Name: Transição de fase optogenética do TDP-43 em neurônios motores espinhais de larvas de zebrafish (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-25T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 14 s
Description: Aprenda a induzir transições de fase optogenéticas do TDP-43 em neurônios motores espinhais de larvas de zebrafish. Este método permite visualizar o comportamento dinâmico da proteína in vivo e estabelece um novo modelo animal para estudar a degeneração motora na ELA.

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Este trabalho foi apoiado por SERIKA FUND (KA), KAKENHI Grant números JP19K06933 (KA) e JP20H05345 (KA).

Todo o trabalho de pesca foi realizado de acordo com o Guia de Cuidado e Uso de Animais De Laboratório do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (identificação de aprovação nº 24-2) do Instituto Nacional de Genética (Japão), que possui uma Garantia de Bem-Estar Animal no arquivo (número de garantia A5561-01) no Escritório de Bem-Estar Animal Laboratorial dos Institutos Nacionais de Saúde (NIH, EUA).
1. Construção de BACs para expressão de gene TDP-43 optogenético do promotor mnr2b
<ol><li>Preparação bac<ol>
<li>Compre um clone bac de zebrafish contendo o lócus zebrafish mnr2b (CH211-172N16, BACPAC Genomics). Purifique o DNA BAC de uma cultura LB de 5 mL durante a noite de DH10B Escherichia coli (E. coli) abrigando CH211-172N16 como descrito em Warming et al.18.</li>
		<li>Transforme as células CH211-172N16 em SW102 E. coli por eletroporação, como descrito em Warming et al.18. NOTA: A purificação do DNA BAC do E. coli no mesmo dia da eletroporação geralmente dá uma maior taxa de sucesso de transformação bac18. Caso contrário, o DNA BAC purificado é mantido a -20 °C até o uso.</li>
		<li>Introduza o iTol2-amp para transgênese BAC mediada por Tol2 transposon19 na espinha dorsal de CH211-172N16 por eletroporação, como descrito em Asakawa et al.20.<ol>
<li>Faça um estoque de glicerol do E. clones de célula coli carregando CH211-172N16 com a integração do iTol2-amp (CH211-172N16-iTol2A) depois de confirmar a integração homologous recombinação mediada pela reação em cadeia de polimerase (PCR) (Ex Taq) usando o par de primer Tol2-L-out (5'-AAA GTA TCT GGC TAG AAT CTT ACT TGA-3') e pTARBAC-13371r (5'-TAG CGG CCG CAA ATT TAT TA-3') e as seguintes condições: um passo de desnaturação a 98 °C por 1 min, seguido por 25 ciclos de desnaturação a 95 °C para 10 s, primer annealing a 55 °C para 15 s, e extensão de primer a 72 °C por 1 min, amplificando um produto PCR de 354 pares de base (bp).</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>mnr2b-hs:opTDP-43h construção<ol>
<li>Construa um plasmídeo carregando o de expressão para o TDP-43/TARDBP (TDP-43h) humano que é marcado com mRFP1 e CRY2olig no N- e C-termini, respectivamente (doravante, opTDP-43h)14. NOTA: O fragmento opTDP-43h deve ser flanqueado com a sequência de promotor de genes hsp70l de zebrafish hsp70l (650 bp) e a sequência de sinal de poliadenylation (polyA), seguido por um gene de resistência à kanamicina (hsp70lp-opTDP-43h-polyA-Kan)14.</li>
		<li>Amplie o hsp70l-opTDP-43h-polyA-Kan com primers que anneal hsp70l e Kan e contenha sequências de 45 bps do upstream e downstream dos codons iniciadores do gene mnr2b por PCR (GXL DNA Polymerase) usando o par de primer mnr2b-hspGFF-Forward (5'-tat cag cgc aat tac ctg caa cta taa aca caa caa aag tgt tgc tgc aGA ATT CAC TGG AGG CTT CCA GAA C-3') e Km-r (5'-ggt tct tct tct aaa agg gcg tcg atcc ctg aag ttc ttt gac ttt tcc atC AAT TCA GAA GAA CTC GTC AAG AA-3') com as seguintes condições: um passo de desnaturação a 98 °C por 1 min, seguido por 30 ciclos de denaturação a 95 °C para 10 s, primer annealing a 55 °C para 15 s, e extensão primer a 68 °C para 30 s, amplificando um produto PCR de ~5,7 bp.</li>
		<li>Separe os produtos PCR por eletroforese de gel agarose (100 V) e purifique a banda de DNA hsp70lp-opTDP-43h-polyA-Kan com uma coluna de DNA. Ajuste a concentração do hsp70lp-opTDP-43h-polyA-Kan purificado para 50 ng/μL no buffer Tris-EDTA (TE) contendo 10 mM Tris-HCl (pH 8.0) e 1 mM EDTA.</li>
