Name: Isolamento de Núcleos do Rim de Rato Adulto para Sequenciamento de RNA de Núcleo Único (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min
Description: Aprenda a isolar núcleos de alta qualidade de rins congelados de camundongos adultos para sequenciamento de RNA de núcleo único. Este protocolo minimiza artefatos de expressão gênica e melhora a representação de tipos celulares da medula renal.

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Agradecemos à Plataforma de Genômica Científica do Centro Max Delbrück de Medicina Molecular da Associação Helmholtz, em Berlim, pelo apoio técnico.
JL e KMSO foram apoiados pelo Grupo de Formação em Investigação GRK 2318 da Fundação Alemã de Investigação (DFG) e pela Unidade de Investigação FOR 2841. A KMSO foi apoiada pelo Collaborative Research Grant 1365. A AB foi apoiada pelo financiamento do Prêmio Gottfried Wilhelm Leibniz da DFG concedido à NR.

Todos os experimentos em animais foram conduzidos de acordo com a Lei de Bem-Estar Animal (TierSchG) e o Regulamento de Bem-Estar Animal Experimental Animal (TierSchVersV) e foram autorizados pelas autoridades locais e pelos Oficiais de Bem-Estar Animal de nossa instituição (MDC).
1. Preparação de tecidos
<ol><li>Prepare uma placa de 6 poços contendo 2 mL de 1x solução salina tamponada com fosfato (PBS) por poço para cada rim que será obtido. Prepare uma placa de 6 poços contendo 2 mL de solução de estabilização de RNA por poço e rim. Pré-resfrie ambas as placas no gelo.</li>
	<li>Eutanasiar um rato macho C57BL/6 de 3 a 6 meses de idade. Coloque o rato em uma bandeja de dissecação, prenda as extremidades e esterilize o abdômen com etanol a 70%.</li>
	<li>Abra o abdômen até a caixa torácica usando fórceps e tesoura. Levante o intestino e outros órgãos para o lado e remova os rins cortando cuidadosamente o ureter, a artéria renal e a veia com uma tesoura. Lave o rim no PBS 1x gelado previamente preparado e remova a fáscia renal e qualquer gordura restante do rim até que todo o tecido branco seja removido (Figura 2A).</li>
	<li>Coloque o rim em uma placa de dissecação fria e use um bisturi afiado ou lâmina de barbear para obter uma fatia média de 1-2 mm. Certifique-se de que a peça de tecido contenha todo o eixo corticomedular (Figura 2B). Use tesouras e pinças de microdissecação para aparar cuidadosamente o córtex dos lados da peça central. Dentro da peça de tecido dissecada, os três segmentos córtex, medula externa e medula interna devem ser claramente visíveis (Figura 2C). NOTA: A fatia não deve exceder uma espessura de 2 mm ou um peso de 20 mg para garantir quantidades tampão suficientes para uma lise tecidual eficaz e para minimizar o ARN de fundo ambiente nas bibliotecas de cDNA. O RNA ambiente desperdiça a capacidade de sequência, pois não está associado a núcleos únicos.</li>
	<li>Transfira a peça renal para a solução de estabilização de RNA previamente preparada e incube por 24 h a 4 °C para evitar a degradação do RNA. Após 24 h, retirar a solução estabilizadora de ARN e conservar o tecido a -80 °C até nova utilização. Remova cuidadosamente o excesso de solução com papel de seda.</li>
</ol>2. Isolamento dos núcleos
<ol><li>Etapas de limpeza e preparação
	<ol><li>Limpe bancadas e pipetas com etanol a 70% e solução de descontaminação de RNase.</li>
		<li>Limpe um tubo moedor de tecido de fundo redondo de 2 mL e compatibilhe combinando pilão A e B com solução de descontaminação de RNase, seguido de etanol a 70% e água livre de RNase (1 tubo de moedor e pilão por amostra). Deixe secar completamente.</li>
		<li>Pré-arrefecer a centrífuga a 4 °C.</li>
		<li>Rotule e pré-resfrie três tubos de coleta de 15 mL, um tubo de coleta de 1,5 mL, um tubo de coleta de 5 mL de classificação celular ativada por fluorescência (FACS) e um tubo de moedor seco para cada amostra em gelo.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparação do buffer
	<ol><li>Aquecer a solução-mãe do complexo ribonucleosídeo-vanadilo a 65 °C até ser reconstituída numa solução límpida verde-preta de acordo com as instruções do fabricante. 11</li>
		<li>Preparar 1x PBS contendo 4% de albumina sérica bovina (BSA), conforme descrito na Tabela 1A. Além disso, preparar 1x PBS com 0,04% de BSA (Tabela 1B). Filtrar ambas as soluções utilizando um filtro de seringa de membrana de acetato de celulose (SFCA) isento de surfactante de 0,2 μm e manter no gelo até nova utilização.</li>
		<li>Prepare o tampão de lise de núcleos 1 (NLB1, Tabela 1C). Adicionar 4 mL de tampão de lise EZ para Nuclei Lysis Buffer 2 (NLB2, Tabela 1D) e 2 mL de 0,04% BSA/PBS para o Nuclei Suspension Buffer (NSB, Tabela 1E) a tubos de 15 mL. Adicione a solução inibidora de RNase ao NLB2 e NSB diretamente antes de usar, conforme indicado abaixo no protocolo. Mantenha no gelo até novo uso.</li>
		<li>Prepare o tampão de lise EZ com sacarose a 10% (Sucrose Gradient Buffer, Tabela 1F). Misture bem e filtre o tampão para um tubo fresco de 15 mL usando um filtro de seringa de membrana SFCA de 0,2 μm. Mantenha no gelo até novo uso.</li>
	</ol></li>
