Bioluminescente Optogenética 2.0: Aproveitamento da Bioluminescência para Ativar Proteínas Fotosensory In Vitro e In Vivo
4 de agosto de 2021
A luz de bioluminescência emitida por uma enzima luciferase oxidando um substrato de molécula pequena, uma luciferina pode ser aproveitada para ativar proteínas fotosensoriais, adicionando assim outra dimensão à estimulação da luz e permitindo a manipulação de uma infinidade de funções mediadas pela luz em células através de escalas temporais e espaciais.
1 (tons eletrônicos)A bioluminescente optogenética é uma tecnologia de plataforma na qual fontes de luz geneticamente codificadas podem visualizar e controlar funções biológicas e redes dentro e entre células. A bioluminescência atinge todos os domínios de sensoriamento de luz expressos na população celular-alvo sem qualquer dano tecidual e celular por fibra óptica e exposição prolongada à luz física. Para começar, comece a preparar o estoque de Luciferina dissolvendo cinco miligramas de CTZ liofilizado em 250 microliters de seu respectivo solvente.
Certifique-se de dissolução de CTZ ao longo das paredes por pipetação. Enquanto protege o frasco da luz direta, prepare 50 alíquotas de microliter em tubos de microcentrifusagem preto de 0,5 mililitro e armazene as alíquotas a menos 80 graus Celsius para uso futuro. Realize todas as outras manipulações em uma sala apertada em um capô de fluxo laminar iluminado pela luz vermelha.
Para realizar uma estimulação de luz de bioluminescência única, prepare uma solução de trabalho da Luciferina em um meio de cultura celular, pouco antes de adicionar às células em uma concentração final de 100 micromolar. Adicione o meio contendo luciferina às células e incubar para a duração desejada da estimulação da luz. Desligue a luz vermelha.
Depois de esperar alguns segundos até que os olhos se ajustem para completar a escuridão, monitore a emissão de luz olho a olho. Documente a emissão de luz tirando uma foto. Termine a estimulação da luz substituindo o meio contendo luciferina pelo meio de cultura, depois lave as células com o meio de cultura uma ou duas vezes para eliminar toda a Luciferina, dependendo da sensibilidade do experimento.
Para evitar a perda de células, coloque as células em pratos revestidos de PDL e incuba as células. Para realizar repetidas estimulações de luz de bioluminescência, configure a câmara de imagem celular viva criando um compartimento leve e apertado ao redor do microscópio de imagem celular ao vivo usando uma caixa e folhas pretas. Certifique-se de cobrir todas as fontes de luz presentes dentro da sala.
Configure o sistema de perfusão com a solução desejada para a entrada e a saída da câmara levando a um recipiente de resíduos. Dependendo do número de estimulações repetidas, aliquot a solução de imagem lúciferina preparada nos tubos de microcentrifuge. Coloque uma mancha de cobertura com células transfeinadas na câmara.
Enquanto a bomba estiver funcionando, remova o tubo de entrada da bomba do béquer de entrada. Imerque rapidamente o tubo de entrada na solução de Luciferina, mantendo o tempo de transição curto para evitar qualquer vazio de ar na tubulação. Assim que a solução de Luciferina for retomada, coloque o tubo de entrada de volta no béquer de entrada.
Repita a remoção e imersão do tubo de entrada em Luciferina quantas vezes for necessário nos intervalos de vários minutos a horas, dependendo do padrão fisiológico ao qual as células devem ser expostas. Em seguida, mantenha as células em um ambiente protegido pela luz por 16 a 24 horas para transcrição ou duração até que o efeito da estimulação da luz seja avaliado. Para realizar a ativação da bioluminescência in vivo, prepare a Luciferin tirando um frasco de CTZ a menos 80 graus Celsius, depois deixe-o aquecido à temperatura ambiente na área protegida pela luz.