		<li>Introduza o hsp70lp-opTDP-43h-polyA-Kan em CH211-172N16-iTol2A por eletroporação conforme descrito em Warming et al.18 e selecione transformadores resistentes à ampicilina e kanamycina em placas de ágar LB. CH211-172N16-iTol2A carregando o hsp70lp-opTDP-43h-polyA-Kan é designado como mnr2b-hs:opTDP-43h.</li>
		<li>Purifique mnr2b-hs:opTDP-43h usando um kit de purificação BAC e dissolva-o a 250 ng/μL em TE após extração fenol/clorofórmio.</li>
	</ol></li>
	<li>mnr2b-hs:Construção EGFP-TDP-43z<ol>
<li>Construa outro plasmídeo carregando o tardbp tipo zebrafish que é marcado com proteína fluorescente verde aprimorada (EGFP) em seu N-terminus (EGFP-TDP-43z) em vez de opTDP-4 3h mas é idêntico ao convígimento hsp70l-opTDP-43h-polyA-Kan (hsp70l-EGFP-TDP-43z-polyA-Kan)14. Use EGFP-TDP-43z como um controle interno para a estimulação de luz de opTDP-43h.</li>
		<li>Construa o CH211-172N16-iTol2A abrigando o hsp70lp-EGFP-TDP-43z-polyA-Kan no lócus mnr2b, conforme descrito em 1.2.1-1.2.5. CH211-172N16-iTol2A carregando o hsp70lp-EGFP-TDP-43z-polyA-Kan é designado como mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Transgênese bac mediada por transposon de Tol2 em zebrafish
<ol><li>Prepare a solução de injeção contendo 40 mM KCl, vermelho fenol (10% v/v), 25 ng/μL do mnr2b-hs:opTDP-43h DNA e 25 ng/μL Tol2 transposase mRNA19.</li>
	<li>Injete 1 nL da solução de injeção (uma gotícula com diâmetro de aproximadamente 123 μm calibrado em óleo mineral) no citosol de embriões de zebrafish tipo selvagem no estágio de uma célula. Trie o peixe injetado para a formação de agregados positivos de proteína fluorescente vermelha (RFP) em vários tecidos embrionários, incluindo neurônios motores espinhais, sob um estereópio de fluorescência em 2-3 dias após a fertilização (dpf). Elevar o peixe RFP positivo para a idade adulta.</li>
	<li>Injete o DNA mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z conforme descrito em 2.1 e 2.2. Elevar o peixe positivo do EGFP para a idade adulta.</li>
	<li>Depois de alguns meses, coloque peixes injetados sexualmente e peixes selvagens em pares em gaiolas de acasalamento padrão 2 L para obter descendentes de F1. Tela F1 peixe a 3 dpf para RFP (opTDP-43h) ou Fluorescência EGFP (EGFP-TDP-43z) na coluna motora espinhal usando um microscópio de epifluorescência equipado com uma lente objetiva Plan-Neofluar 5x/0.15. Normalmente, um peixe fundador é identificado entre 10 e 20 peixes injetados (a taxa de transmissão de germes é de 5%-10%).</li>
	<li>Isole e compare múltiplos Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] e Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] inserções de diferentes peixes fundadores, como a intensidade, mas não o padrão, de expressão opTDP-43h ou EGFP-TDP-43z pode variar entre peixes fundadores devido aos efeitos de posição cromossômica.</li>
	<li>Cross Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] e Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] linhas de peixe para obter descendentes contendo Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] peixe transgênico duplo em uma razão mendeliana.</li>
	<li>Levante o peixe em um prato plástico contendo 30 mL de tampão E3 (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM MgSO4, 10-5% Methylene Blue) e adicionar 0,003% (w/v) N-phenylthiourea a 8-10 h pós-fertilização (hpf) para inibir melanogênese.</li>
	<li>Cubra o prato de plástico com papel alumínio após 30 cvf.</li>
</ol>3. Preparação de LED para iluminação de luz azul
<ol><li>Ligue um painel LED usando o aplicativo associado instalado em um tablet/telefone. Coloque a sonda de um espectrômetro em um poço vazio de um prato de 6 poços e ajuste a luz LED para o comprimento de onda atingindo ~456 nm através da aplicação. Coloque o sensor óptico de um medidor óptico no poço vazio e ajuste a potência da luz LED (~0,61 mW/cm2). A configuração da luz LED pode ser salva e pode ser recuperada no aplicativo.</li>
	<li>Introduza a configuração do painel prato/LED à incubadora a 28 °C. Termine esta etapa antes que a imagem do peixe comece em 48 hpf.</li>
</ol>4. Imagem de larvas de zebrafish expressando TDP-43 optogenética