	<li>Homogeneização tecidual e lise celular NOTA: A fim de minimizar a degradação do RNA, todas as etapas são realizadas no gelo. O tubo do moedor, a placa de Petri e todos os tampões precisam ser pré-resfriados. Todas as etapas de ressuspensão são feitas pipetando cuidadosamente a suspensão dos núcleos. Não vortex a amostra para evitar forças de cisalhamento e danos aos núcleos.<ol><li>Pegue a peça de rim congelada e transfira-a para uma placa de Petri de poliestireno de 60 mm em gelo contendo 1 mL de NLB1.</li>
		<li>Pique bem o tecido usando uma lâmina de barbear ou bisturi (Figura 3A).</li>
		<li>Corte a ponta de uma ponta de pipeta de 1 mL e transfira o tecido picado e o tampão para o tubo do moedor. Certifique-se de transferir todas as peças de tecido. Lave a placa de Petri 5-10 vezes com o tampão, se necessário.</li>
		<li>Homogeneize a suspensão no gelo movendo lentamente o pilão A, 25x para cima e para baixo no tubo do moedor. Evite bolhas de ar causadas por movimentos rápidos (Figura 3B).</li>
		<li>Passar o homogeneizado através de um filtro de 100 μm em um tubo de coleta de 15 mL pré-resfriado e lavar o filtro com mais 1 mL de NLB1.</li>
		<li>Lave o tubo do moedor com o tampão de lise de núcleos EZ frio e descarte o tampão.</li>
		<li>Transfira o homogeneizado de volta para o tubo do moedor e homogeneize a suspensão no gelo movendo lentamente o pilão B, 15x para cima e para baixo no tubo do moedor. Evite bolhas de ar causadas por movimentos rápidos (Figura 3C).</li>
		<li>Transfira o homogeneizado para um tubo de coleta de 15 mL pré-resfriado. Lave o tubo moedor com mais 2 mL de NLB1 e certifique-se de transferir todos os fragmentos de tecido para o tubo de coleta. Incubar o homogeneizado (volume total de 4 mL) por 5 min no gelo para lisar as células.</li>
	</ol></li>
	<li>Purificação de núcleos
	<ol><li>Passar o homogeneizado através de um filtro de 40 μm para um tubo de recolha de 15 ml pré-arfriado. Gire o tubo de recolha durante 5 min a 500 x g a 4 °C numa centrífuga com um rotor de balde. Entretanto, adicione a solução inibidora da RNase ao NLB2 (Tabela 1D).</li>
		<li>Remova o sobrenadante sem perturbar o pellet. Ressuscite cuidadosamente o pellet em 4 mL de NLB2.</li>
		<li>Cuidadosamente submersa na suspensão com uma almofada de 1 ml de tampão gradiente de sacarose. Centrífuga a 500 x g durante 5 min a 4 °C numa centrífuga com rotor de balde. Entretanto, adicione a solução inibidora da RNase ao NSB (Tabela 1E).</li>
		<li>Após a centrifugação, remova suavemente o tubo de coleta da centrífuga e tenha cuidado para não perturbar as duas camadas ao manusear o tubo de coleta. Os detritos celulares são visíveis entre as duas camadas. Remova o sobrenadante cuidadosamente começando com os detritos. Remova o sobrenadante restante sem perturbar o pellet dos núcleos e ressuspenda cuidadosamente o pellet em 1 mL de NSB. NOTA: O volume de ressuspensão depende da quantidade de tecido utilizado para o isolamento e do tamanho do pellet ganho após a última etapa de centrifugação. O volume pode precisar ser adaptado ao número esperado de núcleos.</li>
		<li>Passar o homogeneizado através de um filtro de 20 μm para o tubo de recolha de FACS de 5 ml pré-arfriado.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Classificação de núcleos
<ol><li>Adicionar 20 μL de 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) por ml de NSB a uma concentração final de 2 μM ao homogeneizado no tubo de recolha de FACS e misturar cuidadosamente. Incubar por 5 min no gelo.</li>
	<li>Preparar o tubo de recolha de 1,5 ml pré-arrefecido com 20 μL de BSA a 4% /1x PBS e adicionar 0,5 μL de solução inibidora de RNase a uma concentração final de 1 U/μL. Proceder imediatamente à classificação.</li>
	<li>Classifique os núcleos usando um classificador de células.<ol><li>Misture brevemente a suspensão dos núcleos antes de inserir o tubo de recolha FACS no classificador.</li>
		<li>Defina uma primeira porta P1 com base no espalhamento para frente (FSC) e dispersão lateral (SSC) para excluir detritos e agregados (Figura 4A).</li>
		<li>Para excluir núcleos e múltiplos vazios ou danificados, defina uma porta subsequente com base na área DAPI VERSUS DAPI-Height (DAPI-A vs DAPI-H) (Figura 4B).</li>
		<li>Classificar núcleos únicos no tubo de coleta de 1,5 mL contendo BSA a 4% /1x PBS com solução inibidora de RNase 1 U/μL preparada em 3.2.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Controle de qualidade
<ol><li>Medir a concentração final de núcleos sob um microscópio de fluorescência ou em uma câmara de contagem automatizada em pelo menos duas contagens independentes e avaliar a qualidade da suspensão (Figura 5). NOTA: As concentrações ótimas estão entre 700 - 1.200 núcleos/μL. Concentrações celulares mais baixas, como 700 núcleos/μL, podem ser preferíveis, pois as bibliotecas de cDNA resultantes continham menos RNA de fundo ambiente (transcritos não associados a núcleos individuais).</li>
	<li>Calcular o volume necessário de suspensão de núcleos para a recuperação desejada de núcleos únicos sequenciados. A fim de evitar a agregação de núcleos e a degradação do RNA, proceda imediatamente à preparação da biblioteca.</li>
</ol>

