Coloração imunohistoquímica fluorescente multiplexada de quatro tipos de células imunes endometrial em aborto recorrente
4 de agosto de 2021
Apesar dos avanços na imunohistoquímica multiplex e na imagem multiespectral, caracterizar a densidade e o agrupamento das principais células imunes simultaneamente no endométrio continua sendo um desafio. Este artigo descreve um protocolo detalhado de coloração multiplex e imagens para a localização simultânea de quatro tipos de células imunes no endométrio.
A tecnologia atual permite o uso de anticorpos criados na mesma espécie para detectar até sete marcadores. Demonstrando o procedimento estará Loucia Chan, uma técnica do laboratório. Comece preparando as lâminas de vidro embutidas de parafina fixas formalina montadas com a amostra de tecido, colocando os slides planas em um forno, para assar a 60 graus celsius com o tecido voltado para cima.
Após uma hora, depila e reidratar os slides por 10 minutos cada um com a série de produtos químicos, como descrito no manuscrito. Submergir os slides em soro fisiológico tris-tampão, e depois em uma caixa de slides de plástico preenchido com uma mistura de formaldeído diluído em metanol, para corrigir as amostras. Em seguida, lave os slides duas vezes em água desionizada por dois minutos.
Prossiga para a recuperação de epítope, colocando o rack de slides em uma caixa de resistência ao calor preenchida com tampão de ácido cítrico no pH 6.0. E, em seguida, colocar a caixa no micro-ondas, para aquecer os slides primeiro em 100% de potência por 50 segundos, seguido por 20 minutos com 20% de potência, para manter a mesma temperatura. Depois de enxaguar os slides em água destilada e lavar com TBST, mergulhe o slide em um frasco contendo uma solução de bloqueio de peroxidação por 10 minutos.
Após a incubação, enxágue os slides em água destilada e lave com TBST, em seguida, use uma caneta de barreira hidrofóbica para marcar um limite em torno da seção tecidual na lâmina. Em seguida, enxágue o slide em TBST, cubra as seções teciduais com o tampão de bloqueio e incuba as lâminas em uma câmara umidificada por 15 minutos. Para remover os reagentes de bloqueio, primeiro incubar os slides com o anticorpo primário de interesse e, em seguida, remover o anticorpo primário lavando os slides três vezes com TBST, antes da incubação com o polímero rabanete peroxidase rotulado, anticorpo secundário.
Após a incubação, lave os slides antes de aplicar a flora opala para a solução de trabalho TSA e enxágue o slide com o tampão de recuperação de antígeno. Realize a desmontagem à base de micro-ondas aquecendo os slides em tampão de recuperação de antígeno em um micro-ondas a 100% de potência, por 50 segundos, seguido por 20% de potência por 20 minutos nos recipientes seguros de micro-ondas. Depois de resfriar as amostras em temperatura ambiente por 15 minutos, enxágue os slides em água destilada e TBST e depois incubar com solução dappy por cinco minutos.
Em seguida, seque o slide antes de montar com o meio de montagem apropriado. Antes de a imagem dos slides predefinir os filtros apropriados na estação de trabalho. Capture um mínimo de 10 campos para análise sob 200 vezes a ampliação.
Para contar as células, clique no botão objetos de contagem na barra de passo, para exibir o painel de configurações de contagem de objetos. Se o tecido tiver sido segmentado, selecione a categoria de tecido em que os objetos devem ser encontrados. Em seguida, selecione o dimensionamento de sinal desejado a partir de escala automática ou escala fixa.
Para segmentação de objetos, selecione o componente principal da lista de retirada. Para detectar objetos tocando outros objetos como objetos individuais e não combinados, verifique o tamanho máximo e a caixa de pixels e, em seguida, opte pela divisão refinada. Em seguida, conte todas as células estromas nas células imunes separadamente, para expressar os dados como as porcentagens das células imunes em relação ao número total de células estromas para cada imagem capturada.
Mais tarde, informe a contagem final de células como uma média de todos os campos. Usando o editor de exibição, examine as tabelas de dados resultantes após o processamento e exporte a tabela de dados da contagem. Na análise representativa, quatro tipos de células imunes na amostra de endométrio somos diferenciados.
A imagem processada mostra a segmentação tecidual como epitelial e compartimentos estrogonais. A imunosstaining multiplex foi realizada nas biópsias endometrial de uma mulher de controle fértil e uma mulher com aborto recorrente inexplicável, piso único para nós representando CD3, CD56, CD68 e CD20 foram revelados na imunostaining. Uma vez identificado o som imunológico, novas manchas sob a citocina podem ajudar a lidar com sua interação e mecanismo para o sucesso da implantação.
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Visão Geral
Este estudo aborda os desafios de caracterizar simultaneamente a densidade e o agrupamento dos principais tipos de células imunes no endométrio, utilizando imuno-histoquímica múltipla e imagem multiespectral. É descrito um protocolo detalhado de coloração para a localização simultânea de quatro tipos de células imunes no endométrio.
Componentes Principais do Estudo
Área de Pesquisa
- Imunologia
- Biologia endometrial
- Técnicas de imagem multiplex
Antecedentes
- Importância da caracterização de células imunes na biologia reprodutiva.
- Dificuldades nos métodos tradicionais de coloração.
- Avanços na tecnologia de imagem.
