Name: Um modelo eficaz de rato de isquemia renal unilateral-reperfusão lesão (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-15T14:45:00.000+00:00
Duration: 5 min 53 s
Description: Aprenda a criar um modelo eficaz de isquemia renal unilateral com reperfusão em camundongos para estudar lesão renal aguda. Este método permite analisar alterações morfológicas sequenciais e desenvolver estratégias terapêuticas.

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Parte do trabalho mostrado neste artigo foi fundada pelo Centro de Pesquisa Integrativa de Mamíferos da Faculdade de Medicina Veterinária da Universidade Ross (RUSVM), São Cristóvão e Nevis. A ajuda financeira fornecida pelo Departamento de Ciências Biomédicas Veterinárias da Faculdade de Medicina Veterinária da Universidade de Long Island é muito apreciada.

O protocolo a seguir descreve uma cirurgia de sobrevivência. Portanto, aplica-se a maior prática asséptica e cirúrgica. Todos os experimentos em animais foram realizados em conformidade com as diretrizes institucionais e aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidado e Uso de Animais. Para eliminar as diferenças de gênero e de tensão nos efeitos IRI, apenas os camundongos C57BL6 masculinos foram utilizados no estudo. Todos os animais foram combinados em idade e peso para produzir resultados comparáveis.
1. Preparação
NOTA: Uma linha do tempo das diferentes fases experimentais e intervenções é mostrada na Figura 1A.
<ol><li>Limpe e desinfete a mesa cirúrgica antes de cada procedimento. Prepare e coloque todos os materiais necessários (instrumentos esterilizados e cotonetes de algodão, gaze e cortinas estéreis, anestésicos pré-diluídos, almofada de aquecimento, grampo vascular esterilizado, solução salina estéril e antissépticos e sutura da pele) na mesa cirúrgica (ver a Tabela dos Materiais).</li>
	<li>Anesthetize camundongos C57BL6 machos (faixa etária de 11 a 13 semanas) por injeção intraperitoneal de cetamina/xilazina (100 mg/kg e 20 mg/kg de peso corporal, respectivamente, previamente diluído em soro fisiológico estéril). NOTA: O manejo qualificado de animais é essencial para minimizar o estresse para o animal, pois as respostas ao estresse podem afetar negativamente a ação dos anestésicos.</li>
	<li>Após a administração da cetamina/xilazina, raspe a área cirúrgica no flanco direito usando uma lâmina de barbear e sabão. NOTA: Raspar a pele melhora a cicatrização de feridas, bem como os resultados gerais das cirurgias de sobrevivência.</li>
	<li>Desinfete a pele na área cirúrgica com 70% de álcool primeiro e depois com solução de iodo povidone usando um cotonete.</li>
	<li>Após a preparação da pele, coloque o mouse sobre uma mesa de aquecimento em uma posição de decúbito ventral e estabilize a temperatura corporal a 37 °C (monitorada através de sondas retal e sensor de almofada). NOTA: Os rins são mais facilmente acessados e expostos cirurgicamente quando colocados em decúbito ventral em vez de laterais.</li>
	<li>Enquanto a temperatura do corpo estiver estabilizada, aplique pomada nos olhos do rato. NOTA: Anestésicos dissociativos, como a cetamina, fazem com que os olhos do animal permaneçam abertos enquanto anestesiados.</li>
</ol>2. Cirurgia
<ol><li>Uma vez que os reflexos da dor estejam ausentes (pinças do pé), realize uma incisão cirúrgica dorso-lateral de aproximadamente 1 cm no flanco direito usando uma lâmina de bisturi. Inicie a incisão atrás da última costela e continue caudally aproximadamente 1 cm paralelo à linha média lombar.</li>
	<li>Transecte a musculatura abdominal usando uma tesoura para visualizar o espaço retroperitoneal. Remova as pequenas quantidades de sangue produzidas durante a secção dos músculos usando cotonetes estéreis. NOTA: Como a abordagem dorso-lateral é usada, o retroperitônio, e não a cavidade peritônica, é acessado com este procedimento.</li>
	<li>Empurre o rim direito para fora da cavidade abdominal. Use fórceps graefe para expor o rim cuidadosamente. NOTA: Mantenha sempre os fórceps fechados para evitar lesões traumáticas no rim quando colocados no abdômen e use-o apenas para empurrar cuidadosamente e guiar o rim em direção à incisão cirúrgica e fora dele.</li>
	<li>Exponha lentamente o rim direito e identifique o pedículo renal. Remova cuidadosamente o tecido adiposo ao redor do pedículo.</li>