<ol><li>Thomas, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kidney+modeling+and+systems+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdisciplinary+Reviews%3A+Systems+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Kidney modeling and systems physiology.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: Systems Biology and Medicine. 1 (2), 172-190 (2009).</li>
<li>Potter, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+RNA+sequencing+for+the+study+of+development%2C+physiology+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Single-cell RNA sequencing for the study of development, physiology and disease.</a> Nature Reviews Nephrology. 14 (8), 479-492 (2018).</li>
<li>Park, J., Liu, C. L., Kim, J., Susztak, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+the+kidney+one+cell+at+a+time%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">Understanding the kidney one cell at a time.</a> Kidney International. 96 (4), 862-870 (2019).</li>
<li>Clark, A. R., Greka, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+power+of+one%3A+advances+in+single-cell+genomics+in+the+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Nephrology%22%5BJournal%5D)">The power of one: advances in single-cell genomics in the kidney.</a> Nature Reviews Nephrology. 16 (2), 73-74 (2020).</li>
<li>Lake, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single-nucleus+RNA-sequencing+pipeline+to+decipher+the+molecular+anatomy+and+pathophysiology+of+human+kidneys%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">A single-nucleus RNA-sequencing pipeline to decipher the molecular anatomy and pathophysiology of human kidneys.</a> Nature Communications. 10 (1), 2832(2019).</li>
<li>Wu, H., Kirita, Y., Donnelly, E. L., Humphreys, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advantages+of+single-nucleus+over+single-cell+RNA+sequencing+of+adult+kidney%3A+Rare+cell+types+and+novel+cell+states+revealed+in+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Advantages of single-nucleus over single-cell RNA sequencing of adult kidney: Rare cell types and novel cell states revealed in fibrosis.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 30 (1), 23-32 (2019).</li>
<li>Adam, M., Potter, A. S., Potter, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Psychrophilic+proteases+dramatically+reduce+single-cell+RNA-seq+artifacts%3A+a+molecular+atlas+of+kidney+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Psychrophilic proteases dramatically reduce single-cell RNA-seq artifacts: a molecular atlas of kidney development.</a> Development. 144 (19), 3625-3632 (2017).</li>
<li>Habib, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massively+parallel+single-nucleus+RNA-seq+with+DroNc-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Massively parallel single-nucleus RNA-seq with DroNc-seq.</a> Nature Methods. 14 (10), 955-958 (2017).</li>
<li>Muto, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+transcriptional+and+chromatin+accessibility+profiling+redefine+cellular+heterogeneity+in+the+adult+human+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Single cell transcriptional and chromatin accessibility profiling redefine cellular heterogeneity in the adult human kidney.</a> Nature Communications. 12 (1), 2190(2021).</li>
<li>Hinze, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kidney+single-cell+transcriptomes+predict+spatial+corticomedullary+gene+expression+and+tissue+osmolality+gradients%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Kidney single-cell transcriptomes predict spatial corticomedullary gene expression and tissue osmolality gradients.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 32 (2), 291(2021).</li>
<li>Berger, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+cytoplasmic+RNA%3A+ribonucleoside-vanadyl+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Isolation of cytoplasmic RNA: ribonucleoside-vanadyl complexes.</a> Methods in Enzymology. 152, 227-234 (1987).</li>
<li>Butler, A., Hoffman, P., Smibert, P., Papalexi, E., Satija, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+single-cell+transcriptomic+data+across+different+conditions%2C+technologies%2C+and+species%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Integrating single-cell transcriptomic data across different conditions, technologies, and species.</a> Nature Biotechnology. 36 (5), 411-420 (2018).</li>
<li>Stuart, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+Integration+of+single-cell+data%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Comprehensive Integration of single-cell data.</a> Cell. 177 (7), 1888-1902 (2019).</li>
<li>Park, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcriptomics+of+the+mouse+kidney+reveals+potential+cellular+targets+of+kidney+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcriptomics of the mouse kidney reveals potential cellular targets of kidney disease.</a> Science. 360 (6390), 758-763 (2018).</li>
<li>Kirita, Y., Wu, H., Uchimura, K., Wilson, P. C., Humphreys, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+profiling+of+mouse+acute+kidney+injury+reveals+conserved+cellular+responses+to+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Cell profiling of mouse acute kidney injury reveals conserved cellular responses to injury.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (27), 15874-15883 (2020).</li>
<li>Schneeberger, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neuroinflammatory+interleukin-12+signaling+pathway+drives+Alzheimer%27s+disease-like+pathology+by+perturbing+oligodendrocyte+survival+and+neuronal+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">The neuroinflammatory interleukin-12 signaling pathway drives Alzheimer's disease-like pathology by perturbing oligodendrocyte survival and neuronal homeostasis.</a> bioRxiv. , 441313(2021).</li>
<li>Nguyen, Q. H., Pervolarakis, N., Nee, K., Kessenbrock, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((experimental+considerations+for+single-cell+RNA+sequencing+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">experimental considerations for single-cell RNA sequencing approaches.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 108(2018).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

