Name: Preparação e implantação de eletrodos para kindling elétrico de camundongos VGAT-CRE para gerar um modelo para epilepsia do lobo temporal (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 29 s
Description: Aprenda a preparar e implantar eletrodos para kindling elétrico em camundongos VGAT-Cre, criando um modelo reprodutível de epilepsia do lobo temporal com mínima degeneração hipocampal para estudos de epileptogênese.

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Os autores agradecem a John Williamson pelas discussões úteis sobre este protocolo. Este trabalho foi apoiado pelo NIH/NINDS grant NS112549.

O uso de animais seguiu as diretrizes do ARRIVE12 e foi aprovado pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais da Universidade da Virgínia.
1. Confecção de fones de ouvido com dois eletrodos bipolares (Figura 1)
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62929/62929fig01.jpg"> Figura 1: Principais etapas na fabricação de fones de ouvido de EEG. (A) Aparecimento dos eletrodos nas várias etapas do protocolo (números no passo da correspondência esquerda). (B) Uma foto do produto final montado em um suporte caseiro que se encaixa na moldura estereotáxica. Note, o suporte termina com um conjunto de pinos de colarinho que se encaixa no pedestal do fone de ouvido. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62929/62929fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<ol><li>Corte 3,5 cm de fio de aço inoxidável revestido de politetrafluoretileno inoxidável.</li>
	<li>Retire cerca de 1 mm da camada de isolamento do fio em ambas as extremidades. Não tenha muito do fio descascado.</li>
	<li>Coloque dois pinos em um suporte de morsa com a parte inferior do pino que tem uma fenda mais longa voltada para baixo.</li>
	<li>Aplique o fluxo nas extremidades descascadas do fio e na parte superior dos pinos.</li>
	<li>Tin a parte descascada do fio com apenas solda suficiente para revesti-lo.</li>
	<li>Adicione uma quantidade mínima de solda à parte superior do pino sem transbordar para as laterais.</li>
	<li>Coloque uma extremidade das extremidades descascadas do fio no pino o mais profundo que ele permitir, enquanto a solda é derretida. NOTA: Existe um orifício lateral onde o fio pode sair - não deixe o fio sair do pino. Todo o fio descascado deve ficar dentro do pino.</li>
	<li>Repita as etapas 1.6-1.7 para o segundo pino, agora com as outras extremidades descascadas do fio.</li>
	<li>Deixe os pinos descansar por 30 s para ajustar, retire-os do suporte da morsa e, em seguida, puxe-os para garantir que a conexão entre o fio e os pinos seja forte e se mantenha.</li>
	<li>Enxágue os pinos em água fria e depois seque.</li>
	<li>Verifique a condutância entre o pino 1 e o pino 2 usando um ohmímetro.</li>
	<li>Junte os pinos nas extremidades do fio; segure-os paralelos e próximos. Aperte um hemostático no centro do fio. Em seguida, gire o hemostático, para que o fio se torça em torno de si mesmo bastante apertado. Remova o hemostático.</li>
	<li>Aperte uma pinça no fio torcido 2 mm abaixo dos pinos e dobre o fio a 90°.</li>
	<li>Empurre o mesmo fio novamente 90° para trás sobre a pinça criando outra curvatura a 1 mm da primeira.</li>
	<li>Corte o fio torcido em um ângulo de 45° abaixo da curvatura a 3,5 mm com uma pequena tesoura afiada.</li>
	<li>Prepare dois desses eletrodos bipolares (com duplo pino torcido) para cada fone de ouvido (opcional, o segundo é o backup em caso de problemas elétricos com o primeiro).</li>
	<li>Preparar um único eletrodo de referência cortando um fio com pinos soldados em ambas as extremidades em dois (passos 1.1-1.17, Figura 1A).</li>
	<li>Corte o fio a 7 mm.</li>
	<li>Dobre a extremidade 1 mm abaixo da ponta.</li>
	<li>Em seguida, cubra a ponta dobrada de 1 mm do fio com pinça e gire o fio firmemente ao redor da pinça para criar um pequeno laço (1 mm de diâmetro).</li>
	<li>Dobre o laço perpendicularmente à parte reta do fio para fazer com que a ponta do fio aponte para fora novamente.</li>
	<li>Montar os dois eletrodos bipolares e o eletrodo de referência único no pedestal de seis pinos de forma que os eletrodos bipolares fiquem lado a lado com 6 mm de distância entre eles, e que o eletrodo de referência seja colocado no orifício externo médio (Figura 1B). NOTA: Um método alternativo é implantar os eletrodos, cimentá-los no lugar e, em seguida, inserir seus pinos no pedestal.</li>
</ol>2. Implantação de eletrodos estereotáxicos