<ol><li>Selecione Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] peixe transgênico duplo pelo menos antes de 47 hpf, com base na fluorescência RFP (opTDP-43h) ou EGFP (EGFP-TDP-43z) na coluna motora espinhal usando a configuração do microscópio de epifluorescência descrito acima.</li>
	<li>Deschorionato o Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] peixe transgênico duplo.</li>
	<li>Pré-aqueça 1% de baixa temperatura de fusão agarose contendo 250 μg/mL de etil 3-aminobenzoato de metanosulfonato a 42 °C.</li>
	<li>Anestesiar brevemente Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43] peixe transgênico duplo a 48 hpf no buffer E3 contendo a mesma concentração de Tricane.</li>
	<li>Coloque uma gota da temperatura de fusão pré-aquecido de 1% baixa agarose no prato de base de vidro à temperatura ambiente. O diâmetro da gota de agarose em forma de cúpula no prato de vidro é de 8-10 mm.</li>
	<li>Usando uma pipeta Pasteur, adicione o peixe anestesiado à baixa temperatura de fusão no prato da base de vidro e, em seguida, misture por pipetação algumas vezes. Minimize a quantidade do tampão E3 adicionado à agarose junto com o peixe.</li>
	<li>Mantenha o peixe de lado usando uma agulha de seringa durante a solidificação da agarose (tipicamente ~1 min) para garantir que a medula espinhal esteja em uma posição horizontal apropriada. Após a solidificação, coloque algumas gotas de tampão E3 no peixe montado em agarose em forma de cúpula.</li>
	<li>Adquira seções z confocal serial da medula espinhal através da varredura com um microscópio confocal equipado com uma lente objetiva de imersão de água de 20x com a abertura numérica 1.00, usando uma velocidade de varredura de 4,0 μs por pixel (12 bits por pixel), um tamanho de passo de 1,0 μm por fatia para o objetivo, e uma combinação de excitação/emissão de ondas: Canal 1) 473/510 nm para EGFP e Canal 2) 559/583 nm para mRFP1. NOTA: A cloaca no lado ventral do peixe está incluída nas regiões de interesse (ROI) como referência, o que ajuda a identificar e comparar os segmentos espinhais (níveis 16-17) nos pontos de tempo.</li>
	<li>Remova o peixe da agarose, rachando cuidadosamente a agarose com uma agulha de seringa assim que a imagem estiver completa. Mantenha a quantidade de tempo que o peixe está embutido na agarose o mais curto possível, embora a incorporação de agarose por <30 min não afete a viabilidade do peixe.</li>
</ol>5. Estimulação leve de peixe opTDP-43h expressando por iluminação de campo de uma luz diodo emissor de luz azul (LED)
<ol><li>Adicione 7,5 mL de tampão E3 ao poço e coloque o tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] peixe transgênico duplo no poço. Coloque o prato de seis poços no painel LED mantendo o prato e o painel LED 5 mm separados com um espaçador (por exemplo, com cinco copos de slides empilhados).</li>
	<li>Ligue a luz LED azul. Mantenha alguns dos peixes Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] peixe transgênico duplo em um prato separado de seis poços coberto com folha de alumínio quando peixes de controle nãoilluminados são necessários (ou seja, em condições escuras)14.</li>
	<li>Após a iluminação (por exemplo, por 24h a 72 cvf na Figura 3), imagine a medula espinhal do peixe iluminado repetindo os passos 4.3 - 4.9.</li>
</ol>6. Visualização da realocação citoplasmática do TDP-43 optogenético nos neurônios motores espinhais
<ol><li>Abra o arquivo de imagem em ImageJ/Fiji21 (Versão: 2.1.0/1.53c), um programa de processamento de imagem Java de código aberto desenvolvido pela NIH Image, que pode ser baixado a partir de https://imagej.net/Fiji/Downloads.</li>
	<li>Use a barra de rolagem Z para mover-se através dos planos focais. Crie uma projeção de intensidade máxima de várias fatias clicando em | de imagem Pilhas | | do projeto Z Intensidade máxima e configuração Inicie a fatia e Pare a fatia que cubra os hemisegmentos da coluna motora espinhal.</li>
	<li>Divida a imagem multicanal em duas imagens de um único canal clicando em Imagem | | de cor Canais divididos.</li>
	<li>Melhore o sinal EGFP-TDP-43z para garantir que o EGFP-TDP-43z citoplasmámico seja visível claramente clicando em | Ajuste | Brilho/Contraste e ajuste mínimo