A transcriptômica unicelular avança na compreensão da expressão gênica específica do tipo celular na fisiologia renal e na doença. Aqui, fornecemos um método simples e reprodutível para isolar núcleos únicos de alta qualidade do tecido renal de camundongo congelado para snRNA-seq de maneira padronizada.
Para o snRNA-seq, é fundamental usar núcleos de alta qualidade como entrada para a geração de bibliotecas e evitar a degradação do RNA durante o processamento tecidual. Portanto, a incubação de pedaços de tecido em solução de estabilização de RNA imediatamente após a dissecção é essencial para proteger e estabilizar o RNA celular e permite armazenar amostras a - 80 °C indefinidamente. Ao aplicar este protocolo a tecidos congelados sem tratamento com solução de estabilização de RNA, como material de arquivo, é necessário um ensaio clínico e a qualidade do RNA precisa ser avaliada, pois observamos uma perda significativa da integridade do RNA no tecido congelado sem incubação prévia na solução de estabilização de RNA.
Em geral, o manuseio adequado da amostra é crucial para maximizar a recuperação de núcleos únicos intactos. Todas as etapas de ressuspensão devem ser realizadas por pipetagem cuidadosa para evitar tensão de cisalhamento e danos físicos. Os tampões para a ressuspensão final dos núcleos e a classificação dos núcleos devem conter QUE para evitar a perda e agregação dos núcleos.
Os volumes tampão neste protocolo são otimizados para amostras de tecido muito pequenas (~15 mg). É fundamental garantir a lise celular completa e lavagem suficiente para gerar suspensões de alta qualidade. Blocos de tecido maiores ou amostras de rim inteiro resultarão em concentrações excessivas de núcleos que levam à aglomeração e agregação, alta abundância de RNA ambiente e má qualidade geral da suspensão. Se amostras maiores ou outros tecidos forem processados, é altamente recomendável realizar ensaios para determinar volumes de tampão ideais para níveis mínimos de RNA ambiente. A qualidade e as concentrações de núcleos e RNA precisam ser examinadas com cuidado, pois a sobrecarga resulta em um desempenho geral ruim.
Além disso, grandes quantidades de detritos celulares, causando altos níveis de RNA ambiente não associados a núcleos únicos, influenciam negativamente os resultados do sequenciamento. O esclarecimento da suspensão dos núcleos por centrifugação através de uma almofada de sacarose atenua esse problema até certo ponto, mas também pode levar a um viés na representação do tipo celular, contra-selecionando contra núcleos densos e pequenos presentes, por exemplo, em células imunes16. Se isso for preocupante, o gradiente de sacarose deve ser omitido. Por outro lado, descobrimos que a citometria de fluxo baseada na coloração DAPI foi fundamental para reduzir a quantidade de detritos celulares, a fim de produzir uma suspensão de núcleos únicos de alta qualidade.
O isolamento de núcleos únicos tem vantagens consideráveis quando comparado às abordagens unicelulares8. É compatível com tecido adequadamente congelado, tornando a coleção tecidual mais flexível, e contorna a necessidade de dissociação tecidual baseada em enzimas, o que pode introduzir respostas transcricionais ao estresse 6,17. Além disso, supera o viés de dissociação que favorece a seleção de tipos celulares facilmente dissociáveis do córtex renal, o que pode levar a uma sub-representação dos tipos de células medulares em algumas abordagens enzimáticas 5,6,10.
O uso de uma peça renal central em vez de tecido renal inteiro economiza ainda mais recursos e corrige a super-representação de tipos de células abundantes, conforme descrito anteriormente10. No entanto, dependendo do modelo de camundongo ou fenótipo investigado, pode ser benéfico usar amostras de rim inteiras em vez de uma única fatia média. Amostras de rim inteiro podem ser mais representativas de proporções de células verdadeiras, ou alterações que ocorrem em todo o rim, enquanto um corte médio aparado mostrou-se vantajoso para fenótipos medulares ou quando o material da amostra foi limitado. Essa decisão, portanto, é altamente específica do usuário e deve ser considerada com cuidado.

Os rins exibem uma arquitetura de tecido altamente complexa. Consistem em segmentos funcional e anatomicamente distintos ao longo de um eixo corticomedular e mediam funções biológicas, como regulação do volume de líquido extracelular, equilíbrio eletrolítico ou homeostase ácido-base1.
Os avanços na transcriptômica unicelular permitiram a caracterização aprofundada de tecidos complexos e aceleraram a compreensão da expressão gênica específica do segmento e do tipo celular na fisiologia, desenvolvimento e doença renal 2,3,4.
No entanto, os protocolos de dissociação baseados em enzimas que são frequentemente utilizados para scRNA-seq exibem várias desvantagens e restrições. Dependendo do protocolo, geram respostas transcricionais ao estresse e viés de dissociação tecidual em direção a tipos de células corticais mais fáceis de dissociar 5,6. Embora os protocolos que utilizam proteases ativas a frio para rins embrionários sejam capazes de mitigar as alterações transcricionais relacionadas ao estresse, eles não conseguem superar o viés de dissociação em relação às células corticais e podem não ser facilmente adaptáveis a diferentes tipos de tecidos renais doentes7. Além disso, as abordagens unicelulares não são facilmente compatíveis com amostras de tecido congelado, limitando sua aplicação principalmente a tecidos frescos e não arquivados, tornando a coleta de tecidos um fator restritivo6.
O sequenciamento de RNA de núcleos únicos (snRNA-seq) pode contornar essas limitações 8,9. Aqui, apresentamos um protocolo para isolamento de núcleos de um corte central de tecido renal adulto de camundongo congelado (Figura 1)10. Nosso protocolo é simples e fornece uma abordagem padronizada para obter bibliotecas de sequenciamento de RNA com uma representação equilibrada de diversos tipos de células renais para modelos experimentais que não envolvem fortes alterações teciduais regionais. Neste último caso, nosso protocolo também pode ser realizado com rins inteiros.