<ol><li>Esterilizar todas as ferramentas cirúrgicas e a montagem do eletrodo de seis pinos por autoclavação antes da cirurgia. Um campo cirúrgico estéril deve ser mantido durante a cirurgia, e luvas cirúrgicas estéreis devem ser usadas. Campos estéreis (por exemplo, Press n' Seal) são recomendados para cobrir o animal, exceto para a área cirúrgica.</li>
	<li>Use camundongos VGAT-Cre de 8 semanas de idade (pareados por idade, machos e fêmeas) para cirurgias 4 semanas após o desmame. Registrar o peso do animal antes da cirurgia para permitir a mensuração da perda de peso pós-cirúrgica.</li>
	<li>Use um vaporizador de isoflurano certificado ou um sistema de anestesia de baixo fluxo equipado com uma bomba de seringa de precisão, vaporizador digital integrado e almofada térmica de feedback. NOTA: Os sistemas de baixo fluxo são capazes de fornecer anestesia a baixas taxas de fluxo proporcionais ao tamanho do animal em uma câmara de indução ou através de um cone nasal no quadro estereotáxico (70 mL/min, a concentração de isoflurano no ar é de 4% para indução e 2% para cirurgia). Usar menos anestesia não só beneficia o animal durante as cirurgias, mas também reduz o risco de exposição do pessoal do laboratório ao isoflurano.</li>
	<li>Coloque o animal anestesiado em uma almofada aquecida aquecida a 37 °C para mantê-lo aquecido durante a cirurgia. Se estiver usando um sistema de temperatura controlado por feedback, insira a sonda de temperatura levemente lubrificada no reto do animal para monitoramento de temperatura durante a cirurgia.</li>
	<li>Monte o animal na estrutura estereotáxica colocando suavemente as barras auriculares nas orelhas e os dentes superiores da frente na barra do incisivo. Coloque o cone nasal sobre o nariz para a administração adequada da anestesia. Certifique-se de que a cabeça está nivelada e centralizada e não pode ser movida quando ligeiramente sondada.</li>
	<li>Injetar por via subcutânea 0,5 mL de normosol para hidratação.</li>
	<li>Aplique lubrificante ocular para evitar o ressecamento da córnea.</li>
	<li>Monitorar a profundidade da anestesia pela ausência do reflexo de retirada após pinçar um dedo do pé e, em seguida, diminuir o isoflurano para 1,5%-2,0% durante a cirurgia.</li>
	<li>Remover os pelos na área cirúrgica e ao redor dela, arrancando ou usando cortadores (barbear) ou creme depilatório, e desinfetar a pele com três ciclos de aplicação alternada de iodo e etanol, finalizando com iodo. A remoção dos pelos para longe do local cirúrgico é recomendada apenas se houver meios de manter a anestesia nesse local. Se necessário, use aplicadores de ponta de algodão mergulhados em álcool para remover os pelos da área imediata ao redor da cabeça. Injetar 0,05 mL do analgésico local bupivacaína (0,25%) por via subcutânea.</li>
	<li>Faça uma incisão no crânio usando um bisturi e, em seguida, corte uma parte da pele com uma tesoura cirúrgica afiada, expondo o crânio. Empurrando a pele para o lado, usando um cotonete, limpe o crânio de todos os músculos e tecidos subjacentes que obstruem a visão. NOTA: Para parar o sangramento acidental, aplique pressão sobre o local do sangramento com um cotonete estéril até que pare.</li>
	<li>Limpe o crânio com peróxido de hidrogênio usando cotonetes estéreis para tornar visíveis as suturas cranianas e tanto o bregma quanto o lambda.</li>
	<li>Seque bem o crânio e, em seguida, aplique uma gota de adesivo dental autocondicionante usando seu aplicador. Escove-o no crânio, espere 60 s e cure com uma luz UV dental por 40 s. Uma superfície brilhante indica que o adesivo foi efetivamente reticulado com o crânio. NOTA: Esta etapa é crítica para a conexão segura do fone de ouvido.</li>
	<li>Use uma broca de 0,031" (0,79 mm) para perfurar dois furos de rebarba bilateralmente para implantação de eletrodos de profundidade hipocampal (aproximadamente 5.000 rpm). Faça um furo extra para o eletrodo de referência acima do cerebelo atrás do lambda. NOTA: Ao perfurar, tome cuidado para abaixar a broca lentamente e evitar perfurar o cérebro.</li>
	<li>As coordenadas para os eletrodos são as seguintes (de bregma em mm): eletrodos hipocampais a 3 mm posteriores, 3 mm laterais e 3 mm de profundidade; e eletrodo de referência cerebelar a 6 mm posterior, 0 mm lateral e 0 mm de profundidade (subdural).</li>
	<li>Para aumentar a precisão, use uma furadeira montada estereotaxicamente, zere o eixo X/Y do manipulador estereotáxico ao tocar o bregma - este é o ponto de referência para as coordenadas.</li>