	<li>Para induzir a isquemia, coloque o grampo vascular sobre a artéria renal e a veia presentes no pedículo renal, evitando a fixação do ureter adjacente. Use um hemostato halsted-mosquito para manipular o grampo vascular. NOTA: A isquemia é confirmada pela visualização de uma mudança na cor do rim de vermelho-rosa para roxo escuro (Figura 1B).</li>
	<li>Cubra o rim preso com gaze estéril encharcada em soro fisiológico para evitar a dessacação e deixe-o por 30 minutos.</li>
	<li>Monitore a profundidade e a umidade da gaze periodicamente durante este período. NOTA: A dose de indução da anestesia é suficiente para fornecer analgesia até o final do evento isquêmico; portanto, não são necessárias injeções anestésicos adicionais.</li>
	<li>Pouco antes do fim do período de isquemia, remova a gaze e descubra o rim. Segure o hemostato Halsted-Mosquito, pronto para a remoção do grampo.</li>
	<li>No minuto 30, abra o grampo vascular com o hemostato e remova-o do pedículo renal para permitir a reperfusão do rim. NOTA: A reperfusão é confirmada pela visualização de uma mudança na cor do rim do roxo escuro para o vermelho-rosa (Figura 1C).</li>
	<li>Realizar os mesmos procedimentos descritos acima para animais falsos sem fixação do pedículo renal.</li>
	<li>Após a verificação da mudança de cor renal, devolva o rim à cavidade abdominal. Feche os músculos abdominais com sutura absorvível 5-0 usando um padrão cruzado. NOTA: Uma segunda injeção de anestésicos pode ser necessária para manter a analgesia durante a sutura dos músculos e da pele. Metade da dose inicial mostrou-se eficaz no fornecimento de analgesia até a conclusão da cirurgia.</li>
	<li>Feche a pele com sutura absorvível 5-0 usando um padrão de colchão horizontal. Limpe a ferida com uma solução de iodo povidone usando um cotonete.</li>
</ol>3. Recuperação e pós-cirurgia
NOTA: Como o tempo pós-cirúrgico é o tempo real de reperfusão, o cuidado pós-cirúrgico adequado é eticamente obrigatório e cientificamente relevante. Os tempos de reperfusão podem ser selecionados conforme o exigido pelo pesquisador. Os tempos de reperfusão de 4h, 8h, 16h, 1 dia, 2 dias, 4 dias e 7 dias são comparados para obter uma visão geral sequencial das alterações patológicas induzidas pelo IRI renal.
<ol><li>Mantenha o mouse na almofada de aquecimento até que ele comece a se recuperar da anestesia. NOTA: Recomenda-se esperar até que o mouse comece a mover as pernas e tente se mover. Nos casos em que injeções anestésicos adicionais são necessárias durante a cirurgia, o tempo de recuperação é maior. Atipamezole, um antagonista do receptor alfa-2, pode ser administrado a uma dose de 0,5 mg/kg de peso corporal intraperitoneal para reverter os efeitos da xilazina e encurtar a fase de recuperação. Para o tratamento da dor, a buprenorfina (0,1 mg/kg de peso corporal, intraperitoneally) é administrada pré-operatória e a cada 6 horas durante a fase de recuperação e pós-cirúrgica. O uso de anti-inflamatórios não esteroides é desencorajado, pois várias drogas nesta família induzem a nefrotoxicidade e podem, portanto, alterar os resultados.</li>
	<li>Após a recuperação da anestesia, coloque o rato de volta em sua gaiola com livre acesso à água e à comida. NOTA: Os alimentos purê podem ser fornecidos em uma placa de Petri, bem como material para se esconder e jogar (por exemplo, folhas de papel, tubos de papel toalha).</li>
	<li>Monitore o camundongo diariamente para avaliar a cicatrização da ferida, a ingestão de alimentos e água, o peso corporal e o comportamento. NOTA: O estado de cicatrização da ferida foi avaliado utilizando a seguinte escala: 1, seco; 2, molhado; 3, parcialmente aberto; 4, aberto. A cicatrização rápida de feridas foi documentada neste estudo, com mais de 90% das feridas secas após o 2º dia.</li>
</ol>4. Eutanásia e coleta de amostras
<ol><li>Eutanize os camundongos com pentobarbital de sódio administrados intraperitoneal em uma dose que é o dobro da dose anestésica para camundongos (100 mg/kg).</li>
	<li>Coletar amostras de fluido e tecido conforme necessário. NOTA: Foram coletados os rins, sangue inteiro (para contagem de células sanguíneas), soro (para bioquímica sanguínea), urina, coração e pulmões. Alguns microliters de soro são necessários para análise bioquímica sanguínea (nitrogênio de ureia sanguínea (BUN), creatinina, eletrólitos). Se necessário, 24 horas antes da eutanásia, os camundongos podem ser colocados em gaiolas metabólicas para coletar um maior volume de urina que permite a determinação dos parâmetros da função renal.</li>
</ol>