<table><tbody><tr><td>Classificador de células</td> <td>-</td><td></td> <td>Para classificação de células ativadas por fluorescência (FACS); por exemplo, BD FACSAria Cell Sorter.</td></tr><tr><td>Centrífuga 5810</td><td>R Eppendorf</td><td>5811000015</td><td></td></tr><tr><td>Countess Cell Counting Chamber Slides</td><td>Invitrogen</td><td>C10228</td><td></td></tr><tr><td>Countess II FL Contador de Células Automatizado</td><td>Invitrogen</td><td>AMQAF1000</td><td>Precisa conter cubo de luz DAPI para contar núcleos. Alternativamente, os núcleos podem ser contados manualmente sob microscópio de fluorescência.</td></tr><tr><td>4&prime;,6-Diamidino-2-fenil-indol-di-cloridrato (DAPI)</td><td>Biotrend</td><td>40043/b</td><td>Solução estoque preparada com uma concentração de 100 &micro;M. Usado para coloração de núcleos em uma concentração final de 2 &micro;M.</td></tr><tr><td>D(+)-Sacarose &ge; 99,9%, ultrapuro DNAse-, RNAse-free</td><td>VWR</td><td>0335-500G</td><td></td></tr><tr><td>DNA LoBind Microcentrifuge Tubes (1,5 mL)</td><td>Eppendorf</td><td>22431021</td><td></td></tr><tr><td>Etanol, 70 %</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>FACS tubes</td><td>pluriSelect</td><td>43-10100-46</td><td></td></tr><tr><td>Conjunto de moedor de tecidos KIMBLE Dounce 2 mL completo</td> Filtros de seringa Minisart <td>Sigma-Aldrich</td><td>D8938-1SET</td><td></td></tr><tr><td> 0,2 &micro; m</td><td>Sartorius</td><td>16534-GUK</td><td></td></tr><tr><td>Água sem nuclease</td><td>Invitrogen</td><td>AM9937</td><td></td></tr><tr><td>Nuclei EZ Prep Kit de isolamento de núcleos</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>NUC-101</td><td>Nuclei EZ Lysis Buffer (Produto nº N3408) necessário para a preparação do tampão.</td></tr><tr><td>PBS (Phosphate-Buffered Saline) 1X sem cálcio ou magnésio</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Placas de Petri, poliestireno 60 mm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5481</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate-Buffered Saline (PBS) com 10% de Albumina Bovina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SRE0036</td><td></td></tr><tr><td>pluriStrainer Mini 100 &micro; m</td><td>pluriSelect</td><td>43-10100-46</td><td></td></tr><tr><td>pluriStrainer Mini 20 &micro; m</td><td>pluriSelect</td><td>43-10020-40</td><td></td></tr><tr><td>pluriStrainer Mini 40 &micro; m</td><td>pluriSelect</td><td>43-10040-40</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de Centrífuga de Poliestireno (15 mL)</td>Lâminas <td>de</td> barbear <td>Falcon</td> 352099<td></td></tr>-<tr><td></td><td></td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Inibidor de RNase RiboLock (40 U/&micro; L)</td> <td>Thermo Fisher</td><td>EO0384</td><td></td></tr><tr><td>Complexo ribonucleosídeo-vanadil</td><td>New England Biolabs</td><td>S1402S</td><td>Siga as instruções do fabricante (https://international.neb.com/products/s1402-ribonucleoside-vanadyl-complex#Product%20Information). Após a utilização, a solução-mãe a 200 mM é reconstituída numa solução límpida verde-escura por incubação a 65 °C.</td></tr><tr><td>Solução de estabilização de RNAlater</td><td>Invitrogen</td><td>AM7020</td><td></td></tr><tr><td>RNase AWAY</td><td>Fisher Scientific</td><td>11952385</td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento de núcleos do rim de rato adulto para sequenciamento de rna de núcleo Único

Nuclei Isolation from Adult Mouse Kidney for Single-Nucleus RNA-Sequencing

Os rins regulam diversos processos biológicos, como água, eletrólito e homeostase ácido-base. As funções fisiológicas do rim são executadas por vários tipos de células dispostas em uma arquitetura complexa em todo o eixo corticomedular do órgão. Avanços recentes na transcriptômica unicelular aceleraram a compreensão da expressão gênica específica do tipo celular na fisiologia renal e na doença. No entanto, os protocolos de dissociação tecidual baseados em enzimas, que são frequentemente utilizados para sequenciamento de RNA de célula única (scRNA-seq), requerem principalmente tecido fresco (não arquivado), introduzem respostas de estresse transcricional e favorecem a seleção de tipos celulares abundantes do córtex renal, resultando em uma sub-representação das células da medula.
Aqui, apresentamos um protocolo que evita esses problemas. O protocolo baseia-se no isolamento de núcleos a 4 °C do tecido renal congelado. Os núcleos são isolados de uma peça central do rim do rato composta pelo córtex, medula externa e medula interna. Isso reduz a super-representação de células corticais típicas de amostras de rim inteiro para o benefício de células medulares, de modo que os dados representarão todo o eixo corticomedular em abundância suficiente. O protocolo é simples, rápido e adaptável e fornece um passo em direção à padronização da transcriptômica de núcleos únicos na pesquisa renal.

