdown de LacZ revelou que 70% eram células dendríticas convencionais, enquanto 22% eram células dendríticas plasidóides. Os iHSPCs knockdown Tcf4 geraram uma porcentagem significativamente menor de células dendríticas platicóides que o Knockdown LacZ controla.
Em contraste, os iHSPCs de knockdown Id2 geraram uma porcentagem significativamente menor de células dendríticas convencionais do que os controles de knockdown de LacZ, mas uma porcentagem maior de células dendríticas placitoides. As infecções por spin aumentam a eficiência de transdução do shRNA portador de lentivírus para os iHSPCs. Essa técnica aborda o papel dos fatores de transcrição e facilita o estudo de outros genes na sinalização de citocinas transdução ou metabolismo, que provavelmente estarão envolvidos no desenvolvimento de DC.
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Visão Geral
Este artigo apresenta um protocolo para triagem de fatores de transcrição que influenciam o desenvolvimento de células dendríticas (DC) por meio da transdução lentiviral de shRNA. O método permite a criação de linhagens celulares com silenciamento estável para diferenciação in vitro de DCs.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Imunologia
- Biologia Celular
- Regulação Transcricional
Contexto
- As células dendríticas são cruciais para conectar a imunidade inata e adaptativa.
- Compreender o desenvolvimento das CD pode revelar informações sobre as respostas imunes.
- Este estudo foca na identificação de genes que regulam a diferenciação das CD.
- O método utiliza células-tronco hematopoiéticas e progenitoras imortalizadas.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um protocolo para triagem de fatores de transcrição no desenvolvimento de DCs.
- Criar linhagens celulares com silenciamento estável para estudos funcionais.
- Facilitar a diferenciação in vitro de DCs a partir de células progenitoras.
Métodos Utilizados
- Manutenção de iHSPCs em meio RPMI 1640 completo.
- Suplementação com ligante FLT3 e beta-estradiol.
- Transdução lentiviral de iHSPCs com shRNA.
- Uso de polibreno para aumentar a eficiência de transdução.
Resultados Principais
- Geração bem-sucedida de linhagens celulares com silenciamento estável.
- Identificação de fatores de transcrição envolvidos no desenvolvimento de DC.
- Demonstração das capacidades de diferenciação in vitro.
- Informações sobre a regulação gênica do desenvolvimento de células imunes.
Conclusões
- O protocolo fornece um método confiável para estudar o desenvolvimento de DC.
- Pode ser utilizado para identificar genes reguladores-chave na imunologia.
- Essa abordagem pode aprimorar a compreensão das respostas imunes.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este método permite a investigação sistemática da função de fatores de transcrição no comprometimento da linhagem de células dendríticas, apoiando a validação de alvos em programas de descoberta com foco em imunologia. Ao associar perturbação genética à saída fenotípica em um sistema in vitro reproduzível, ele fornece desvio mecanicista de riscos para hipóteses iniciais de alvos. A abordagem aumenta a confiança preditiva na priorização de alvos imunomoduladores antes de esforços intensivos de identificação de compostos líderes.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biofármacos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação funcional de fatores de transcrição como alvos terapêuticos potenciais no desenvolvimento de células dendríticas.
- Valor Operacional: Oferece uma plataforma escalonável para triagem de silenciamento gênico por meio da entrega de shRNA por lentivírus em precursores hematopoéticos imortalizados.
- Valor Preditivo: Relaciona a modulação do alvo com a geração de subconjuntos de células dendríticas, apoiando decisões de continuidade ou interrupção com base em dados de desvio de linhagem.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Valor Científico: Gera leituras quantitativas de citometria de fluxo de células positivas para CD11c e distribuição de subpopulações (cDC versus pDC) após o silenciamento do fator de transcrição.
- Valor Operacional: Estabelece um ensaio padronizado de diferenciação com condições definidas de citocinas (ligante FLT3, beta-estradiol) e seleção por puromicina.
- Prontidão do Ensaio: Produz linhagens celulares com silenciamento estável, adequadas para uso repetido em triagens de compostos ou estudos de modulação de vias.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Translacional: Modela a especificação inicial de células dendríticas a partir de progenitores, orientando estratégias de biomarcadores ligadas a redes de fatores de transcrição.
- Redução Mecanística de Riscos: Esclarece o papel de Id2 na promoção do destino de células dendríticas convencionais e de Tcf4 no suporte ao desenvolvimento de células dendríticas plasmocitoides.
- Alinhamento Pré-clínico: Apoia a avaliação de alvos que influenciam a diferenciação de células imunes, relevante para programas de adjuvantes vacinais ou autoimunidade.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se insere na fase de biologia de descoberta, permitindo o teste de hipóteses sobre alvos antes do desenvolvimento de ensaios para identificação de compostos iniciais, com dados que orientam a seleção de candidatos pré-clínicos em imunomodulação.
- Biologia da Descoberta: Apoia a dissecção mecanicista de reguladores transcricionais que governam o comprometimento da linhagem de células dendríticas a partir de progenitores hematopoiéticos.
- Desenvolvimento de Ensaios: Gera pontos finais reprodutíveis e quantitativos de imunofluorescência e citometria de fluxo para monitorar a eficiência de diferenciação e a distribuição de subconjuntos.
- Análises: Fornece leituras quantificáveis (porcentagem de CD11c+, cDC, pDC) que permitem comparações entre condições de silenciamento e apoiam a avaliação estatística do impacto do alvo.
- Pesquisa Translacional: Conecta a diferenciação de progenitores precoces à função imune downstream, relevante para modelar respostas em contextos de infecção ou tolerância.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma reutilizável para triagem de genes adicionais em vias de sinalização por citocinas, metabolismo ou redes transcricionais que afetam o desenvolvimento de células dendríticas.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança na validação de alvos ao associar a silenciamento de fatores de transcrição a alterações mensuráveis na geração de subconjuntos de células dendríticas.
- Valor Operacional: Permite a padronização de protocolos de diferenciação e leitura entre laboratórios por meio de condições definidas de meio e marcadores de seleção.
- Valor Estratégico: Reduz o risco biológico na seleção de alvos imunomoduladores ao fornecer evidência funcional precoce de efeitos específicos da linhagem.
- Impacto no Portfólio: Orienta a priorização ajustada ao risco de alvos com base em sua influência nas decisões de destino das células dendríticas, apoiando a alocação eficiente de recursos.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em transdução lentiviral, cultura de células hematopoéticas e citometria de fluxo.
- Depende do acesso a bibliotecas lentivirais de shRNA, seleção com puromicina e meios suplementados com citocinas (ligante FLT3, beta-estradiol).
- Necessita padronização da eficiência de transdução (por exemplo, por meio de infecção com centrifugação) e da duração da seleção para geração estável de silenciamento gênico.
- Envolve a otimização do tempo de diferenciação e dos painéis de anticorpos para identificação precisa dos subconjuntos de células dendríticas por citometria de fluxo.
- Limita-se à modelagem in vitro; os achados exigem validação em sistemas primários humanos ou murinos para relevância translacional.
Perguntas Frequentes sobre Biotecnologia Farmacêutica
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:43
Preparation of Immortalized HematopoieticStem and Progenitor Cell (iHSPC) Lines and Lentiviral Transduction
2:08
In Vitro Differentiation of the Stable Knockdown iHSPC Cell Lines
3:05
Flow Cytometric Analysis of the Differentiated Dendritic Cells
4:01
Results: Dendritic Cell Differentiation Following Short Hairpin RNA-Mediated Tcf4 and Id2 Knockdown
5:33
Conclusion
