Name: Detecção automatizada e de alto rendimento da adesão bacteriana às células hospedeiras (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 21 s
Description: Aprenda a detectar adesão bacteriana às células hospedeiras com este método automatizado de alto rendimento. A técnica reduz o tempo manual e oferece resultados reprodutíveis para estudos de interações patógeno-hospedeiro.

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Somos gratos ao Dr. Kaite Zlotkowski da Biotek Inc. por seu suporte técnico. Este trabalho foi apoiado pelo Departamento de Defesa sob o número do contrato W911NF1920013 para a PdF, a Agência de Projetos de Pesquisa Avançada de Defesa (DARPA) e o Departamento do Interior sob o contrato nº 140D6319C0029 ao PdF. O conteúdo das informações não reflete necessariamente a posição ou a política do Governo, e nenhum endosso oficial deve ser inferido.

1. Cultura celular A549
<ol><li>Mantenha a linha celular A549 em meio F-12K suplementada com 10% de soro bovino fetal (FBS) e incubar a 37 °C, 5% DE CO2.</li>
	<li>Mude o meio a cada 3-4 dias e passagem em 85%-95% de confluência.</li>
	<li>Brevemente, enxágue as células com 1 x soro fisiológico tamponado de fosfato (PBS, pH 7.4, a menos que indicado de outra forma) e trate com 1 ml de 0,25% trypsin-0,53 mM solução de ácido ethylenodiaminatotracético (EDTA) (submergir a camada celular) por cerca de 2 min a 37 °C.</li>
	<li>Adicione 6 mL adicionais de meio de crescimento completo (meio F-12K + 10% FBS) para interromper a atividade de protease. Em seguida, plaque as células em um frasco de cultura tecidual estéril T-75 a uma proporção de subcultivação de 1:3-1:8. O volume final da cultura é de 12 mL.</li>
	<li>Semente aproximadamente 1 x 104 células A549 (concentração celular: ~1 x 105 células/mL) em cada poço de uma placa de 96 poços um dia antes dos ensaios de adesão.</li>
</ol>2. Crescimento bacteriano e coloração
<ol><li>Realize todos os trabalhos bacterianos em um gabinete de biossegurança, laboratório de Biossegurança Nível 2.</li>
	<li>Inocular todas as culturas bacterianas, incluindo P. aeruginosa (PAO1), Escherichia. coli, L. monocytogenes, e B. subtilis, etc., do estoque de glicerol congelado e cultivá-los em Broto de Soja Tripptic (TSB, 3 mL) em uma incubadora de tremor a 37 °C durante a noite mantida a 250 rpm.</li>
	<li>No dia seguinte, use uma diluição de 1:100 da cultura da noite para inocular uma subcultura e cultuá-las em TSB (1 mL) por 3h à fase exponencial, medir o OD em 600 nm (OD600) para confirmar. Certifique-se de que o OD600 está na faixa de 0,4-0.6.
</li>
	<li>Antes de realizar o ensaio de adesão do hospedeiro de bactérias, as diluições em série de placas de suspensão bacteriana em placas de ágar TSB, incubam-nas durante a noite a 37 °C e, em seguida, estabelecem as CFUs bacterianas do número de colônias. Para P. aeruginosa, um OD600 de 1,0 corresponde a 2 x 108 células bacterianas viáveis/mL, e para L. monocytogenes,um OD600 de 1,0 corresponde a 9 x 108 células bacterianas viáveis/mL.</li>
	<li>Colher as culturas bacterianas em fase exponencial por centrifugação a 13.000 x g por 2 min a temperatura ambiente (RT), depois lave-as uma vez usando 1x PBS (1 mL). Resuspenda as pelotas bacterianas em 1 mL de 1x PBS e determine as concentrações medindo OD600 de suspensões bacterianas. Por exemplo, P. aeruginosa com OD600 de 0,5 representa uma concentração de 1 x 108 células bacterianas/mL.</li>