<ol><li>Ray, S. C., Mason, J., O'Connor, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ischemic+renal+injury%3A+can+renal+anatomy+and+associated+vascular+congestion+explain+why+the+medulla+and+not+the+cortex+is+where+the+trouble+starts%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Ischemic renal injury: can renal anatomy and associated vascular congestion explain why the medulla and not the cortex is where the trouble starts.</a> Seminars in Nephrology. 39 (6), 520-529 (2019).</li>
<li>Weight, S. C., Bell, P. R., Nicholson, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Renal+ischaemia--reperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22The+British+Journal+of+Surgery%22%5BJournal%5D)">Renal ischaemia--reperfusion injury.</a> The British Journal of Surgery. 83 (2), 162-170 (1996).</li>
<li>Ratliff, B. B., Abdulmahdi, W., Pawar, R., Wolin, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidant+mechanisms+in+renal+injury+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants+%26+Redox+Signaling%22%5BJournal%5D)">Oxidant mechanisms in renal injury and disease.</a> Antioxidants & Redox Signaling. 25 (3), 119-146 (2016).</li>
<li>Schrier, R. W., Wang, W., Poole, B., Mitra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+renal+failure%3A+definitions%2C+diagnosis%2C+pathogenesis%2C+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Acute renal failure: definitions, diagnosis, pathogenesis, and therapy.</a> The Journal of Clinical Investigation. 114 (1), 5-14 (2004).</li>
<li>Fernández, A. R., Sánchez-Tarjuelo, R., Cravedi, P., Ochando, J., López-Hoyos, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review%3A+Ischemia+reperfusion+injury-a+translational+perspective+in+organ+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Review: Ischemia reperfusion injury-a translational perspective in organ transplantation.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (22), 8549(2020).</li>
<li>Wu, C. -L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tubular+peroxiredoxin+3+as+a+predictor+of+renal+recovery+from+acute+tubular+necrosis+in+patients+with+chronic+kidney+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Tubular peroxiredoxin 3 as a predictor of renal recovery from acute tubular necrosis in patients with chronic kidney disease.</a> Scientific Reports. 7 (1), 43589(2017).</li>
<li>Nishida, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+and+sustained+thioredoxin+analogue+prevents+acute+kidney+injury+and+its-associated+distant+organ+damage+in+renal+ischemia+reperfusion+injury+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Systemic and sustained thioredoxin analogue prevents acute kidney injury and its-associated distant organ damage in renal ischemia reperfusion injury mice.</a> Scientific Reports. 10 (1), 20635(2020).</li>
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<li>Wei, Q., Dong, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+model+of+ischemic+acute+kidney+injury%3A+technical+notes+and+tricks%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-+Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Mouse model of ischemic acute kidney injury: technical notes and tricks.</a> American Journal of Physiology - Renal Physiology. 303 (11), 1487-1494 (2012).</li>
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<li>Le Clef, N., Verhulst, A., D'Haese, P. C., Vervaet, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unilateral+renal+ischemia-reperfusion+as+a+robust+model+for+acute+to+chronic+kidney+injury+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Unilateral renal ischemia-reperfusion as a robust model for acute to chronic kidney injury in mice.</a> PLoS One. 11 (3), 0152153(2016).</li>
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<li>Skrypnyk, N. I., Harris, R. C., de Caestecker, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ischemia-reperfusion+model+of+acute+kidney+injury+and+post+injury+fibrosis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Ischemia-reperfusion model of acute kidney injury and post injury fibrosis in mice.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (78), e50495(2013).</li>
<li>Hesketh, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Renal+ischaemia+reperfusion+injury%3A+a+mouse+model+of+injury+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Renal ischaemia reperfusion injury: a mouse model of injury and regeneration.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (88), e51816(2014).</li>
<li>Wei, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+mouse+model+of+chronic+kidney+disease+transitioned+from+ischemic+acute+kidney+injury%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">New mouse model of chronic kidney disease transitioned from ischemic acute kidney injury.</a> American Journal of Physiology. Renal Physiology. 317 (2), 286-295 (2019).</li>
<li>Basile, D. P., Leonard, E. C., Tonade, D., Friedrich, J. L., Goenka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+effects+on+long-term+function+of+injured+and+contralateral+kidneys+following+unilateral+renal+ischemia-reperfusion%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-+Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Distinct effects on long-term function of injured and contralateral kidneys following unilateral renal ischemia-reperfusion.</a> American Journal of Physiology - Renal Physiology. 302 (5), 625-635 (2012).</li>
<li>Polichnowski, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathophysiology+of+unilateral+ischemia-reperfusion+injury%3A+importance+of+renal+counterbalance+and+implications+for+the+AKI-CKD+transition%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Pathophysiology of unilateral ischemia-reperfusion injury: importance of renal counterbalance and implications for the AKI-CKD transition.</a> American Journal of Physiology. Renal Physiology. 318 (5), 1086-1099 (2020).</li>
</ol>