</li>
	<li>Abra o gerenciador de ROI clicando em Analisar | Ferramentas | Gerente do ROI. Encontre as células identificáveis em ambas as imagens a 48 hpf e 72 hpf, com base nas posições relativas dos corpos celulares. Defina os ROIs delineando os contornos dos corpos celulares de neurônios motores espinhal únicos visualizados pelo sinal EGFP-TDP-43z usando seleções freehand e, em seguida, clicando em Adicionar[t] no gerenciador de ROI.</li>
	<li>Defina um eixo principal da soma, desenhando uma linha reta usando Reta e clicando em Analisar | Perfil de enredo para imagens EGFP-TDP-43z (C1) e opTDP-43h (C2) a 48 e 72 cvf.</li>
	<li>Normalize o Perfil de Parcela dividindo os valores pelo maior valor para cada sinal EGFP-TDP-43z e opTDP-43h. Plote os valores normalizados com coordenadas x-y, onde x e y representam o eixo principal das intensidades soma e relativa fluorescentes, respectivamente, utilizando gráfico XY em um software estatístico.</li>
</ol>7. Comparação ratiométrica entre os sinais opTDP-43h e EGFP-TDP-43z usando imageJ/fiji
<ol><li>Abra o arquivo de imagem em ImageJ/Fiji e defina ROIs para células mnr2b-positivas usando uma imagem de projeção de intensidade máxima de EGFP-TDP-43z como em 6.1-6.5. Adicione um ROI fora da medula espinhal ventral (por exemplo, notochord) para representar o sinal de fundo (ROI de fundo).</li>
	<li>Para cada imagem EGFP-TDP-43z e opTDP-43, crie uma projeção de várias fatias clicando em Imagem | Pilhas | | do projeto Z Soma Fatias e definir Iniciar fatia e Parar fatia que cubra a coluna do motor hemispinal.</li>
	<li>Abra o gerenciador de ROI criado com a imagem de projeção de intensidade máxima. Exibir os ROIs na imagem Sum Slices selecionando a janela de imagem para EGFP-TDP-43z e, em seguida, clicando em Mostrar Tudo no gerenciador de ROI. Clique em Medir no gerenciador de ROI para obter valores médios para cada ROI.</li>
	<li>Adquirir valores médios para opTDP-43h seguindo o mesmo procedimento previsto em 7.3.</li>
	<li>Para cada ROI, depois de subtrair a média para o ROI de fundo, divida a média subtraída para opTDP-43h pela média subtraída para EGFP-TDP-43z para obter o valor ratiométrico. Os valores ratiométricos podem ser comparados entre diferentes pontos de tempo e apresentados usando gráfico de coluna no software Prism.</li>
</ol>

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<li>Taslimi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+optogenetic+clustering+tool+for+probing+protein+interaction+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">An optimized optogenetic clustering tool for probing protein interaction and function.</a> Nature Communications. 5, 4925(2014).</li>
<li>Asakawa, K., Kawakami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocadherin-mediated+cell+repulsion+controls+the+central+topography+and+efferent+projections+of+the+abducens+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Protocadherin-mediated cell repulsion controls the central topography and efferent projections of the abducens nucleus.</a> Cell Reports. 24 (6), 1562-1572 (2018).</li>
<li>Redchuk, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+regulation+of+endogenous+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Optogenetic regulation of endogenous proteins.</a> Nature Communications. 11 (1), 605(2020).</li>
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KA e KK são os inventores da propriedade intelectual descrita neste manuscrito e patentes provisórias foram apresentadas pelo Instituto Nacional de Genética.

A expressão mediada por mnr2b-BAC de opTDP-43h e EGFP-TDP-43z em zebrafish fornece uma oportunidade única para imagens ao vivo da transição de fase TDP-43 nos neurônios motores espinhais. A transparência óptica dos tecidos corporais das larvas de zebrafish permite a simples e não invasiva estimulação optogenética de opTDP-43h. Comparações entre neurônios motores espinhais únicos ao longo do tempo demonstraram que a oligomerização dependente da luz do opTDP-43h causa seu agrupamento citoplasmical, que lembra a pa...