	<li>Manche a suspensão bacteriana usando um corante verde ou vermelho fluorescente em RT por 30 minutos com rotação suave no escuro. Para isso, adicione 2 μL do corante concentrado de coloração de estoque concentrado de 500 vezes em 1 mL de suspensão bacteriana para diluir o corante 1 vezes. Para lavar o corante de coloração, centrifugar as bactérias manchadas a 13.000 x g por 2 min e resuspensar a pelota em 1 mL de 1x PBS por três vezes. NOTA: Se as bactérias marcadas pela fluorescência (GFP-, RFP-, mCherry-, etc.) forem usadas no experimento, pule esta etapa de coloração bacteriana. GFP-tagged P. aeruginosa e vermelho fluorescente corante manchado L. monocytogenes foram usados neste protocolo.</li>
	<li>Coletar as células bacterianas manchadas ou bactérias marcadas por GFP por centrifugação a 13.000 x g por 2 min. Resuspenque em médio F-12K fresco (1 mL) e meça o OD600 de cada cultura. Posteriormente diluir as culturas às concentrações desejadas com base na multiplicidade de infecção (MOI) e concentração de células hospedeiras. O volume final utilizado neste experimento é de 500 μL. NOTA: Por exemplo, se a concentração de células hospedeiras contada usando a coloração do Trypan Blue for de 1 x 105 células/mL, a concentração desejada de células bacterianas em um MOI de 100 será de 1 x 107 células/mL. Concentração de P. aeruginosa a 0,5 OD600 é 1 x 108/mL. Para obter a concentração desejada, diluir a cultura P. aeruginosa 10 vezes, adicionar 50 μL de cultura resuspended a 450 μL de médio F-12K fresco.</li>
</ol>3. Adesão bacteriana e coloração de células hospedeiras
<ol><li>Primeiro, lave as monocamadas celulares A549 semeadas três vezes com pbs 1x quente. Para cada lavagem, adicione 100 μL de 1x PBS a cada poço, delicadamente pipeta para cima e para baixo três vezes, descarte 1x PBS ou espere por 10 s após a adição e, em seguida, aspirar para remover 1x PBS. Para determinar a cinética da associação bacteriana, sobreponha as células com 100 μL de concentrações desejadas de suspensão bacteriana com diferentes MEIs (0, 1, 10 e 100). Gire as bactérias a 200 x g por 10 minutos e incuba as células A549 infectadas a 37 °C, 5% de CO2 por mais 1h. NOTA: Neste experimento, cada condição tinha um triplicado técnico.</li>
	<li>Remova as bactérias desvinculadas lavando as monocamadas cinco vezes com 1x de PBS quente, conforme descrito acima. Adicione 100 μL de 4% de formaldeído (em 1x PBS) em cada poço das placas de 96 poços para fixar as células. Deixe as placas sentarem no gelo por 15 minutos e depois lave a solução de fixação usando 1x PBS três vezes.</li>
	<li>Para colori-los, adicione 50 ng/mL de 4′,6-diamidino-2-fenilôdole (DAPI) e incuba-o por 10 min na RT. Após a incubação, lave os poços três vezes usando 1x PBS. Cubra as células A549 infectadas com 100 μL de PBS 1x para evitar a secagem. Processe para a próxima etapa ou armazene a placa a 4 °C por até 2 dias no escuro.</li>
</ol>4. Imagem, processamento e análise automatizadas de fluorescência
<ol><li>Para manter a integridade dos dados, escolha aleatoriamente e manualmente cinco locais de cada poço para capturar as imagens com ampliação de 20x. Capture as imagens fluorescentes de células A549 e bactérias sob canais DAPI e GFP, respectivamente. Use o canal PE-Cy5 para as bactérias manchadas pelo corante fluorescente vermelho.</li>
	<li>Para ter uma melhor resolução, processe todas as imagens para achatamento de fundo e desconvolução. Defina os parâmetros como 68 μm de diâmetro da bola rolante para suavizar e medir automaticamente a função de propagação de ponto (PSF) da desconvolução de imagem com base no objetivo.</li>