	<li>Monte um fone de ouvido inserindo todos os eletrodos no pedestal de seis pinos, certificando-se de que os pinos sejam empurrados até o pedestal. Monte o pedestal no suporte do eletrodo sobre uma estrutura estereotáxica (Figura 1B).</li>
	<li>Alinhe os eletrodos acima dos orifícios de rebarba correspondentes. Estereotaxicamente implante eletrodos de fio de aço inoxidável bipolares torcidos no hipocampo direito e esquerdo e eletrodo de referência no cerebelo, baixando lentamente o fone de ouvido e guiando os eletrodos para os orifícios da rebarba.</li>
	<li>Quando o eletrodo de torção hipocampal estiver logo acima do furo, zere o eixo Z e abaixe lentamente até -3,0 mm.</li>
	<li>Cobrir a superfície do crânio e os eletrodos com cimento dentário e preencher o espaço entre a superfície do crânio e o fundo do pedestal. As bordas da pele estarão adjacentes ao cimento dentário de tal forma que nenhum tecido subjacente permanecerá exposto. Espere o cimento secar e endurecer. Em seguida, retire o suporte do eletrodo do braço estereotáxico e remova o suporte do pedestal.</li>
	<li>Injetar 0,1 mL de cetoprofeno (1 mg/mL, SC) para analgesia e uma segunda dose de 0,5 mL de normosol (SC) para hidratação e retirar o animal do quadro estereotáxico.</li>
	<li>Coloque uma almofada isotérmica pré-aquecida a 37 °C dentro de uma gaiola de biotério vazia coberta com um papel toalha. Quando estiver totalmente acordado, coloque o animal em uma gaiola limpa, com roupa de cama e alimentos macios, e devolva-o ao biotério. Os animais são alojados sozinhos a partir deste ponto para evitar mastigar os fones de ouvido uns dos outros. Os funis de barra de arame não são usados para evitar que os fones de ouvido fiquem presos e, em vez disso, as garrafas de água são amarradas na parte inferior dos topos da gaiola e a ração está presente na cama.</li>
	<li>Alimente o animal com ração macia por 72 h após a cirurgia e monitore a perda de peso e o escore de condição corporal. Animais desidratados podem receber 0,5 mL de normosol por via subcutânea se desidratados (perda de peso, aumento do turgor da pele, olhos afundados). O cetoprofeno pode ser administrado por via subcutânea uma vez ao dia por mais 2 dias após a cirurgia (siga o regime de analgesia de acordo com as diretrizes locais da IACUC). Permitir que os animais se recuperem totalmente em suas gaiolas por 4-7 dias antes de serem transferidos para o sistema de registro de EEG.</li>
</ol>3. Protocolo de ignição elétrica
<ol><li>Conecte os mouses ao sistema de gravação de EEG usando um cabo flexível que se encaixa nos soquetes na cabeça do mouse e no comutador (consulte a lista Tabela de Materiais ). Deixe os animais se aclimatarem por um dia antes de prosseguir com o protocolo de estimulação elétrica abaixo. Monitorar sua saúde geral e aclimatação em uma base diária, e removê-los do sistema quando houver sinais de doença, angústia e/ou perda de peso corporal contínua superior a 25%</li>
	<li>Conecte ambos os eletrodos do eletrodo estimulador à saída de um estimulador de corrente constante. NOTA: É muito útil ter uma placa de circuito que desliga esses eletrodos do gravador de EEG e para o estimulador.</li>
	<li>Ajuste o estimulador para fornecer pulsos de 1 ms a 50 Hz para uma duração de trem de 2 s.</li>
	<li>Ajuste a saída do estimulador em 20 microamperes (μA) e entregue o1º pulso.</li>
	<li>Monitorar o EEG para uma pós-descarga característica de picos de alta frequência que duram mais do que o pulso de estimulação elétrica.</li>
	<li>Se nenhuma descarga for observada, aumente a quantidade de corrente injetada em incrementos de 20 μA até que uma pós-descarga seja desencadeada. A quantidade de corrente necessária é o Limiar Pós-Descarga (ADT).</li>
	<li>Os ADTs típicos são 20-50 μA. Se nenhuma descarga for observada mesmo depois de aumentar para 200 μA, é necessário solucionar problemas de conexões elétricas e fiação de fone de ouvido com um ohmímetro de alta sensibilidade. Se o problema estiver no eletrodo estimulador, tente estimular com os outros eletrodos de profundidade.</li>
	<li>Os animais são estimulados estimulando 2x ou 6x por dia usando uma corrente que é 1,5x o valor de ADT para esse rato.</li>
	<li>Monitorar a resposta comportamental à estimulação, que se eleva da mudança de estado para crises tônico-clônicas bilaterais com queda. Escore usando um sistema de classe Racine modificado11. Para evitar crises tônicas fatais evocadas, o kindling deve ser pausado se estímulos sucessivos levarem à gravidade e duração crescentes das crises até o escore de Racine modificado 6 (corrida e salto)</li>
</ol>