Os autores declaram que não há conflitos de interesse em relação a este artigo.

Os modelos IRI renais do rato são populares em pesquisas biomédicas devido aos seus custos operacionais relativamente baixos e à disponibilidade de diversos modelos transgênicos12. O modelo IRI renal unilateral apresentado aqui imita alterações patológicas características observadas no IRI renal humano, como dilatação tubular, necrose e fibrose13. Esses resultados são baseados em diferentes tempos de reperfusão.
As etapas críticas deste protocolo incluem a manutenção da temperatura constante do corpo e a correta colocação do grampo vascular no pedículo renal. A temperatura corporal influencia o metabolismo do animal14, alterando os resultados experimentais tanto nos níveis fisiológicos quanto celulares15. Neste modelo, a temperatura corporal foi estabilizada antes da cirurgia usando sondas retal e sensor de almofada. Além disso, o monitoramento contínuo da temperatura corporal durante todo o procedimento cirúrgico é altamente recomendado, especialmente antes de colocar o grampo vascular para induzir isquemia.
A exposição do rim e a colocação adequada do grampo vascular também são fundamentais para o sucesso do experimento. Danos na cápsula renal pelo manuseio inadequado dos fórceps durante a exposição do rim através da incisão cirúrgica resultarão em hemorragia perirenal e inflamação. O grampo vascular deve ser colocado no pedículo renal que oclui a artéria renal e a veia renal sem afetar o ureter e as artérias suprarenais. Crítico para esta etapa é a dissecação cuidadosa do tecido adiposo em torno do hilum renal14,16.
Este modelo é econômico e de tempo. O consumo anestésico por camundongo foi de 156,47 ± 37,88 μL (média ± SD, n = 17) de um coquetel de cetamina/xilazina prediluada (1:10 cetamina, 1:50 xilazina, em solução salina; concentração de solução de estoque, 100 mg/mL ambos). A cirurgia pode ser realizada em um período relativamente curto. O tempo total de cirurgia por camundongo foi de 53 ± 5,23 min (média ± SD, n = 17). Com pessoal treinado, várias cirurgias podem ser realizadas ao mesmo tempo. Em nosso grupo, um pesquisador experiente realizou a cirurgia até que o grampo foi liberado do pedículo renal, enquanto um segundo assumiu o lugar do fechamento da ferida até a recuperação do camundongo. Com essa abordagem, conseguimos realizar um alto número de cirurgias em um único dia. Neste modelo, utilizou-se a abordagem dorsolateral, que resulta em menos trauma e redução da perda de fluido e calor da cavidade abdominal em comparação com a abordagem média16.
Protocolos publicados anteriormente descreveram a técnica de fixação de pediculos renais para induzir lesão renal aguda em camundongos 17,18,19. Entretanto, nesses estudos, foi realizada nefréctomia contralateral, além do IRI unilateral com tempos isquêmicos que variavam de 15 a 26 min. Neste protocolo, induzímos isquemia unilateral por 30 minutos, preservando o rim contralateral. Isso resultou em uma taxa de sobrevivência de 100%. No entanto, este modelo não é adequado para induzir danos renais azotemicos devido em parte ao efeito compensatório exercido pelo rim contralateral não interventado cirurgicamente. No entanto, manter um rim não afetado no mesmo animal oferece a vantagem de usar tempos de isquemia mais longos com uma maior taxa de sobrevivência. Além disso, o rim contralateral pode ser utilizado para avaliar possíveis efeitos colaterais de medicamentos ou tratamentos de teste aplicados durante o procedimento experimental e para estudar os efeitos do crosstalk renal-renal 20,21. Por exemplo, este modelo tem sido útil para mostrar alterações reativas induzidas por espécies de oxigênio no nível celular tanto no IRI quanto no rim interpuldido não cirúrgico11.
Este modelo tem uma aplicação potencial em estudos com o objetivo de identificar e caracterizar marcadores de danos renais unilaterais, efeitos de crosstalk renal, alterações hemodinâmicas induzidas por IRI pós-renal e potenciais efeitos nefrotóxicos de candidatos a medicamentos a serem usados no IRI renal. Esta descrição detalhada das principais mudanças patológicas serve como uma ferramenta valiosa para selecionar o tempo mais adequado para estudar processos celulares específicos, desde inflamação e necrose (4h a 2 dias) até regeneração (4 dias) e fibrose (7 dias e depois).