	<li>Para contar todas as células e bactérias qualificadas, meça a intensidade de fluorescência das células e bactérias hospedeiras e defina a intensidade de fluorescência mais fraca das células hospedeiras e bactérias como os limiares para a contagem celular. Conte todas as bactérias próximas a uma célula hospedeira a uma distância de 15 μm, pois a bactéria aderente, pois o diâmetro da célula A549 é de 10,59-14,93 μm21. NOTA: Uma configuração padrão no sistema de imagem conta seletivamente as células hospedeiras com diâmetros que variam de 5 a 100 μm e bactérias que variam de 0,2-5 μm de tamanho (largura e comprimento).</li>
	<li>Com base nos resultados de processamento manual de imagem acima mencionados, aplique os parâmetros de suavização de imagem, desconvolução, tamanhos de objetos, distância e intensidades de fluorescência ao resto das imagens automatizadas. Após a análise automatizada, considere leituras críticas, como contagem total de células hospedeiras, tamanhos e formas das células, contagem total de bactérias e a contagem bacteriana média por célula hospedeira, que foi o indicador mais importante, para determinar a adesão bacteriana.</li>
	<li>Exportação de dados e análise estatística<ol>
<li>Exportar os resultados analisados de todas as imagens para uma planilha (por exemplo, formato 'xlsx'). O sistema automatizado gera dois conjuntos de resultados: 1) a contagem bacteriana média aderente de cada imagem; 2) os dados informativos de cada célula hospedeira, como bactérias aderentes, contam com uma única célula, tamanho do hospedeiro e a intensidade média de fluorescência de células hospedeiras e bactérias, a partir da imagem correspondente.</li>
		<li>Calcule o número médio e o desvio padrão das contagens bacterianas aderentes de todas as imagens para representar o nível de adesão bacteriana em comparação com controles negativos. Neste método, E. coli e B. subtilis serviram como controles negativos no teste de adesão bacteriana Gram-negativa e Gram-positiva, respectivamente. Realize ANOVAs bidireis para testar uma variação significativa entre os pontos de dados em todo o tratamento para três experimentos independentes.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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<li>Hazan, R., Que, Y. -A., Maura, D., Rahme, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+high+throughput+determination+of+viable+bacteria+cell+counts+in+96-well+plates%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiology%22%5BJournal%5D)">A method for high throughput determination of viable bacteria cell counts in 96-well plates.</a> BMC Microbiology. 12 (1), 259(2012).</li>
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<li>Réglier-Poupet, H., Pellegrini, E., Charbit, A., Berche, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+LpeA%2C+a+PsaA-Like+membrane+protein+that+promotes+cell+entry+by+Listeria+monocytogenes%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+immunity%22%5BJournal%5D)">Identification of LpeA, a PsaA-Like membrane protein that promotes cell entry by Listeria monocytogenes.</a> Infection and immunity. 71 (1), 474-482 (2003).</li>
<li>Ortega, F. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adhesion+to+the+host+cell+surface+is+sufficient+to+mediate+Listeria+monocytogenes+entry+into+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Adhesion to the host cell surface is sufficient to mediate Listeria monocytogenes entry into epithelial cells.</a> Molecular Biology of the Cell. 28 (22), 2945-2957 (2017).</li>
</ol>