Para determinar o desempenho do nosso protocolo, utilizamos o 10x Genomics Chromium Single Cell 3' Gene Expression Kit v3.1 para a preparação da biblioteca e analisamos os dados de snRNA-seq com o pacote Seurat12,13.
A Figura 6 mostra os resultados de uma biblioteca snRNA-seq representativa. Para avaliar a qualidade de nossos núcleos, plotamos o número de genes contra o número de transcritos (definidos por identificadores moleculares únicos (UMIs)) coloridos pela fração de leituras mitocondriais (Figura 6A). Núcleos de boa qualidade geralmente apresentam maior número de leituras, correlacionando UMI e números de genes, e baixas frações de leitura mitocondrial.
Para a análise subsequente, foram excluídos núcleos com menos de 500 ou mais de 4000 genes contados, ou mais de 5% de RNA mitocondrial (n = 828). Apenas genes expressos em um mínimo de três núcleos foram incluídos. Detectamos cerca de 20.000 genes no total nos 6.000 núcleos restantes, com 1.600 genes medianos e 2.800 UMIs medianas por núcleo (Figura 6B).
O agrupamento foi baseado em genes altamente variáveis. Identificamos um total de 18 clusters. As identidades celulares foram anotadas com base em genes marcadores conhecidos (não mostrados). Subaglomerados de um tipo de célula foram resumidos em um aglomerado, resultando em um total de 11 tipos celulares distintos: podócitos, túbulo proximal (TP), membro fino (tL), membro ascendente espesso (TAL), túbulo contorcido distal (DCT), túbulo de conexão (CNT), ducto coletor principal e células intercaladas (CD-PC, A-IC, B-IC), epitélio medular profundo da pelve (DMEP) e endotélio. Os padrões de expressão gênica de marcadores enriquecidos com clusters foram visualizados em um gráfico de pontos (Figura 6C) e os clusters de tipo celular em um gráfico de incorporação de vizinhos estocásticos distribuídos em t (t-SNE) (Figura 6D).
Para avaliar as distribuições do tipo celular em nossa amostra, a porcentagem de cada tipo de célula foi calculada (Figura 6E) e utilizada para determinar a razão entre TP e TAL. O TP está localizado principalmente no córtex renal e frequentemente super-representado em conjuntos de dados de célula única renal, pois as células do PT são fáceis de dissociar e altamente abundantes em amostras renais inteiras. O TAL, por outro lado, estende-se por toda a medula externa14. Assim, a razão das frações PT e TAL representa uma boa medida para o enriquecimento dos tipos de células medulares em um conjunto de dados de célula única renal. Em geral, a relação PT/TAL em conjuntos de dados de rim inteiro unicelular variou de 8 (dados não publicados de tecido renal inteiro tratado com protease a frio) a 45 para tecido dissociado enzimaticamente10,14,15. No conjunto de dados snRNA-seq aqui apresentado foi possível atingir uma relação PT/TAL de 2. Este resultado ilustra que a remoção do excesso de córtex durante a dissecção tecidual combinada com snRNA-seq resulta em uma representação do tipo de célula renal notavelmente melhorada.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62901/62901fig01.jpg"> Figura 1: Visão geral esquemática do fluxo de trabalho. O protocolo consiste em quatro etapas principais que incluem dissecção tecidual seguida de isolamento de núcleos, classificação de núcleos e uma avaliação final de pureza e concentração. Barra de escala = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62901/62901fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62901/62901fig02.jpg"> Figura 2: Dissecção renal e preparo tecidual . (A) Imagem representativa de todo o rim dissecado. As linhas pontilhadas indicam os cortes necessários para obter uma fatia média de 1-2 mm com uma representação de todos os tipos de células renais. (B) Imagem representativa da fatia média obtida. As linhas pontilhadas indicam os cortes para o corte do córtex do lado. (C) Imagem representativa da peça renal central com córtex aparado. O córtex (C), a medula externa (MO) e a medula interna (IM) são claramente visíveis. Barra de escala = 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62901/62901fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62901/62901fig03.jpg"> Figura 3: Homogeneização tecidual e purificação de núcleos . (A) Imagem representativa mostrando tecido renal suficientemente picado. Barra de escala = 500 μm. (B) Homogeneizado após a primeira etapa de homogeneização (25 braçadas com pilão A, tubo moedor de 2 mL). (C) Homogeneizado após segunda etapa de homogeneização (15 braçadas com pilão B, tubo moedor de 2 mL). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62901/62901fig03large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62901/62901fig04.jpg"> Figura 4: Estratégia de bloqueio para classificação de núcleos. (A ) Uma primeira porta P1 foi definida com base na dispersão dianteira (FSC) vs dispersão lateral (SSC) para excluir detritos e agregados. (B ) Uma porta subsequente baseada em DAPI-Área (DAPI-A) vs DAPI-Altura (DAPI-H) excluiu núcleos e múltiplos vazios ou danificados. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62901/62901fig04large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62901/62901fig05.jpg"> Figura 5: Suspensão dos núcleos antes e depois da classificação dos núcleos. (A, C) Núcleos corados com DAPI (azul). (B, D) Sobreposição de DAPI e canal de campo brilhante (BF). Antes da classificação (painel superior), a suspensão de núcleos contém detritos celulares e agregados (rotulados com pontas de seta brancas). Após a classificação (painel inferior) a suspensão dos núcleos parece muito mais limpa. Exemplos de núcleos corados com DAPI são rotulados com pontas de seta pretas. Núcleos de boa qualidade aparecem redondos e lisos com uma membrana intacta e são bem separados, enquanto núcleos de baixa qualidade parecem enrugados e apresentam perda da membrana nuclear. Barra de escala = 250 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62901/62901fig05large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62901/62901fig06.jpg"> Figura 6: Controle de qualidade e análise de um conjunto de dados snRNA-seq representativo. (A) Número de genes (nGene) plotados contra o número de identificadores moleculares únicos (nUMI) coloridos pela fração de leituras mitocondriais (percent.mt). Núcleos de baixa qualidade correspondem ao quadrante inferior esquerdo da parcela (n = 828) e foram excluídos da análise subsequente. (B) Distribuição e mediana de nGene e nUMI detectados por núcleo no conjunto de dados snRNA-seq, representando 6.177 núcleos (&gt; 500 genes). As bibliotecas foram sequenciadas a uma profundidade mediana de ~ 8.200 leituras mapeadas por núcleo. (C) Gráfico de pontos mostrando padrões de expressão gênica de marcadores enriquecidos com aglomerados (eixo x) para tipos de células individuais (eixo y). O tamanho do ponto corresponde à proporção de células que expressam o gene indicado. A cor corresponde à expressão média. (D) Gráfico de incorporação de vizinhos estocásticos distribuídos por T (t-SNE) de tipos de células identificados. (E) Distribuição do tipo de célula no conjunto de dados snRNA-seq. TP, túbulo proximal; tL, membro fino; TAL, membro ascendente espesso, DCT, túbulo contorcido distal; CNT, túbulo de conexão; CD-PC, células principais do ducto coletor; A-IC, células intercaladas do tipo A; B-IC, células intercaladas do tipo B; DMEP, epitélio medular profundo da pelve. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62901/62901fig06large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="3">Reagente</td>
			<td>Concentração final</td>
			<td>Volume (mL)</td>
		</tr><tr><td colspan="3">(A) 4 % BSA / PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td colspan="3">Salina tamponada com fosfato (PBS) com 10% de albumina bovina</td>
			<td>4%</td>
			<td>2</td>
		</tr><tr><td colspan="3">PBS (Phosphate-Buffered Saline) 1X sem cálcio ou magnésio</td>
			<td>-</td>
			<td>3</td>
		</tr><tr><td colspan="3">(B) 0,04 % BSA / PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td colspan="3">4 % BSA / PBS</td>
			<td>0.04 %</td>
			<td>0.5</td>
		</tr><tr><td colspan="3">PBS (Phosphate-Buffered Saline) 1X sem cálcio ou magnésio</td>
			<td>-</td>
			<td>49.5</td>
		</tr><tr><td colspan="3">(C) Núcleo Lysis Buffer 1 (NLB1)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td colspan="3">Tampão de lise EZ nuclear</td>
			<td>-</td>
			<td>4</td>
		</tr><tr><td colspan="3">Inibidor da RNase RiboLock (40 U/μL)</td>
			<td>1 U/μL</td>
			<td>0.1</td>
		</tr><tr><td colspan="3">Complexo ribonucleosídeo-vanadilo (200 mM)</td>
			<td>10 mM</td>
			<td>0.2</td>
		</tr><tr><td colspan="3">(D) Núcleo Lysis Buffer 2 (NLB2)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td colspan="3">Tampão de lise EZ nuclear</td>
			<td>-</td>
			<td>4</td>
		</tr><tr><td colspan="3">Inibidor da RNase RiboLock (40 U/μL)</td>
			<td>1 U/μL</td>
			<td>0.1</td>
		</tr><tr><td colspan="3">(E) Buffer de Suspensão de Núcleos (NSB)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td colspan="3">0,04 % BSA / PBS</td>
			<td>-</td>
			<td>2</td>
		</tr><tr><td colspan="3">Inibidor da RNase RiboLock (40 U/μL)</td>
			<td>1 U/μL</td>
			<td>0.05</td>
		</tr><tr><td colspan="3">F) Tampão gradiente de sacarose (10 % de sacarose)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td colspan="3">Peso 1 g de sacarose</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td colspan="3">Dissolver em 6 ml de tampão nuclear de lise EZ</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td colspan="3">Encha até 10 mL com Nuclear EZ Lysis Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td colspan="3">Filtrar através de um filtro de seringa de 0,2 μm para um tubo fresco</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr></tbody></table>Tabela 1: Receitas da solução: (A) Preparação de 4% BSA/1x PBS. Filtrar utilizando um filtro de seringa de membrana SFCA de 0,2 μm e manter no gelo até à sua utilização. (B) Preparação de 0,04% BSA/1 x PBS. Filtrar utilizando um filtro de seringa de membrana SFCA de 0,2 μm e manter no gelo até à sua utilização. (C) Preparação do Núcleo Lysis Buffer 1 (NLB1). Os volumes indicados são fornecidos por amostra. Mantenha no gelo até o uso. (D) Preparação do Buffer de Lise de Núcleos 2 (NLB2). Os volumes indicados são fornecidos por amostra. Adicione o Inibidor de RNase RiboLock ao NLB2 diretamente antes de usar, conforme observado no protocolo. Mantenha no gelo até o uso. (E) Preparação do Buffer de Suspensão de Núcleos (NSB). Os volumes indicados são fornecidos por amostra. Adicione o Inibidor de RNase RiboLock ao NSB diretamente antes do uso, conforme observado no protocolo. Mantenha no gelo até o uso. (F) Preparação de tampão gradiente de sacarose. Filtrar utilizando um filtro de seringa de membrana SFCA de 0,2 μm e manter no gelo até à sua utilização.