Para cada frasco contendo 500 microgramas de CTZ, adicione 250 microliters de água estéril usando uma pipeta e coloque a rolha de borracha de volta no frasco. Incubar o frasco de vidro reconstituído em um banho de água temperado a 55 graus Celsius por alguns minutos para dissolver completamente o pó. Transfira a solução para um tubo de microcentrifuuagem preto e enxágue as paredes para recuperar todo o CTZ.
Depois de remover a quantidade de solução necessária, armazene a solução restante a quatro graus Celsius. Após a preparação, reconstituição e aliquotação do veículo de forma semelhante, preforme a estimulação da luz de bioluminescência removendo o volume de Luciferina ou veículo necessário para o tamanho do animal e rota de aplicação escolhida. Injete o animal com Lúciferina ou veículo conforme projetado.
Para a ativação recombina desejada durante um paradigma comportamental específico, injete o animal pouco antes do teste comportamental. Para transcrição afásica, injete o animal repetidamente ao longo dos dias e colete os dados da bioluminescência estimulada animal conforme projetado. O sistema de expressão regulado por luz rápida e atividade permitiu a transcrição do gene repórter com íons de cálcio intracelulares aumentados e luz.
O LED azul levou a uma forte fluorescência de repórteres e a expressão FLuc foi determinada por medidas de luminescência após a adição de Luciferina. Em um sistema de imagem in vivo, tanto led quanto CTZ aumentaram robustamente a expressão FLuc, enquanto a presença do componente fator de transcrição sozinho resultou em um sinal de fundo considerável, possivelmente devido à proteólise espontânea. A NanoLuc foi empregada para regulação optogênica através do fator de dimerização cry/CIB e transcrição fotossensível EL222.
A bioluminescência induzida pela adição de hCTZ às células HEK-293 e sua remoção após 15 minutos foi mais eficiente do que 20 minutos de exposição led para CRY/CIB e EL222. Não foram observadas diferenças significativas na eficácia da transcrição entre os dois sistemas quando co-transfeinadas com hCTZ, embora as proteínas de fusão de CRY/CIB fossem mais eficientes que el222. O CRY/CIB apresentou níveis de fundo consistentemente mais elevados em comparação com o EL222 independente da concentração de hCTZ.
A bioluminescência de uma recombinase de cre dividido fotoensiva baseada na proteína VVD LOV iCreV foi testada. Os resultados do aplicativo CTZ revelaram que a presença de CTZ aumentou robustamente a expressão em segundo plano e é semelhante à aplicação LED. O uso da bioluminescência para ativar não apenas fotorreceptores móveis de ferro, mas qualquer domínio fotosensor adiciona outra dimensão à estimulação da luz expandindo a manipulação das funções celulares através de escalas temporais e espaciais.
A optogenética bioluminescente tem sido aplicada em células e organismos modelo. Esses protocolos podem ser personalizados para testar uma ampla gama de hipóteses direcionadas in vitro e in vivo.
Visão Geral
A optogenética bioluminescente utiliza fontes de luz codificadas geneticamente para controlar funções biológicas sem danificar os tecidos. Este método permite a manipulação precisa de atividades celulares em diversas escalas.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Bioluminescência
- Optogenética
- Manipulação celular
Contexto
- A bioluminescência é produzida por enzimas luciferase que oxidam a luciferina.
- Essa tecnologia permite a estimulação luminosa de células sem exposição física à luz.
- Pode ser aplicada em ambientes tanto in vitro quanto in vivo.
- A estimulação luminosa pode ativar diversas funções e vias celulares.
Objetivo do Estudo
- Explorar o uso da bioluminescência para controlar funções celulares.
- Desenvolver protocolos para estimulação luminosa em diferentes configurações experimentais.
- Avaliar a eficiência da bioluminescência em comparação com métodos optogenéticos tradicionais.
Métodos Utilizados
- Preparação das soluções estoque e de trabalho de luciferina.
- Protocolos de estimulação luminosa bioluminescente única e repetida.
- Técnicas de ativação bioluminescente in vivo.
