Isolamento de Núcleos do Rim de Rato Adulto para Sequenciamento de RNA de Núcleo Único
September 20th, 2021
Aqui, apresentamos um protocolo para isolar núcleos de alta qualidade de rins de camundongos congelados que melhoram a representação de tipos de células renais medulares e evitam os artefatos de expressão gênica da dissociação do tecido enzimático.
Nosso método ajuda a gerar e entender dados de expressão gênica de tecidos complexos em um nível de célula única. Nosso método pode ser aplicado a basicamente qualquer tecido da mesma maneira e leva a dados de alta qualidade com muito poucos artefatos relacionados ao protocolo. A Dra. Janna Leiz e eu, do laboratório Schmidt-Ott, apresentaremos o protocolo.
Comece colocando o rim em uma placa de dissecação fria e use um bisturi afiado ou lâmina de barbear para obter uma fatia média de um a dois milímetros. Certifique-se de que a peça de tecido contém todo o eixo corticomedular. Use tesouras e pinças de microdissecação para aparar cuidadosamente o córtex dos lados da peça central.
Dentro da peça de tecido dissecada, os três segmentos córtex, medula externa e medula interna devem ser claramente visíveis. Transfira a peça renal para a solução de estabilização de RNA previamente preparada e incube por 24 horas a quatro graus Celsius para evitar a degradação do RNA. Após 24 horas, remova a solução de estabilização de RNA.
Retire cuidadosamente o excesso de solução com um papel de seda e guarde o tecido a menos 80 graus Celsius até uma nova utilização. Pegue a peça de rim congelada e transfira-a para uma placa de Petri de poliestireno pré-resfriada de 60 milímetros no gelo contendo um mililitro de Nuclei Lysis Buffer 1, ou NLB1. Pice os tecidos completamente usando uma lâmina de barbear ou bisturi.
Corte a ponta de uma ponta de pipeta de um mililitro e transfira o tecido picado e o tampão para o tubo do moedor colocado no gelo. Certificando-se de que todas as peças foram transferidas, lave a placa de Petri cinco a 10 vezes com o tampão. Mova lentamente o pilão A 25 vezes para cima e para baixo no tubo do moedor no gelo para homogeneizar a suspensão.
Passe o homogeneizado através de um filtro de 100 micrômetros em um tubo de coleta pré-resfriado de 15 mililitros no gelo e lave o filtro com outro mililitro de NLB1. Lave o tubo do moedor com o tampão de lise de núcleos EZ frio e descarte o tampão. Transfira o homogeneizado de volta para o tubo do moedor e mova lentamente o pilão B 15 vezes para cima e para baixo no tubo do moedor no gelo para homogeneizar a suspensão.
Transfira o homogeneizado para um tubo de coleta pré-resfriado de 15 mililitros no gelo. Lave o tubo do moedor com mais dois mililitros de NLB1 e certifique-se de transferir todos os fragmentos de tecido para o tubo de coleta. Incubar o homogeneizado por cinco minutos no gelo para lisar as células.
Passe o homogeneizado através de um filtro de 40 micrômetros em um tubo de coleta de 15 mililitros pré-resfriado. Gire o tubo de coleta por cinco minutos a 500 vezes G a quatro graus Celsius em uma centrífuga com um rotor de balde oscilante. Entretanto, adicione a solução inibidora da RNase ao NLB2.
Remova o sobrenadante sem perturbar o pellet. Ressuspeite cuidadosamente o pellet em quatro mililitros de NLB2. Cuidadosamente subposição na suspensão com uma almofada de um mililitro de tampão gradiente de sacarose.
Gire a suspensão a 500 vezes G por cinco minutos a quatro graus Celsius em uma centrífuga com um rotor de balde oscilante. Enquanto isso, adicione a solução inibidora da RNase ao tampão de suspensão dos núcleos. Após a centrifugação, remova suavemente o tubo de coleta da centrífuga, tomando cuidado para não perturbar as duas camadas ao manusear o tubo de coleta.
Os detritos celulares podem ser observados entre as duas camadas. Remova o sobrenadante com cuidado, começando com os detritos. Remova o sobrenadante restante sem perturbar o pellet de núcleos e ressuspenda cuidadosamente o pellet em um mililitro de buffer de suspensão de núcleos.
Passe o homogeneizado através de um filtro de 20 micrômetros para o tubo de coleta de coleta de classificação celular ativado por fluorescência de cinco mililitros pré-resfriado. O número de genes foi plotado contra o número de transcritos definidos por identificadores moleculares únicos e coloridos pela fração de leituras mitocondriais para avaliar a qualidade dos núcleos isolados. Um total de 20.000 genes foram detectados em 6.000 núcleos com 1.600 genes medianos e 2.800 identificadores moleculares únicos medianos por núcleo.