<ol><li>Lekoubou, A., Bishu, K. G., Ovbiagele, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nationwide+trends+in+medical+expenditures+among+adults+with+epilepsy%3A+2003-2014%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Neurological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Nationwide trends in medical expenditures among adults with epilepsy: 2003-2014.</a> Journal of the Neurological Sciences. 384, 113-120 (2018).</li>
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<li>Morimoto, K., Fahnestock, M., Racine, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kindling+and+status+epilepticus+models+of+epilepsy%3A+rewiring+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Kindling and status epilepticus models of epilepsy: rewiring the brain.</a> Progress in Neurobiology. 73 (1), 1-60 (2004).</li>
</ol>

Os autores não têm conflitos a revelar.

Este relato descreve um protocolo em que o acender elétrico de camundongos leva à epilepsia. Uma vez que o eletrodo estimulador é colocado no hipocampo, esta é uma epilepsia límbica focal que modela a epilepsia do lobo temporal (ELT) em pacientes. Um passo crítico neste protocolo é a utilização de camundongos VGAT-Cre, que devido à inserção de um de recombinase IRES-Cre no gene Vgat , apresenta comprometimento das correntes inibitórias doGABA11. C57BL/6 não desenvolvem epilepsia após o ki...

A epilepsia é um importante distúrbio neurológico com significativos encargos econômicos e humanos. O NINDS estima que existam 3 milhões de americanos com epilepsia. Aproximadamente 0,6 milhão desses pacientes apresentam epilepsia do lobo temporal (ELT)1. Infelizmente, o tratamento clínico da ELT falha em um terço dos pacientes devido à ineficácia, desenvolvimento de resistência aos medicamentos ou intolerância aos efeitos colaterais2. Claramente, há uma necessidade significativa de desenvolver novas terapias para ELT, uma conclusão compartilhada pelo Comitê de Ciência Básica da Sociedade Americana de Epilepsia, pelo Grupo de Trabalho da Liga Internacional Contra a Epilepsia para a Descoberta de Drogas Pré-Clínicas para Epilepsia e pelo Conselho Nacional Consultivo de Distúrbios Neurológicos e AVC 3,4.
Os modelos animais atuais de epilepsia do lobo temporal utilizam quimioconvulsivantes (por exemplo, cainato, pilocarpina) ou estimulação elétrica prolongada para induzir um estado de mal epiléptico de longa duração 5,6,7. Muitos animais morrem durante o procedimento (10%-30% em ratos, até 90% em camundongos8). Animais que sobrevivem e desenvolvem epilepsia apresentam morte neuronal extensa em todo o encéfalo 9,10. Essa morte desencadeia uma cascata de respostas, começando com a ativação de micróglias, astrócitos e monócitos infiltrantes. As respostas neuronais incluem reorganização de circuitos (por exemplo, brotamento de fibras musgosas), nascimento de novos neurônios que não conseguem se integrar adequadamente em circuitos (por exemplo, células de grânulos ectópicos) e mudanças intrínsecas que levam à hiperexcitabilidade (por exemplo, upregulation de canais de Na+). Um modelo de epilepsia sem morte neuronal significativa facilitará a busca de novas drogas antiepilépticas.
Ao testar a hipótese GABA de epilepsia, descobriu-se que o tratamento de camundongos VGAT-Cre com um protocolo leve de kindling elétrico levou a convulsões motoras e eletrográficas espontâneas11. Em geral, o kindling elétrico de roedores não leva a crises espontâneas que definem epilepsia, embora possa, em casos de over-kindling11. Camundongos VGAT-Cre expressam Cre recombinase sob o controle do gene transportador vesicular de GABA (VGAT), que é especificamente expresso em neurônios inibitórios GABAérgicos. Verificou-se que a inserção de Cre interrompeu a expressão de VGAT nos níveis de RNAm e proteína, prejudicando assim a transmissão sináptica GABAérgica no hipocampo. Concluiu-se que camundongos VGAT-Cre acesos podem ser úteis para estudar os mecanismos envolvidos na epileptogênese e para a triagem de novas terapêuticas11. O presente relatório fornece os métodos usados na geração do modelo em detalhes.