- Medição de luminescência e fluorescência em células transfectadas.
Resultados Principais
- A estimulação por bioluminescência ativa efetivamente as funções celulares.
- A adição de luciferina resultou em expressão robusta do gene repórter.
- A bioluminescência foi mais eficiente do que a exposição a LED para certas aplicações.
- As proteínas de fusão CRY/CIB apresentaram níveis de fundo mais altos do que EL222.
Conclusões
- A optogenética bioluminescente amplia as capacidades da estimulação luminosa.
- Este método pode ser personalizado para diversas hipóteses experimentais.
- Oferece uma abordagem não invasiva para manipular atividades celulares.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A optogenética bioluminescente permite a ativação precisa e não invasiva de proteínas fotossensoriais em sistemas tanto in vitro quanto in vivo, ampliando a caixa de ferramentas para a investigação funcional de vias celulares. Esta plataforma possibilita a manipulação orientada por hipóteses de processos celulares mediados pela luz, sem as limitações impostas pela entrega externa de luz, aumentando a confiança preditiva em estudos iniciais de descoberta e mecanicistas. Sua modularidade e compatibilidade com diversos domínios fotossensoriais a posicionam como uma capacidade reutilizável para a redução de riscos biológicos em todo o portfólio.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a investigação direta de vias sensíveis à luz e funções proteicas em contextos celulares nativos.
- Apóia a desmistificação mecanicista ao permitir a ativação controlada de eventos de sinalização, localização e transcrição.
- Facilita a validação funcional de alvos por meio do controle quimigenético de proteínas fotossensoriais.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Oferece entrega padronizada e reproduzível de luz por meio de sistemas luciferase-luciferina para o desenvolvimento de ensaios.
- Permite leituras quantitativas da expressão de genes repórter e ativação de vias.
- Permite triagem em larga escala de compostos ou perturbações genéticas em sistemas responsivos à luz.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Permite a manipulação in vivo de funções celulares em organismos modelo para estudos relevantes a doenças.
- Facilita o alinhamento de achados in vitro e in vivo por meio de protocolos consistentes de ativação bioluminescente.
- Apóia o avanço com ajuste de risco ao permitir estudos funcionais robustos e não invasivos em diversos modelos biológicos.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Esta tecnologia integra desde a descoberta inicial até a pesquisa pré-clínica, permitindo a testagem de hipóteses, a clarificação de vias e a validação funcional em modelos celulares e animais.
- Biologia da Descoberta: Apoia a ativação e medição direcionadas da função de proteínas fotossensoriais para elucidação de vias.
- Triagem: Fornece resultados quantitativos reprodutíveis para padronização de ensaios e avaliação de compostos.
- Análises: Oferece medições de luminiscência e fluorescência para comparar condições e resultados de ativação.
- Pesquisa Translacional: Conecta estudos in vitro e in vivo com estratégias de ativação consistentes para alinhamento de biomarcadores e função.
- Reutilização Empresarial: Oferece uma plataforma modular adaptável a diversos paradigmas experimentais e questões biológicas.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a ambiguidade mecanicista na validação de alvos.
- Valor Operacional: Aprimora a padronização, reprodutibilidade e escalabilidade de ensaios mediados por luz.
- Valor Estratégico: Melhora a tomada de decisões de avanço ou interrupção e a eficiência do capital ao permitir estudos funcionais robustos.
- Impacto na Carteira: Apoia a priorização e o avanço ajustados ao risco em múltiplos programas de descoberta.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em biologia molecular, optogenética e manipulação de células vivas ou animais.
- Necessita de acesso a sistemas de imagem de luminiscência e ambientes luminosos controlados.
- Exige padronização entre equipes na seleção de pares luciferase-luciferina e nos protocolos de ativação.
- Adaptável a diversos tipos celulares e organismos modelo mediante personalização do protocolo.
- É necessário considerar o sinal de fundo e a eficiência da fusão proteica para um desenho ideal do ensaio.