Os padrões de expressão gênica de marcadores enriquecidos com clusters foram visualizados usando um gráfico de pontos e agrupamentos de tipo celular em um gráfico de incorporação de vizinhos estocásticos distribuídos em t. A porcentagem de cada tipo de célula foi calculada e utilizada para determinar a razão entre o túbulo proximal e as células espessas dos membros ascendentes. É fundamental trabalhar a quatro graus Celsius em todos os momentos e determinar a quantidade ideal de tecido em ensaios para garantir suspensões de alta qualidade e concentrações ideais.
Visão Geral
Este artigo apresenta um protocolo para isolar núcleos de alta qualidade de rins de camundongos congelados, melhorando a representação dos tipos celulares renais medulares enquanto minimiza os artefatos de expressão gênica da dissociação enzimática.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia Celular
- Expressão Gênica
Fundamento
- Entender a expressão gênica em nível de célula única é crucial para estudar tecidos complexos.
- Métodos tradicionais podem introduzir artefatos que afetam a qualidade dos dados.
- Este protocolo visa fornecer uma alternativa confiável para o processamento de tecidos.
- É aplicável a vários tipos de tecido além dos rins.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um método para isolamento de núcleos de alta qualidade de rins de camundongos.
- Melhorar a precisão dos dados de expressão gênica dos tipos celulares renais.
- Reduzir artefatos relacionados ao protocolo na análise de expressão gênica.
Métodos Utilizados
- Dissecção de tecido renal congelado para obter uma amostra representativa.
- Uso de solução de estabilização de RNA para preservar a integridade do RNA.
- Homogenização e centrifugação para isolar núcleos.
- Avaliação da qualidade dos núcleos através da análise de expressão gênica.
Principais Resultados
- Um total de 20.000 genes foram detectados em 6.000 núcleos.
- Valores medianos de 1.600 genes e 2.800 identificadores moleculares únicos foram observados por núcleo.
- Padrões de expressão gênica foram visualizados usando gráficos de pontos e gráficos t-SNE.
- Relações de tipos celulares foram calculadas para analisar populações celulares renais.
Conclusões
- O protocolo efetivamente isola núcleos de alta qualidade de tecidos renais.
- Minimiza artefatos e melhora a confiabilidade dos dados de expressão gênica.
- Este método pode ser adaptado para uso com vários tipos de tecido.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
This protocol enables high-fidelity single-nucleus transcriptomics from frozen kidney tissue, addressing a key limitation in renal drug discovery where enzymatic dissociation biases cortical cell representation and obscures medullary targets. By preserving the corticomedullary axis and minimizing transcriptional stress, it improves target validation confidence for diuretic, fibrotic, and metabolic kidney disease programs. The method supports reproducible, scalable nuclei isolation for downstream screening and biomarker discovery in preclinical renal research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses across the full corticomedullary axis, reducing bias toward cortical cell types in target identification.
- Operational Value: Provides a standardized nuclei isolation workflow compatible with frozen biobanked samples, increasing sample availability for target de-risking.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates high-quality nuclei with low mitochondrial read fractions, supporting reliable single-nucleus RNA-seq for compound screening in kidney disease models.
- Operational Value: Delivers consistent nuclei yields (6,000 nuclei per sample) with median 1,600 genes and 2,800 UMIs per nucleus, enabling assay standardization across discovery campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates disease-relevant system modeling by capturing medullary cell populations critical for studying concentration-dependent drug effects in the kidney.
- Operational Value: Supports translational biomarker alignment by preserving native gene expression profiles without dissociation-induced artifacts.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from hypothesis-driven target validation to lead optimization, providing nuclei preparation for genomic screening in kidney disease models.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and mechanistic de-risking by enabling unbiased cell type profiling across cortex, outer medulla, and inner medulla.
- Screening: Delivers quantitative, reproducible nuclei isolation outputs suitable for high-throughput single-nucleus transcriptomic screening.
- Analytics: Provides gene expression readouts (UMI counts, mitochondrial fraction) and clustering data (t-SNE, dot plots) to compare treatment conditions and genetic perturbations.
- Translational Research: Connects discovery to preclinical continuity by maintaining corticomedullary architecture relevant to drug distribution and response.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable nuclei isolation platform applicable to multiple renal disease models and tissue archives.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target selection by reducing mechanistic ambiguity from dissociation bias and transcriptional artifacts.
- Operational Value: Enhances reproducibility and scalability through standardized, RNase-protected nuclei isolation from frozen tissue.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling comprehensive cell type profiling that reduces late-stage biological risk in renal programs.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization through improved representation of medullary targets in drug target atlases.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue handling, nuclei isolation, and single-nucleus RNA-seq library preparation.
- Dependent on access to cryostat, centrifuge with swinging-bucket rotor, RNase inhibitors, and gradient centrifugation equipment.
- Necessitates cross-team standardization of tissue dissection, freezing, and lysis protocols to ensure consistency across sites.
- Adaptation to other tissues requires optimization of dissection timing and lysis buffer conditions based on tissue density and RNAse sensitivity.
- Practical limitations include the need for RNA stabilization prior to freezing and careful gradient handling to avoid nuclei loss or debris contamination.