Aqui, apresentamos um protocolo para isolar núcleos de alta qualidade de rins de camundongos congelados que melhoram a representação de tipos de células renais medulares e evitam os artefatos de expressão gênica da dissociação do tecido enzimático.

Isolamento de Núcleos do Rim de Rato Adulto para Sequenciamento de RNA de Núcleo Único

The kidneys regulate diverse biological processes such as water, electrolyte, and acid-base homeostasis. Physiological functions of the kidney are ...

Nosso método ajuda a gerar e entender dados de expressão gênica de tecidos complexos em um nível de célula única. Nosso método pode ser aplicado a basicamente qualquer tecido da mesma maneira e leva a dados de alta qualidade com muito poucos artefatos relacionados ao protocolo. A Dra. Janna Leiz e eu, do laboratório Schmidt-Ott, apresentaremos o protocolo.Comece colocando o rim em uma placa de dissecação fria e use um bisturi afiado ou lâmina de barbear para obter uma fatia média de um a dois milímetros. Certifique-se de que a peça de tecido contém todo o eixo corticomedular. Use tesouras e pinças de microdissecação para aparar cuidadosamente o córtex dos lados da peça central.Dentro da peça de tecido dissecada, os três segmentos córtex, medula externa e medula interna devem ser claramente visíveis. Transfira a peça renal para a solução de estabilização de RNA previamente preparada e incube por 24 horas a quatro graus Celsius para evitar a degradação do RNA. Após 24 horas, remova a solução de estabilização de RNA.Retire cuidadosamente o excesso de solução com um papel de seda e guarde o tecido a menos 80 graus Celsius até uma nova utilização. Pegue a peça de rim congelada e transfira-a para uma placa de Petri de poliestireno pré-resfriada de 60 milímetros no gelo contendo um mililitro de Nuclei Lysis Buffer 1, ou NLB1. Pice os tecidos completamente usando uma lâmina de barbear ou bisturi.Corte a ponta de uma ponta de pipeta de um mililitro e transfira o tecido picado e o tampão para o tubo do moedor colocado no gelo. Certificando-se de que todas as peças foram transferidas, lave a placa de Petri cinco a 10 vezes com o tampão. Mova lentamente o pilão A 25 vezes para cima e para baixo no tubo do moedor no gelo para homogeneizar a suspensão.Passe o homogeneizado através de um filtro de 100 micrômetros em um tubo de coleta pré-resfriado de 15 mililitros no gelo e lave o filtro com outro mililitro de NLB1. Lave o tubo do moedor com o tampão de lise de núcleos EZ frio e descarte o tampão. Transfira o homogeneizado de volta para o tubo do moedor e mova lentamente o pilão B 15 vezes para cima e para baixo no tubo do moedor no gelo para homogeneizar a suspensão.Transfira o homogeneizado para um tubo de coleta pré-resfriado de 15 mililitros no gelo. Lave o tubo do moedor com mais dois mililitros de NLB1 e certifique-se de transferir todos os fragmentos de tecido para o tubo de coleta. Incubar o homogeneizado por cinco minutos no gelo para lisar as células.Passe o homogeneizado através de um filtro de 40 micrômetros em um tubo de coleta de 15 mililitros pré-resfriado. Gire o tubo de coleta por cinco minutos a 500 vezes G a quatro graus Celsius em uma centrífuga com um rotor de balde oscilante. Entretanto, adicione a solução inibidora da RNase ao NLB2.Remova o sobrenadante sem perturbar o pellet. Ressuspeite cuidadosamente o pellet em quatro mililitros de NLB2. Cuidadosamente subposição na suspensão com uma almofada de um mililitro de tampão gradiente de sacarose.Gire a suspensão a 500 vezes G por cinco minutos a quatro graus Celsius em uma centrífuga com um rotor de balde oscilante. Enquanto isso, adicione a solução inibidora da RNase ao tampão de suspensão dos núcleos. Após a centrifugação, remova suavemente o tubo de coleta da centrífuga, tomando cuidado para não perturbar as duas camadas ao manusear o tubo de coleta.Os detritos celulares podem ser observados entre as duas camadas. Remova o sobrenadante com cuidado, começando com os detritos. Remova o sobrenadante restante sem perturbar o pellet de núcleos e ressuspenda cuidadosamente o pellet em um mililitro de buffer de suspensão de núcleos.Passe o homogeneizado através de um filtro de 20 micrômetros para o tubo de coleta de coleta de classificação celular ativado por fluorescência de cinco mililitros pré-resfriado. O número de genes foi plotado contra o número de transcritos definidos por identificadores moleculares únicos e coloridos pela fração de leituras mitocondriais para avaliar a qualidade dos núcleos isolados. Um total de 20.000 genes foram detectados em 6.000 núcleos com 1.600 genes medianos e 2.800 identificadores moleculares únicos medianos por núcleo.Os padrões de expressão gênica de marcadores enriquecidos com clusters foram visualizados usando um gráfico de pontos e agrupamentos de tipo celular em um gráfico de incorporação de vizinhos estocásticos distribuídos em t. A porcentagem de cada tipo de célula foi calculada e utilizada para determinar a razão entre o túbulo proximal e as células espessas dos membros ascendentes. É fundamental trabalhar a quatro graus Celsius em todos os momentos e determinar a quantidade ideal de tecido em ensaios para garantir suspensões de alta qualidade e concentrações ideais.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Aqui, apresentamos um protocolo para isolar rapidamente núcleos de alta qualidade do tecido fresco ou congelado para a sequenciação do ARN maciçamente paralelo a jusante. Inclui opções de Lise rompimento e célula tecido detergente-mecânica e hipotônica-mecânico, ambos dos quais podem ser usados para isolamento dos núcleos.

Isolamento dos núcleos de adultos da medula espinhal para a sequenciação do ARN de Single-núcleo maciçamente paralelo

O isolamento de núcleos únicos depende da dissociação e da permeabilização baseada em detergente da membrana celular, passos que precisam de otimização e são propensos a introduzir artefatos técnicos. Demonstramos um protocolo detergente e sem enzimas para o rápido isolamento de núcleos intactos diretamente de todo o tecido, produzindo núcleos adequados para RNA-seq de núcleo único (snRNA-Seq) ou ATAC-seq.

Isolamento de núcleos de tecido inteiro usando um método detergente e sem enzimas

A heterogeneidade intra-tumoral é uma característica inerente aos tumores, incluindo gliomas. Desenvolvemos um protocolo simples e eficiente que utiliza uma combinação de buffers e centrífugas gradientes para isolar núcleos únicos de tecidos glioma congelados frescos para estudos de sequenciamento de núcleo único RNA e ATAC.

Isolamento de núcleos de tumores cerebrais congelados frescos para RNA-seq de núcleo único e ATAC-seq

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Isolamento de núcleo de baixa entrada e multiplexing com anticorpos de código de barras de ganglia simpatizante do rato para sequenciamento de RNA de núcleo único

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Isolamento suave de núcleos do tecido cerebral de Killifish turquesa africano adulto, um modelo naturalmente de curta duração para a pesquisa do envelhecimento

Aqui, apresentamos um protocolo para isolar núcleos de tecidos hepáticos arquivados congelados por flash para RNA-seq, ATAC-seq de núcleo único e multiômica articular (RNA-seq e ATAC-seq).

Isolamento de núcleos de tecido hepático congelado por flash para multiômica unicelular

Aqui, apresentamos um protocolo descrevendo a preparação de núcleos celulares. Após microdissecção e dissociação enzimática do tecido cardíaco em células únicas, as células progenitoras foram congeladas, seguidas pelo isolamento de células viáveis puras, que foram usadas para sequenciamento de RNA de núcleo único e o ensaio de núcleo único para cromatina acessível à transposase com análises de sequenciamento de alto rendimento.

Isolamento de Núcleos de Células Progenitoras Cardíacas de Camundongos para Perfil de Epigenoma e Expressão Gênica em Resolução Unicelular

O estudo descreve um protocolo simples, rápido e parcialmente automatizado para isolar núcleos de alta qualidade de tecidos congelados de mamíferos para sequenciamento de RNA de núcleo único a jusante.

Um Protocolo Simples, Rápido e Parcialmente Automatizado para o Isolamento de Núcleos Únicos de Tecidos Congelados de Mamíferos para Sequenciamento de Núcleo Único

A heterogeneidade celular de tecido cerebral representa uma limitação significativa para o estudo de marcas epigenéticas na cromatina porque a maioria dos ensaios falta de resolução única célula. Neurônios são normalmente misturados com glia e outras células não-neuronais. Nós fornecemos um protocolo para extrair e coletar núcleos neuronal do cérebro humano.

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Aprenda a isolar núcleos de alta qualidade de rins congelados de camundongos adultos para sequenciamento de RNA de núcleo único. Este protocolo minimiza artefatos de expressão gênica e melhora a representação de tipos celulares da medula renal.

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