<table><tbody><tr><td>Amplificador AC Diferencial Extracelular de 16 Canais (115V/60Hz)</td><td>AD Instruments</td><td>AM3500-115-60</td><td>Amplificador EEG Alternativo</td></tr><tr><td>363/CP PLUG COLLAR, PINS SLEEVE</td><td>P1 Technologies</td><td>363SLEEVPIN0NL</td><td>Para suporte de eletrodo</td></tr><tr><td>Cabo, 363-363 5CM - 100CM W/MESH Cabo</td> de <td>mouse para comutador</td>6TCM <td>P1 Technologies</td><td>363363XXXXCM004</td></tr><tr><td>Câmeras CCTV Qcwox HD Sony IR LED</td><td>Comutador Sony</td><td>QC-SP316</td><td></td></tr><tr><td>SL6C/SB (escova única)</td><td>P1 Technologies</td><td>8BSL6CSBC0MT</td><td>anteriormente Plastics One, Inc.</td></tr><tr><td>Amplificador</td><td>de corrente A-M Systems</td><td>Modelo 2100</td><td></td></tr><tr><td>Cement Dental</td><td>Stoelting</td><td>51459</td><td></td></tr><tr><td>Brocas, #75, OD&nbsp; 0.310" LOC 130 PT</td><td>Kyocera</td><td>105-0210.310</td><td></td></tr><tr><td>E363/0 CONTATO DE SOQUETE INCLINADO</td><td>P1 Technologies</td><td>8IE3630XXXXE</td><td>pinos para conector</td></tr><tr><td>Cola auto condicionante iBond</td><td>Kulzer</td><td>CE0197</td><td></td></tr><tr><td>MS363 PEDESTAL 2298 6 PIN WHITE</td><td>P1 Technologies</td><td>8K000229801F</td><td>Conector de fone de ouvido EEG</td></tr><tr><td>Ohmeter</td><td>Simpson</td><td>260</td><td>PowerLab</td></tr><tr><td>16/35 de alta sensibilidade e LabChart Pro</td><td>AD Instruments</td><td>PL3516 / P</td><td>Software de EEG alternativo</td></tr><tr><td>SomnoSuite</td><td>Kent Scientific Corp.</td><td>Unidade de anestesia SS-01</td><td>e Monitoramento RightTemp</td></tr><tr><td>Broca estereotáxica e kit de micromotor</td><td>Foredom Electric Co.</td><td>K.1070</td><td></td></tr><tr><td>Quadro estereotáxico</td><td>David Kopf Instruments</td><td>Modelo 940</td><td></td></tr><tr><td>Fio revestido de teflon para eletrodo de profundidade, OD 0.008'A-M</td> <td>Systems</td><td>791400</td><td></td></tr><tr><td>Camundongos VGAT-Cre em fundo congênito C57BL / 6J</td><td>O Laboratório Jackson</td><td>000664</td><td></td></tr></tbody></table>

preparação e implantação de eletrodos para kindling elétrico de camundongos vgat-cre para gerar um modelo para epilepsia do lobo temporal

Preparation and Implantation of Electrodes for Electrically Kindling VGAT-Cre Mice to Generate a Model for Temporal Lobe Epilepsy

Descobriu-se que o kindling elétrico de camundongos VGAT-Cre levou a convulsões motoras e eletrográficas espontâneas. Um artigo recente concentrou-se em como camundongos VGAT-Cre únicos foram usados no desenvolvimento de convulsões recorrentes espontâneas (SRS) após o kindling e um provável mecanismo - inserção de Cre no gene VGAT - interrompeu sua expressão e reduziu o tônus gabaérgico. O presente estudo estende essas observações a uma coorte maior de camundongos, concentrando-se em questões-chave, como quanto tempo o SRS continua após o acender e o efeito do sexo e da idade do animal. Este relato descreve os protocolos para as seguintes etapas principais: confecção de fones de ouvido com eletrodos de profundidade hipocampal para estimulação elétrica e leitura do eletroencefalograma; cirurgia para fixar o fone de ouvido de forma segura no crânio do mouse para que ele não caia; e os principais detalhes do protocolo de kindling elétrico, como duração do pulso, frequência do trem, duração do trem e quantidade de corrente injetada. O protocolo de kindling é robusto na medida em que conduz de forma confiável à epilepsia na maioria dos camundongos VGAT-Cre, fornecendo um novo modelo para testar novas drogas antiepileptogênicas.