Os rins estão entre os órgãos mais perfusados do corpo e são extremamente suscetíveis a alterações na perfusãosanguínea 1. A lesão por isquemia renal -reperfusão (IRI) continua sendo a principal causa de insuficiência renal aguda 2,3 e está associada à alta morbidade e alta mortalidade em pacientes hospitalizados4. Com opções terapêuticas limitadas disponíveis,4,5 IRI renal é atualmente o foco de diversos esforços de pesquisa em biomedicina 6,7 visando o desenvolvimento de novos alvos terapêuticos e a caracterização de marcadores precoces e sensíveis de lesão renal 8,9,10 . Identificar um modelo animal confiável, de tempo e econômico é considerado essencial para atender a essas necessidades. Este artigo apresenta um modelo de rato simples e eficaz de IRI renal unilateral. Isquemia é induzida pela fixação do pedículo renal direito por 30 min11,12. Uma parte crucial deste modelo é escolher o tempo de reperfusão mais adequado que reproduzirá os eventos patológicos de interesse, como necrose tubular, infiltração de células inflamatórias polimorfonucleares ou fibrose. Portanto, os pesquisadores recebem esse panorama sequencial das mudanças patológicas representativas esperadas no rim IRI.

<table><tbody><tr><td>Cloridrato de atipamezol</td><td>Penn Veterinary Supply, Inc., PA, EUA</td><td>PVS8700</td><td>5 mg/mL</td></tr><tr><td>Buprenorfina</td><td>Penn Veterinary Supply, Inc., PA, EUA</td><td>PRMBURPEN22</td><td>0,3 mg/mL</td></tr><tr><td>Solução comercial de eutanásia</td><td>vários fornecedores</td><td>e</td><td>, por exemplo, Euthasol Virbac (pentobarbital sódico 390 mg/mL + fenitoína sódica 50 mg/mL)</td></tr><tr><td>Pomada para os olhos Puralube</td><td>Dechra Produtos Veterinários, KS, EUA</td><td>na</td><td>3.5 g (1/8 oz)</td></tr><tr><td>Almofada de aquecimento RightTempJr</td><td>Kent Scientific, CT, EUA&</td><td>nbsp; RT-JR-20</td><td>Considere aquele com duas sondas de temperatura</td></tr><tr><td>Cloridrato de cetamina</td><td>Penn Veterinary Supply, Inc., PA, EUA</td><td>VED1220</td><td>100 mg / ml</td></tr><tr><td>S & T Grampo vascular</td><td>Fine Science Tools, Inc., Alemanha</td><td>00398-02</td><td>Dimensões da mandíbula: 5,5 x 1,5 mm; comprimento: 11 mm</td></tr><tr><td>Cortinas de toalha descartáveis estéreis </td><td>Kent Scientific, CT, USA </td><td>SURGI-5023-3 </td> Instrumentos cirúrgicos <td>descartáveis, embalados individualmente </td></tr><tr><td>(pinça Graefe, hemostático Halsted-Mosquito, tesoura, etc)</td> <td>Fine Science Tools, Inc., Alemanha</td><td>Vários</td><td>Considere a tesoura reta extra fina e a pinça Graefe angular</td></tr><tr><td>Sutura Vicryl</td><td>Ethicon US, LLC</td><td>J493G</td><td>Tamanho 5-0</td></tr><tr><td>Cloridrato de xilazina</td><td>Penn Veterinary Supply, Inc., PA, EUA</td><td>VAM4821</td><td>100 mg/mL</td></tr></tbody></table>