Todos os autores não têm conflitos de interesse para divulgar.

O protocolo descreve uma abordagem automatizada para enumerar o apego bacteriano às células hospedeiras. A abordagem descrita tem várias vantagens atraentes em relação aos métodos convencionais. Em primeiro lugar, essa abordagem permite a quantificação precisa do número de células de patógenos microbianas que estão ligadas a células hospedeiras individuais. É importante ressaltar que essa quantificação pode ser realizada sem a necessidade de colheita bacteriana laboriosa, diluições seriais, revestimento em mídia sólida e...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62764">Automated, High-Throughput Detection of Bacterial Adherence to Host Cells</a>. The Authors section was updated.
The Authors section was updated from:
Jing Yang1, Qing-Ming Qin1, Paul de Figueiredo1,2 
1Department of Microbial Pathogenesis and Immunology, Texas A&#38;M Health Science Center 
2Department of Veterinary Pathobiology, Texas A&#38;M College of Veterinary Medicine
to:
Jing Yang1, Qing-Ming Qin1, Erin Van Schaik1, James E. Samuel1, Paul de Figueiredo1,2 
1Department of Microbial Pathogenesis and Immunology, Texas A&#38;M Health Science Center 
2Department of Veterinary Pathobiology, Texas A&#38;M College of Veterinary Medicine

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62764">Automated, High-Throughput Detection of Bacterial Adherence to Host Cells</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Automated, High-Throughput Detection of Bacterial Adherence to Host Cells

A adesão bacteriana é um processo pelo qual as bactérias se ligam a outras células ou superfícies. O estabelecimento bem-sucedido de infecção por patógenos bacterianos requer adesão às células hospedeiras, colonização de tecidos e, em alguns casos, invasão de células hospedeiras1,2,3. As doenças infecciosas emergentes constituem grandes ameaças à saúde pública, como evidenciado pela recente pandemia COVID-194,5,6. É importante ressaltar que patógenos novos ou emergentes podem não ser facilmente discernidos usando abordagens genômicas, especialmente nos casos em que o patógeno foi projetado para escapar da detecção ou não contém assinaturas genômicas que o identificam como patogênico. Portanto, a identificação de potenciais patógenos utilizando métodos que avaliam diretamente marcas de patogenicidade, como a adesão bacteriana às células hospedeiras, pode desempenhar um papel crítico na identificação de patógenos.
A adesão bacteriana às células hospedeiras tem sido usada para avaliar mecanismos de patogênese bacteriana há décadas1,7. A imagem microscópica8,9 e a enumeração da unidade formadora de colônias bacterianas (UFC)10,11,12,13 por revestimento pós-infecção são dois métodos laboratoriais bem desenvolvidos para testar a adesão microbiana e/ou infecção das células hospedeiras14. Considerando o tamanho da escala de micrômetros das células bacterianas, a enumeração das células bacterianas aderentes geralmente requer o uso de técnicas avançadas de microscopia de alta ampliação, bem como abordagens de imagem de alta resolução, incluindo microscopia eletrônica, microscopia de expansão (ExM)15,16e imagem tridimensional17 . Alternativamente, a enumeração de bactérias vinculadas ou internalizadas dentro das células hospedeiras pode ser realizada emplacando a série de diluição de bactérias colhidas em ágar sólido e contando as CFUs resultantes10,12,13. Este método é trabalhoso e inclui muitas etapas manuais, o que introduz dificuldades no estabelecimento de um procedimento padronizado ou automatizado necessário para análises de alto rendimento18,19. Portanto, o desenvolvimento de novos métodos para avaliar o anexo de células hospedeiras abordaria as limitações atuais no campo.
Um desses métodos é descrito aqui que utiliza microscopia automatizada de alto rendimento, combinada com processamento de imagem de alto rendimento e análise estatística. Para demonstrar a abordagem, foram realizados experimentos com diversos patógenos bacterianos, incluindo Pseudomonas aeruginosa, um patógeno bacteriano gram-negativo oportunista de humanos, animais e plantas14,20, que é frequentemente encontrado para colonizar o trato respiratório de pacientes com funções de defesa hospedeiras prejudicadas. Essa abordagem otimou o processo de imagem microscópica descrito em estudos anteriores14,20. A detecção de imagens foi simplificada por células hospedeiras e bactérias rotuladas por fluorescência para rastrear rapidamente a proximidade delas, o que reduziu drasticamente a carga de trabalho de microscopia para obter imagens de alta resolução para distinguir bactérias. Além disso, a análise estatística automatizada de imagens na contagem de células hospedeiras e bactérias substituiu o experimento manual de revestimento de CFU bacteriano para estimar a razão da contagem bacteriana aderente por célula hospedeira. Para confirmar a compatibilidade deste método, também foram testadas múltiplas cepas bacterianas e tipos de células hospedeiras, como Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus e Klebsiella pneumoniae, bem como células endotelias de veia umbilicais humanas (HUVECs), e os resultados apoiam a diversidade e eficácia do método.