Animais O modelo foi originalmente desenvolvido usando camundongos VGAT-Cre (Slc32a1tm2(cre)Lowl/J)13 em fundo misto. No entanto, também tem sido aplicado à cepa VGAT-Cre que é congênica com C57BL/6J. Nenhuma diferença foi observada na epilepsia que se desenvolve entre as cepas. Ambas as cepas expressam Cre recombinase sob o controle do promotor do transportador vesicular GABA. Esses camundongos foram gerados por batida em um IRES-Cre após o códon stop no gene Vg...

Este relato descreve os métodos para gerar um modelo de epilepsia do lobo temporal baseado no kindling elétrico de camundongos VGAT-Cre transgênicos. Camundongos VGAT-Cre acesos podem ser úteis para determinar o que causa epilepsia e para rastrear novas terapias.

Preparação e implantação de eletrodos para kindling elétrico de camundongos VGAT-CRE para gerar um modelo para epilepsia do lobo temporal

It was discovered that electrical kindling of VGAT-Cre mice led to the spontaneous motor and electrographic seizures. A recent paper focused on how unique ...

Este protocolo gera um novo modelo para epilepsia do lobo temporal em que camundongos desenvolveram crises espontâneas, e tem sido muito útil para investigar os mecanismos da epileptogênese e também para rastrear novas terapias. Este procedimento em camundongos VGAT-Cre leva de forma confiável a convulsões eletrográficas e motoras compostas espontâneas e motoras recorrentes sem causar morte celular extensa do hipocampo, que é frequentemente observada após status epilepticus desencadeado com quimioconvulsivantes ou estimulação elétrica contínua. Para começar a fazer fones de ouvido, corte o fio de aço inoxidável revestido de politetrafluoretileno de 3,5 centímetros de comprimento e retire cerca de um milímetro do revestimento de isolamento de ambas as extremidades do fio.Coloque dois pinos em um suporte de vice, com a parte inferior do pino com uma fenda mais longa voltada para baixo. Em seguida, aplique fluxo nas extremidades descascadas do fio e nas partes superiores dos pinos. Estanhe a parte descascada do fio e a parte superior dos pinos com solda suficiente para revesti-lo sem transbordar para as laterais.Coloque uma das extremidades descascadas do fio no pino o mais fundo possível enquanto a solda está derretendo. Repita o processo para o segundo pino com a outra extremidade descascada do fio. Depois de resfriar os pinos e a solda por 10 segundos, remova os pinos do suporte do vice e, em seguida, puxe para os pinos para garantir que a conexão entre o fio e os pinos seja forte e se mantenha.Enxágue os pinos em água fria seguida de secagem. Posteriormente, use um ohmímetro para verificar a condutância entre o pino um e o pino dois. Junte os pinos na extremidade do fio para mantê-los paralelos e fechados.Aperte um hemostático no centro do fio e gire o hemostático para torcer o fio em torno de si mesmo com força. Após a remoção do hemostático, prenda a pinça no fio torcido a dois milímetros abaixo dos pinos para dobrar o fio a 90 graus. Empurre o fio 90 graus para trás sobre a pinça, criando mais uma curvatura a um milímetro da primeira.Use uma tesoura pequena e afiada para cortar o fio torcido a 45 graus e 3,5 milímetros abaixo da curva. Prepare dois eletrodos bipolares ou torcidos de pino duplo para cada fone de ouvido. Para preparar um eletrodo de referência, corte um fio com pino soldado em ambas as extremidades em dois.Em seguida, corte o fio a sete milímetros e dobre a extremidade do fio a um milímetro abaixo da ponta. Cubra a ponta dobrada de um milímetro do fio com pinça e gire o fio firmemente ao redor da pinça para criar um pequeno laço com um milímetro de diâmetro. Em seguida, dobre o laço perpendicularmente à parte reta do fio para fazer com que a ponta do fio aponte para fora novamente.Monte todos os eletrodos no pedestal de seis pinos lado a lado com uma distância de seis milímetros entre os dois eletrodos bipolares. Coloque o eletrodo de referência no orifício externo médio. Antes de prosseguir com a cirurgia, registre o peso dos camundongos VGAT-Cre de oito semanas de idade.Em seguida, colocar o animal em uma câmara de indução para induzir a anestesia. Coloque o rato anestesiado numa almofada de aquecimento a 37 graus Celsius. Se estiver usando um sistema de temperatura controlado por feedback, insira a sonda de temperatura no reto do animal para monitoramento da temperatura durante a cirurgia.Para iniciar a cirurgia, redirecione o fluxo de anestesia inalatória para o cone nasal e monte o animal na estrutura estereotáxica, colocando suavemente os dentes superiores anteriores na barra do incisivo e mova o cone para o nariz. Em seguida, coloque as barras auriculares nas orelhas e afixe na estrutura estereotáxica. Certifique-se de que a cabeça do animal esteja nivelada e centralizada e não possa ser movida quando ligeiramente sondada.Uma vez montado o animal, injete 0,5 mililitros