um modelo eficaz de rato de isquemia renal unilateral-reperfusão lesão

An Effective Mouse Model of Unilateral Renal Ischemia-Reperfusion Injury

A lesão por reperfusão de isquemia (IRI) é a principal causa de insuficiência renal aguda e é um contribuinte significativo para a função de enxerto retardada. Os modelos animais são os únicos recursos disponíveis que imitam as complexidades dos danos associados ao IRI encontrados in vivo. Este artigo descreve um modelo eficaz de mouse de IRI renal unilateral que fornece dados altamente reprodutíveis. Isquemia é induzida por ocluir o pediculo renal direito por 30 minutos seguido de reperfusão. Além do procedimento cirúrgico, será fornecida uma visão geral sequencial das alterações fisiológicas e histopatológicas esperadas após o IRI renal, comparando dados de sete diferentes tempos de reperfusão (4h, 8h, 16h, 1 dia, 2 dias, 4 dias e 7 dias). Serão compartilhados dados críticos para o planejamento de experimentos à frente, como tempo cirúrgico médio, consumo médio de anestésicos e mudanças de peso corporal ao longo do tempo. Este trabalho ajudará os pesquisadores a implementar um modelo IRI renal confiável e selecionar o tempo de reperfusão adequado que se alinha com seus objetivos investigativos pretendidos.