<table><tbody><tr><td>10x PBS</td><td>VWR</td><td>45001-130</td><td></td></tr><tr><td>4&prime;,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI)</td><td>Thermo Fisher</td><td>62248</td><td>Corante de coloração de célula hospedeira</td></tr><tr><td>96 poços</td><td>placa Corning</td><td>3882</td><td>Meia área bem, fundo plano</td></tr><tr><td>claro A549 células ATCC</td><td>&nbsp;</td><td>CCL 185</td><td>Linha celular de mamíferos</td></tr><tr><td>BactoView Live Red</td><td>Biotium</td><td>40101</td><td>Centrífuga de corante de bactérias</td></tr><tr><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CFSE rastreador de divisão celular</td><td>BioLegend</td><td>423801</td><td></td></tr><tr><td>Cytation 5&nbsp;</td><td>BioTek</td><td>Cytation 5&nbsp;</td><td>Leitor multimodo de imagem celular</td></tr><tr><td>E. coli</td><td></td><td></td><td>Estoque de laboratório&nbsp;</td></tr><tr><td>EGM bulletKit</td><td>Lonza</td><td>CC-3124</td><td>HUVEC meio de cultura de células</td></tr><tr><td>EHEC</td><td></td><td></td><td>NIST coleta</td></tr><tr><td>F-12k medium</td><td>ATCC&nbsp;</td><td>302004</td><td>A549 meio de cultura de células Soro</td></tr><tr><td>fetal bovino</td><td>Corning</td><td>35-016-CV</td><td></td></tr><tr><td>HUVEC</td><td></td><td></td><td>Estoque de laboratório&nbsp;</td></tr><tr><td>L. monocytogenes</td><td></td><td></td><td>Coleções NIST</td></tr><tr><td>OD600 Dilufotômetro</td><td>IMPLEN</td><td></td><td></td></tr><tr><td>P. aeruginosa</td><td></td><td></td><td>Dr. Lori Burrows estoque de laboratório</td></tr><tr><td>P. aeruginosa &Delta; pilA</td><td></td><td></td><td>Dr. Lori Burrows estoque de laboratório</td></tr><tr><td>S. agalactiae</td><td></td><td></td><td>Coleções NIST</td></tr><tr><td>S. aureus</td><td>BEI</td><td>NR-46543</td><td></td></tr><tr><td>S. aureus &Delta; saeR</td><td>BEI</td><td>NR-48164</td><td></td></tr><tr><td>Coleções de S. rubidaea</td><td></td><td></td><td>NIST</td></tr><tr><td>Caldo de soja típico</td><td>Growcells</td><td>MBPE-4040</td><td></td></tr></tbody></table>

detecção automatizada e de alto rendimento da adesão bacteriana às células hospedeiras