de Normosol nos ratos para hidratação e aplique lubrificante ocular para evitar o ressecamento da córnea. Monitore a profundidade da anestesia apertando uma pata do membro posterior. Se o reflexo de retirada estiver ausente no animal, proceda à remoção dos pelos do couro cabeludo do rato ao redor da área cirúrgica.Quando feito, desinfetar a área limpa da pele três vezes com aplicação alternada de etanol e iodo, finalizando com iodo, e injetar 0,05 mililitros de bupivacaína a 0,25% por via subcutânea. Faça uma incisão no crânio usando um bisturi e, em seguida, corte uma parte da pele com tesoura cirúrgica, expondo o crânio. Empurre a pele para o lado antes de limpar o crânio de todos os tecidos subjacentes com um cotonete.Limpe o crânio com peróxido de hidrogênio usando cotonetes estéreis e torne visíveis as suturas cranianas, bregma e lambda. Com a broca montada estereotaxicamente, mova a ponta da broca para o bregma nas coordenadas X, Y e Z zero. Em seguida, levante e mova a broca para lambda para determinar suas coordenadas para determinar se a cabeça está nivelada.Depois de secar bem o crânio, aplique uma gota de adesivo dental autocondicionante com o aplicador. Aguarde 60 segundos antes de curar o adesivo dental com uma luz UV dental por 40 segundos. Uma superfície brilhante indica que o adesivo foi efetivamente reticulado com o crânio.Com a ajuda de uma broca de 0,031 polegada, perfure cuidadosamente dois furos de rebarba bilateralmente no crânio a 5.000 rotações por minuto, ou RPM, evitando perfurar o cérebro. Aplicar gota de soro fisiológico para melhorar a perfuração dos furos de rebarba. Para implantação dos eletrodos de profundidade hipocampal, broca três milímetros posterior e três milímetros lateral do bregma.Perfurar uma broca para o eletrodo de referência acima do cerebelo atrás do lambda a seis milímetros posteriores e zero milímetros laterais do bregma. Em seguida, monte o pedestal de seis pinos com eletrodos montados no suporte de eletrodos na estrutura estereotáxica. Ao alinhar os eletrodos acima dos orifícios de rebarba correspondentes, abaixe lentamente e navegue pelo fone de ouvido para localizar as duas pontas de eletrodos bipolares bem no topo dos orifícios da broca hipocampal esquerda e direita e, se necessário, ajuste o eletrodo de referência para pairar acima do orifício sobre o cerebelo.Quando os eletrodos de torção do hipocampo estiverem logo acima dos orifícios, zere o eixo Z e abaixe lentamente o eletrodo para menos três milímetros no hipocampo direito e esquerdo e guie o eletrodo de referência para o orifício acima do cerebelo. Preparou o cimento dental misturando o pó e o líquido em uma tigela misturadora. Em seguida, cubra a superfície do crânio, os eletrodos e o espaço entre a superfície do crânio e o fundo do pedestal com cimento dental.Uma vez que o cimento seque e endureca, desconecte o suporte do eletrodo do braço estereotáxico, levante o braço e remova o suporte do pedestal. Após administrar o camundongo por via subcutânea com cetoprofeno e Normosol, retirar o animal da estrutura estereotáxica para movê-lo para a almofada aquecida na gaiola do biotério. Uma vez totalmente acordado, devolva o único animal ao biotério, alimente-o com ração macia e monitore a perda de peso diariamente até 72 horas após a cirurgia.Na parcela representativa do violino, o número de estímulos requeridos pelos camundongos para o critério de estado de ignição é mostrado. Os camundongos tipicamente atingiram o estado de kindled ou experimentam cinco convulsões motoras tônico-clônicas bilaterais após 15 estimulações. A latência para crises recorrentes espontâneas, ou SRS, foi de 10,7, e a frequência média das crises foi de 1,3 crises por dia.A distribuição confiável do SRS mostrou que os camundongos foram epilépticos por aproximadamente 23 dias. Nas imagens representativas, o número de neurônios anti-NeuN positivos ou mortes neuronais em vários subcampos do hipocampo e córtex entorrinal pode ser visto. É importante que os dois eletrodos bipolares entrem suavemente nos dois orifícios da rebarba, então eles precisam estar bem acima dos orifícios da rebarba.E também, é importante aplicar cuidadosamente o cimento dental e deixá-lo endurecer completamente antes de remover o suporte de eletrodos. Esta técnica nos permite gerar camundongos epilépticos e monitorá-los continuamente com gravação de EEG e também gravação de vídeo, simultaneamente. E com os experimentos que fazemos, podemos então testar novas estratégias de tratamento, como terapia gênica, para reduzir a frequência, a duração e a gravidade das crises.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Córtex parcialmente isolado ("minar") é um modelo animal eficiente de epileptogênese pós-traumático. Aqui demonstramos como fazer um novo dispositivo cirúrgico e usá-lo para fazer lesões mais precisas e consistentes para gerar este modelo.