Parâmetros fisiológicos Camundongos recuperados desta cirurgia renal unilateral IRI sem intercorrências; apareceu ativo e alerta; e mostrou alimentação normal, bebida e comportamento até o dia seguinte. Alguns camundongos podem ter perda de peso corporal pós-IRI, embora geralmente seja menos de 10% do peso corporal inicial (Figura 2). Maiores perdas de peso corporal (˃10%) podem ser prejudiciais, e esses animais devem ser removidos do estudo. Camundongos operados por sham não apresentaram alterações de peso corporal após a cirurgia (medidos 24 horas após a cirurgia). A maioria dos camundongos recuperou seu peso corporal inicial entre os dias 4 e 7 pós-cirurgia (ver grupo de 7 dias IRI, Figura 2). A função renal pode ser avaliada usando marcadores tradicionais como nitrogênio de ureia sanguínea (BUN) e creatinina. Além disso, foram incluídos na análise os níveis de eletrólitos (sódio, potássio e cloreto) e uma contagem de sangue diferencial automatizada.
Mudanças histopatológicas A avaliação dos achados histopatológicos foi feita utilizando-se de 4% de seções integrais integrais do rim manchadas com hematoxilina/eosina (HE), ácido periódico Schiff e manchas tricráticas de Masson. As mudanças mais evidentes produzidas por este modelo iri renal unilateral podem ser vistas na junção cortico-medular, especificamente nos túbulos proximais, membros ascendentes espessos do laço de Henle, e túbulos distais convoludos, bem como no interstício tubular (ver a legenda da Figura 3). Imagens microscópicas que mostram as lesões mais características após o IRI no rim podem ser vistas na Figura 3. Uma lista dos achados histopatológicos sequenciais está prevista na Tabela 1.
Um sistema de pontuação de lesão tubular foi desenvolvido para categorizar o dano ao longo do tempo (Figura 4). Neste, cinco alterações definidas foram avaliadas por três avaliadores diferentes: 1) atenuação epitelial tubular; 2) perda de borda de escova; 3) necrose tubular; 4) obstrução luminal; e 5) presença de elenco proteináceo. Uma atribuição de "1" indica que a alteração está presente, "0" que está ausente.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62749/62749fig01.jpg"> Figura 1: Modelo iri renal experimental no camundongo. (A) Fases de experimentos e intervenções (indução de anestesia, isquemia e reperfusão) são mostradas. Observe as alterações na cor do rim direito para vermelho escuro durante a isquemia (B) para rosa durante a reperfusão (C). (D) Aparência macroscópica do rim direito IRI (seta vermelha) em comparação com o rim não-IRI contralateral do mesmo animal 24 h após a cirurgia. A seta vermelha em (B) mostra a posição do grampo hemostático. Abreviação: IRI = Lesão isquemia-reperfusão. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62749/62749fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62749/62749fig02.jpg"> Figura 2: Peso corporal de camundongos antes e depois do IRI renal. Dados individuais são mostrados. Abreviaturas: IRI = Lesão de isquemia-reperfusão; h = horas; d = dias. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62749/62749fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62749/62749fig03.jpg"> Figura 3: Lesões microscópicas típicas observadas no córtex e na junção cortico-medular de camundongos operados pelo IR. Sham e diferentes tempos de reperfusão são mostrados (indicado acima de cada imagem). (A) Estruturas intactas são mostradas em farsa (ampliação 40x; barra de escala = 20 μm). Setas em IRI 4 h indicam a presença de protécnicos lançados no lúmen tubular (ampliação 40x; barra de escala = 20 μm). Setas em IRI 8 h mostram dilatação tubular (ampliação 40x; barra de escala = 50 μm). Seta preta no IRI 16 h mostra elenco tubular em segmentos medulares; setas brancas mostram áreas de necrose celular (ampliação 40x; barra de escala = 50 μm). As setas pretas no IRI 1 d indicam dilatação tubular (ampliação 10x; barra de escala = 100 μm). A seta preta no IRI 2 d mostra núcleos celulares ampliados; pontas de flechabrabrabrais mostram áreas de linfócito e infiltração de macrófago (ampliação 40x; barra de escala = 50 μm). Pontas de flecha branca em IRI 4 d indicam células tubulares mitóticas (ampliação 40x; barra de escala = 50 μm). A seta preta no IRI 7 d mostra uma área de fibrose focal; a ponta da seta branca mostra uma área de regeneração (ampliação 20x; barra de escala = 100 μm). (B) Coloração PAS mostrando o córtex renal de camundongos durante a reperfusão precoce (4h, 8 h e 16 h). Observe a atenuação progressiva da borda do pincel (setas). Ampliações 40x; barras de escala = 50 μm (C) Mancha tricrática masson de sham e IRI 7 d ratos mostrando áreas de fibrose intersticial (setas brancas). Ampliação 40x; barras de escala = 50 μm. Abreviaturas: IRI = Lesão de isquemia-reperfusão; Glo = glomerulus; PCT = túbulo convolucido proximal; DCT = túbulo distal convolutado; CD = coletor de duto; PAS = ácido periódico Schiff; d = dia. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62749/62749fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62749/62749fig04.jpg"> Figura 4: Pontuação de lesão tubular de ratos falsos e operados por IRI. Dimensionação do sistema de pontuação 1 a 5 para atenuação epitelial tubular; perda da fronteira de escova; necrose tubular; obstrução luminal; e presença de elenco proteináceo. Uma atribuição de "1" indica que a alteração está presente, "0" que está ausente. Valores individuais são mostrados. As barras representam ± média SD (n = 4). Abreviação: IRI = Lesão isquemia-reperfusão. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62749/62749fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Tempo depois do IRI</td>
			<td>Mudanças patológicas mais significativas</td>
		</tr>
<tr>
<td>4h</td>
			<td>Obstrução tubular</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Proteína lançada em lúmen</td>
		</tr>
<tr>
<td>8 h</td>
			<td>Dilatação tubular</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Necrose incipiente</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Atenuação do epitélio</td>
		</tr>
<tr>
<td>16 h</td>
			<td>Necrose celular</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Elenco tubular</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Infiltração de neutrófilo</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 dia</td>
			<td>Necrose</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Dilatação tubular</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Infiltração de neutrófilo</td>
		</tr>
<tr>
<td>2 dias</td>
			<td>Dilatação tubular</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Infiltração de linfócitos e macrófagos</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Núcleos celulares ampliados</td>
		</tr>
<tr>
<td>4 dias</td>
			<td>Atividade mitótica proeminente em células túbulos</td>
		</tr>
<tr>
<td>7 dias</td>
			<td>Fibrose focal</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Áreas de regeneração</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 1: Mudanças patológicas mais significativas ao longo do tempo. Diagnosticado com base no exame microscópico de 4-6 animais por grupo.