Automated, High-Throughput Detection of Bacterial Adherence to Host Cells

A identificação de patógenos bacterianos emergentes é fundamental para a saúde e segurança humana. A adesão bacteriana às células hospedeiras é um passo essencial em infecções bacterianas e constitui uma marca de ameaça potencial. Portanto, examinar a adesão de bactérias às células hospedeiras pode ser usado como um componente da avaliação de ameaças bacterianas. Um método padrão para enumerar a adesão bacteriana às células hospedeiras é co-incubar bactérias com células hospedeiras, colher as bactérias aderentes, emplacar as células colhidas em meios sólidos e, em seguida, contar as unidades de formação de colônias resultantes (UFC). Alternativamente, a adesão bacteriana às células hospedeiras pode ser avaliada usando abordagens baseadas em microscopia de imunofluorescência. No entanto, as estratégias convencionais para a implementação dessas abordagens são demoradas e ineficientes. Aqui, um método de imagem baseado em microscopia de fluorescência automatizada recentemente desenvolvido é descrito. Quando combinado com processamento de imagem de alto rendimento e análise estatística, o método permite quantificação rápida de bactérias que aderem às células hospedeiras. Duas espécies bacterianas, Pseudomonas aeruginosa gram-negativa e monocytogenes listeria gram-positiva e controles negativos correspondentes, foram testadas para demonstrar o protocolo. Os resultados mostram que essa abordagem enumera de forma rápida e precisa as bactérias aderentes e reduz significativamente as cargas de trabalho experimentais e cronogramas.

Para desenvolver o ensaio de adesão bacteriana baseada em imagem de fluorescência, p. aeruginosa cepa PAO1 e sua contraparte de adesão negativa E. coli foram usados para testar a eficácia do protocolo, uma vez que a adesão dessas bactérias às células A549 havia sido relatada14,20,22. Primeiro, a GFP, rotulada P. aeruginosa (PAO1) e E. coli, rotulada por GFP, foram co-incubadas com uma linha de...

A detecção de interações hospedeiras-bacterianas baseadas na adesão fenotípica usando imagens de rotulagem de fluorescência de alto rendimento, juntamente com métodos automatizados de análise estatística, permite uma avaliação rápida de possíveis interações bacterianas com células hospedeiras.

Detecção automatizada e de alto rendimento da adesão bacteriana às células hospedeiras

Identification of emerging bacterial pathogens is critical for human health and security. Bacterial adherence to host cells is an essential step in ...

Este método fornece uma rápida e alta detecção de adesão de bactérias às células hospedeiras. Em comparação com os métodos convencionais de revestimento, reduz o tempo prático necessário para a quantificação das bactérias aderentes. Esta técnica é automatizada, que economiza tempo e muito reproduzível.Também é amplamente aplicado tanto na maioria das células hospedeiras. Este método, é muito simples. Para o primeiro ensaio, as condições como a multiplicidade de infecção, e também o tempo de co-incubação de bactérias hospedeiras devem ser otimizadas.Primeiro colher as culturas bacterianas em uma fase exponencial por centrifugação a 13.000 vezes G por dois minutos à temperatura ambiente. Depois de lavar a paleta de células com um MILilitro PBS, resuspense a paleta bacteriana em um PBS mililitro. Determine as concentrações de suspensão bacteriana medindo a densidade óptica em 600 nanômetros.Em seguida, para colorir a suspensão bacteriana, adicione dois microliters do estoque concentrado de 500 vezes de corante verde ou vermelho em um mililitro de suspensão bacteriana para diluir o corante uma dobra. Incubar as células à temperatura ambiente por 30 minutos com rotação suave no escuro.

automated-high-throughput-detection-bacterial-adherence-to-host

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Este protocolo é um ensaio de adesão bacteriana simples que consiste na contagem do número de unidades formadoras de colônia de bactérias que são aderidos em células em cultura. O ensaio é robusto, independente da adesina estudado, e inúmeras variações são usadas na maioria dos laboratórios que trabalham com patogênese bacteriana.

Ensaio in vitro da adesão bacteriana em mamíferos Células Epiteliais

Durante o processo de infecção, um passo fundamental é a adesão de patógenos com células do hospedeiro. Na maioria dos casos esta etapa de adesão ocorre na presença de estresse mecânico gerado pelo fluxo de líquido. Descrevemos uma técnica que apresenta tensão de cisalhamento como um parâmetro importante no estudo da adesão bacteriana.