Preparando Modelo de rebaixo de epileptogênese Pós-Traumático em Roedores

Um procedimento é descrito para manipular a actividade de neurónios piramidais corticais cerebrais optogenetically enquanto o electroencefalograma, electromiograma, e concentração do lactato cerebral são monitorados. Gravações experimentais são realizados em ratinhos de cabo-cativos, enquanto eles sofrem espontâneas do sono / vigília ciclos. Optogenética equipamento é montado no nosso laboratório, o equipamento de gravação encontra-se comercialmente disponível.

Eletroencefalografia simultânea, em tempo real de medição da concentração de lactato e Manipulação optogenética da atividade neuronal do córtex cerebral de roedores

Este vídeo demonstra uma técnica para implantar um conjunto de eletrodos no cérebro de um camundongo. O conjunto contém eletrodos bipolares para registrar a atividade do hipocampo e um eletrodo de referência para obter a atividade basal do cerebelo. Um camundongo anestesiado é colocado em uma estrutura estereotáxica e o conjunto do eletrodo é implantado na região do cérebro alvo. O animal é então autorizado a se recuperar antes de realizar o registro eletrofisiológico.

Implantação de um conjunto de eletrodos em um cérebro de camundongo para registro eletrofisiológico

Estudos mostraram que a estimulação transcraniana catódica por corrente contínua pode produzir efeitos supressivos em convulsões resistentes a medicamentos. Neste estudo, foi desenvolvido um arranjo experimental in vitro no qual a estimulação por corrente contínua e o registro de multieletrodos da atividade semelhante a convulsões foram avaliados na preparação de fatias de cérebro de camundongos. Os parâmetros de estimulação por corrente contínua foram avaliados.

A estimulação de corrente contínua e Multi-eletrodo de gravação matriz de perda de consciência em Ratos Cérebro Slice Preparação

Este artigo demonstra o desempenho da acupuntura, modelos de epilepsia e a análise do sono em roedores. O procedimento de acupuntura e a identificação dos pontos de acupuntura são descritos. Pilocarpina ou pentilenotetrazol (PTZ) é usado para induzir epilepsia. Eletrocorticograma (ECoG), eletromiograma (EMG), temperatura cerebral e registros de atividade locomotora são empregados para análise do sono.

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Ilustramos como executar gravação e elétrica de modulação da atividade epileptiforme 4-aminopiridina-induzida em fatias de cérebro de roedor usando matrizes de microeletrodos. Uma câmara de gravação personalizada mantém a viabilidade do tecido durante prolongadas sessões experimentais. Viver o mapeamento de eletrodo e seleção de pares estimulantes são executadas por uma interface de usuário gráfica personalizada.

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Preparação e implantação de eletrodos para kindling elétrico de camundongos VGAT-CRE para gerar um modelo para epilepsia do lobo temporal (Vídeo) | JoVE Journal

Preparação e implantação de eletrodos para kindling elétrico de camundongos VGAT-CRE para gerar um modelo para epilepsia do lobo temporal

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