A lesão por isquemia renal está associada à alta morbidade e mortalidade em pacientes hospitalizados. Aqui, apresentamos um modelo de camundongo simples e eficaz de lesão unilateral de isquemia renal-reperfusão e fornecemos uma visão geral sequencial das alterações patológicas representativas observadas no rim.

Um modelo eficaz de rato de isquemia renal unilateral-reperfusão lesão

Ischemia-reperfusion injury (IRI) is the leading cause of acute renal failure and is a significant contributor to delayed graft function. Animal models ...

A lesão de isquemia renal é a principal causa de insuficiência renal aguda. Este modelo é muito útil para entender as alterações fisiopatológicas que ocorrem no rim após um insulto isquêmico. Este modelo é tempo e custo-benefício e fornece dados altamente reprodutíveis.Além disso, este Modelo unilateral de Isquemia Renal permite que o pesquisador trabalhe com tempos isquêmicos mais longos, mantendo uma alta taxa de sobrevivência. Para começar, coloque o mouse anestesiado na mesa de operação. Após esterilizar a área cirúrgica, use uma lâmina de bisturi para fazer uma incisão cirúrgica lateral lateral de aproximadamente um centímetro no flanco direito atrás da costela e continue aconchegante aproximadamente um centímetro paralelo à linha média lombar.Transecte a musculatura abdominal usando uma tesoura para visualizar o espaço retroperitoneal. Use um cotonete estéril para remover as pequenas quantidades de sangue produzidas durante a secção dos músculos. Em seguida, empurre o rim direito para fora da cavidade abdominal.Devagar e cuidadosamente expor o rim com fórceps cinzentos e identificar o pedículo renal. Em seguida, remova cuidadosamente o tecido adiposo ao redor do pedículo. Use um Hemostat de mosquito halsted para manipular o grampo vascular.Para induzir a isquemia, coloque o grampo vascular sobre a artéria renal e a veia presentes no pedículo renal evitando a fixação do ureter adjacente. Cubra o rim preso com gaze estéril encharcada em soro fisiológico para evitar a dessacação. Deixe os rins na gaze por 30 minutos e monitore a profundidade e umidade da gaze periodicamente.Pouco antes do fim do período de isquemia, descubra o rim e segure o Hemostat do Mosquito Halsted, pronto para a remoção do grampo. Ao final do período de isquemia, abra o grampo vascular com o hemostato e remova o grampo para permitir a perfusão do rim. Para animais de controle falso, realize a cirurgia demonstrada sem fixação do pedículo renal.Após verificar a mudança de cor renal, devolva o rim à cavidade abdominal. Feche os músculos abdominais em um padrão cruzado com sutura absorvível 5-0. Feche a pele em um padrão de colchão horizontal com sutura absorvível 5-0.Limpe a ferida com solução povidone-iodo. Após a lesão por perfusão da isquemia, a redução do peso corporal foi observada em alguns camundongos com menos de 10% do peso corporal inicial. No entanto, a maioria dos camundongos recuperou seu peso corporal inicial entre os dias 4 e 7 pós-cirurgia.Os camundongos de controle não apresentaram alterações de peso corporal após a cirurgia. Várias alterações na morfologia renal pós-cirurgia foram identificadas usando hematoxilina-eosina, ácido periódico-Schiff, e coloração tricromática de Masson. A presença de gesso proteináceo no lúmen tubular foi observada após quatro horas.A dilatação tubular foi detectada às oito horas e o gesso tubular, bem como a necrose celular nos segmentos medulares, foram notados às 16 horas após a cirurgia do IRI. Após 24 horas de cirurgia, observou-se dilatação tubular. Infiltração de linfócitos e macrófagos e núcleos celulares ampliados foram detectados após 48 horas.Até o dia 4, foram observadas células tubulares mitóticas e, no 7º dia, foi detectada a fibrose focal. O córtex renal dos camundongos durante a reperfusão precoce foi monitorado usando coloração PAS e atenuação progressiva da borda da escova foi visível. As áreas de fibrose intersticial no 7º dia pós-cirurgia foram visualizadas usando a coloração trichome de Masson.Um sistema de pontuação de lesão tubular foi desenvolvido para categorizar o dano ao longo do tempo. Os maiores escores de lesão tubular foram obtidos entre 8 horas e 24 horas após o Renal IRI. Alguns dos passos mais críticos são a colocação correta do grampo vascular no pedículo renal e a manutenção de uma temperatura corporal constante durante a cirurgia.

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