Métodos Utilizados
- Imunohistoquímica multiplex
- Amostras de tecido fixadas em formalina e emblocadas em parafina
- Imagem multiespectral
Principais Resultados
- Diferenciou com sucesso quatro tipos de células imunes (CD3, CD56, CD68, CD20) no endométrio.
- Visualizou a distribuição e agregação das células imunes.
- Forneceu aprimoramentos ao protocolo para estudos futuros.
Conclusões
- O estudo demonstra um método confiável para a análise de células imunes no endométrio.
- Isso tem implicações para a compreensão da saúde reprodutiva e do sucesso da implantação.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A coloração imunohistoquímica fluorescente multiplexada permite a quantificação simultânea de múltiplas populações de células imunes em uma única seção de tecido, preenchendo uma lacuna crítica na pesquisa de imunologia reprodutiva. Esta abordagem auxilia na desmistificação mecanicista de hipóteses sobre o microambiente endometrial, fornecendo dados de perfilagem imune multiplexada com resolução espacial diretamente de amostras derivadas de pacientes. O método aumenta a confiança preditiva nos esforços de validação de alvos relacionados à falha de implantação e aborto recorrente, permitindo a comparação direta da densidade e agrupamento de células imunes entre estados férteis e patológicos.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas envolvendo interações de células imunes no endométrio por meio da detecção simultânea dos marcadores CD3, CD56, CD68 e CD20.
- Valor Operacional: Reduz a necessidade de cortes seriados e coloração, preservando amostras clínicas preciosas enquanto aumenta a densidade de dados por corte tecidual.
- Confiabilidade Preditiva: Fornece métricas quantitativas e resolução espacial de células imunes que apoiam a desmistificação biológica de alvos envolvidos na comunicação cruzada endométrio-imune durante a implantação.
Desenvolvimento de Ensaios e Triagem
- Prontidão do ensaio: Gera leituras fluorescentes padronizadas e reprodutíveis, adequadas para plataformas de imagem de alto conteúdo e fluxos de trabalho de análise automatizada de imagens.
- Escalabilidade: Compatível com biobancos de tecidos fixados em formalina e emblocados em parafina (FFPE), permitindo análise retrospectiva de grandes coortes para a descoberta de biomarcadores.
- Otimização da multiplexação: Aborda a interferência entre fluoróforos por meio de ciclos sequenciais de coloração e remoção, garantindo especificidade do sinal para cada marcador de células imunes.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Sistema Relevante para a Doença: Aplicável diretamente a biópsias endometriais humanas, fornecendo um modelo clinicamente relevante para o estudo da desregulação imunológica na perda gestacional recorrente.
- Continuidade Tradutiva: Conecta o perfil imunológico na fase de descoberta com a validação pré-clínica, permitindo o fenotipamento imunológico consistente entre diferentes tipos de amostras.
- Redução de Riscos Mecanísticos: Apoia a investigação das interações entre células imunes mediadas por citocinas após a identificação inicial dos tipos celulares, facilitando a validação de alvos em nível de vias.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se insere na fase de biologia de descoberta, apoiando especificamente os esforços de validação de alvos imunológicos e triagem fenotípica em programas de imunologia reprodutiva.
- Biologia da Descoberta: Permite testar hipóteses sobre a composição das células imunes e sua organização espacial no endométrio durante a janela de implantação.
- Triagem: Gera resultados quantitativos de imunofluorescência que permitem comparar as densidades de células imunes e os padrões de agrupamento entre diferentes condições experimentais.
- Análise: Fornece dados multiplexados de intensidade de fluorescência e de co-localização que auxiliam na fenotipagem de células imunes e na inferência de seus estados funcionais.
- Pesquisa Translacional: Garante continuidade da análise de amostras humanas para estudos mecanicistas subsequentes, fornecendo marcadores validados de células imunes para ensaios funcionais posteriores.
- Reutilização em Escala: Estabelece uma plataforma de imunomarcação reutilizável, aplicável a múltiplos estudos de perfilagem imune no endométrio e em outros tecidos.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na validação de alvos ao permitir comparação direta e multiplexada de populações de células imunes em tecidos doentes versus tecidos controle.
- Valor Operacional: Melhora a eficiência dos reagentes e reduz a variabilidade por meio de protocolos otimizados de coloração e remoção sequenciais em lâminas únicas.
- Valor Estratégico: Orienta decisões de avançar ou não avançar no desenvolvimento de terapêuticas reprodutivas, esclarecendo as contribuições do microambiente imune para o sucesso ou fracasso da implantação.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de alvos com base na densidade de células imunes, agrupamento e correlação espacial com compartimentos epiteliais ou estromais.
Considerações sobre a Implementação
- Requer especialização em imunohistoquímica, microscopia de fluorescência e análise de imagens multiespectrais para detecção e quantificação precisas do sinal.
- Depende do acesso a sistemas de recuperação de antígenos por micro-ondas, escâneres de lâminas com capacidade de fluorescência e kits de fluoróforos Opal validados para ciclagem multiplex.
- Necessita padronização das condições de bloqueio, incubação com anticorpos e remoção entre laboratórios para garantir a reprodutibilidade dos resultados multiplex.
- Requer adaptação dos painéis de anticorpos e etapas de validação ao aplicar o método a diferentes tipos de tecidos ou marcadores de células imunes além de CD3, CD56, CD68 e CD20.
- Limitações práticas incluem o possível vazamento entre fluoróforos e a necessidade de separação espectral cuidadosa durante a aquisição de imagens, o que é resolvido por meio de etapas sequenciais de remoção e configurações de filtros validadas.