Apresentando tensão de cisalhamento em o Estudo da adesão bacteriana

A concepção de um operão que codifica tanto o aparelho sintético de secreção e os monómeros estruturais de curli fibras é descrito. A superprodução destas amilóides e polímeros aderentes permite um ganho mensurável de aderência...

Engenharia bactérias aderentes pela criação de um único sintético Curli Operon

Fonte: Stones, D. H., et al. Materiais biomiméticos para caracterizar as interações bactéria-hospedeiro. J. Vis. Exp. (2015)Este vídeo demonstra o uso de esferas bacteriomimiméticas para quantificar a adesão bacteriana às células epiteliais hospedeiras em condições competitivas. Ele descreve as etapas envolvidas no tratamento das células, lisando-as e plaqueando diluições em série para medir unidades formadoras de colônias.

Avaliação das interações bactéria-célula hospedeira usando esferas biomiméticas

Este vídeo demonstra o ensaio de aderência bacteriana para avaliar a adesão bacteriana marcada com GFP à cultura de células epiteliais para estudar a dinâmica das interações patógeno-hospedeiro usando imagens baseadas em microscopia de fluorescência.

Detecção de aderência bacteriana às células hospedeiras usando imagens de fluorescência

Este vídeo demonstra a coloração e preparação de células bacterianas para estudos imunológicos usando corante fluorescente vermelho. As bactérias coradas são diluídas e ressuspensas em um meio de crescimento para atingir a concentração bacteriana desejada para a infecção da célula hospedeira, representando a multiplicidade de infecção.

Coloração de células bacterianas e preparação para estudos imunológicos

Este vídeo demonstra um ensaio de opsono-aderência para examinar a interação entre bactérias opsonizadas e células imunes. Bactérias marcadas com fluorescência, tratadas com soro de teste contendo anticorpos anticápsula, são incubadas com macrófagos. Após a coloração dos macrófagos com fluorescência, as bactérias aderidas na superfície dos macrófagos são observadas ao microscópio para visualização.

Um ensaio de opsonidade para avaliar a opsonização de bactérias encapsuladas por anticorpos anticápsula

A ligação bacteriana às células hospedeiras é uma etapa fundamental durante a colonização e infecção do hospedeiro. Este protocolo descreve a geração de adesinas recombinantes acopladas a polímeros como materiais biomiméticos que permitem a análise da contribuição de adesinas individuais para esses processos, independentemente de outros fatores bacterianos.

Materiais biomiméticos para caracterizar as interações bactérias hospedeiras-

Dois ensaios para triagem de alto rendimento baseada em microscopia de fatores do hospedeiro envolvidos na infecção por Brucella são descritos. O ensaio de entrada detecta os fatores do hospedeiro necessários para a entrada de Brucella e o ensaio de endpoint aqueles necessários para a replicação intracelular. Embora aplicável para abordagens alternativas, a triagem de siRNA em células HeLa é usada para ilustrar os protocolos.

Os ensaios baseados em microscopia para high-throughput screening de Fatores Hospedeiros Envolvidos na<em&gt; Brucella</em&gt; A infecção de células HeLa

O ensaio opsono-adesão é um método alternativo ao ensaio opsono-fagocítico de matar para avaliar as funções opsônicas dos anticorpos no desenvolvimento de vacinas.

Ensaio opsono-adesão para avaliar anticorpos funcionais no desenvolvimento de vacinas contra bacillus anthracis e outros patógenos encapsulados

Aprenda a detectar adesão bacteriana às células hospedeiras com este método automatizado de alto rendimento. A técnica reduz o tempo manual e oferece resultados reprodutíveis para estudos de interações patógeno-hospedeiro.

Detecção automatizada e de alto rendimento da adesão bacteriana às células hospedeiras

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