Os grânulos de ribonucleoproteína (RNP) controlam uma miríade de atividades celulares no núcleo e citoplasma, montando partições sem membrana através da separação de fase líquido-líquido (LLPS), fenômeno no qual um fluido homogêneo se mistura em duas fases líquidas distintas1,2. Os LLPS desregulados de proteínas de ligação de RNA que normalmente funcionam como componentes de grânulo RNP promovem a transição de fase anormal, levando à agregação de proteínas. Esse processo foi implicado em doenças neurodesenvolvimentantes e neurodegenerativas3,4,5. A avaliação precisa de uma relação causal entre LLPS aberrantes de proteínas ligantes de RNA e patogênese de doenças é crucial para determinar se e como o LLPS pode ser explorado como um alvo terapêutico eficaz. LLPS de proteínas de ligação de RNA é relativamente fácil de estudar in vitro e em modelos unicelulares, mas é difícil em organismos multicelulares, especialmente em vertebrados. Um requisito crítico para analisar tais LLPS em células individuais dentro de um ambiente tecidual é expressar uma sonda para a imagem e manipulação de LLPS em um tipo de interesse celular vulnerável à doença.
A esclerose lateral amiotrófica (ELA) é uma doença neurológica fatal na qual os neurônios motores do cérebro e da medula espinhal são perdidos seletivamente e progressivamente devido à degeneração. Até o momento, mutações em mais de 25 genes foram associadas à forma herediável (ou familiar) da ELA, que representa 5%-10% do total de casos de ELA, e alguns desses genes causadores de ELA codificam proteínas de ligação de RNA constituídas por RNPs, como hnRNPA1, TDP-43 e FUS6,7. Além disso, a forma esporádica da ELA, que responde por 90%-95% do total de casos de ELA, é caracterizada pela agregação citoplasmática do TDP-43 depositado em neurônios motores degenerados. Uma das principais características dessas proteínas ligadas à RNA associadas à ALS são suas regiões intrinsecamente desordenadas (IDRs) ou domínios de baixa complexidade que carecem de estruturas tridimensionais ordenadas e mediam interações proteína-proteína fracas com muitas proteínas diferentes que impulsionam LLPS7,8. O fato de que mutações causadoras de ELA ocorrem frequentemente nos IDRs levou à ideia de que LLPS aberrantes e transição de fase dessas proteínas relacionadas à ELA podem estar por trás da patogênese da ALS9,10.
Recentemente, o método optoDroplet, uma técnica optogenética baseada em Cryptochrome 2 que permite a modulação de interações proteína-proteína por luz, foi desenvolvido para induzir a transição de fase de proteínas com IDRs11. Como esta técnica foi estendida com sucesso ao TDP-43, começou a descobrir os mecanismos subjacentes à transição de fase patológica do TDP-43 e sua citotoxicidade associada12,13,14,15. Neste protocolo, descrevemos um método genético para fornecer um TDP-43 optogenético para tipos de células vulneráveis à ALS, ou seja, neurônios motores espinhais em zebrafish usando o BAC para o gene mnr2b/mnx2b codificando uma proteína homeodomina para especificação de neurônio motor16,17. A alta translucência das larvas de zebrafish permite uma estimulação leve simples e não invasiva do TDP-43 optogenético que desencadeia sua transição de fase nos neurônios motores espinhais. Também apresentamos um fluxo de trabalho básico para a imagem ao vivo dos neurônios motores espinhais do zebrafish e análise de imagem usando o software Fiji/ImageJ livremente disponível para caracterizar as respostas do TDP-43 optogenético à estimulação da luz. Esses métodos permitem uma investigação da transição de fase do TDP-43 em um ambiente celular vulnerável à ALS e devem ajudar a explorar suas consequências patológicas em níveis celulares e comportamentais.

<table><tbody><tr><td>Microscópio confocal</td><td>Olympus</td><td>FV1200</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio de epifluorescência</td><td>ZEISS</td><td>Axioimager Z1</td><td></td></tr><tr><td>Estereomicroscópio de fluorescência</td><td>Leica</td><td>MZ16FA</td><td></td></tr><tr><td>Prato de base de vidro</td><td>IWAKI</td><td>3910-035</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora</td><td>MEE</td><td>CN-25C</td><td></td></tr><tr><td>Painel de LED</td><td>Nanoleaf Limited</td><td>Nanoleaf AURORA kit</td><td></td>mais inteligente</tr><tr><td>Mupid-2plus</td><td>TAKARA</td><td>AD110</td><td></td></tr><tr><td>NucleoBond BAC100</td><td>MACHEREY-NAGEL</td><td>740579</td><td></td></tr><tr><td>NuSieve GTG Agarose</td><td>LONZA</td><td>50181</td><td></td></tr><tr><td>Lente objetiva</td><td>Olympus</td><td>XLUMPlanFL N 20&vezes;/1,00</td><td></td></tr><tr><td>Lente objetiva</td><td>ZEISS</td><td>Plan-Neofluar 5x/0,15</td><td></td></tr><tr><td>Medidor de potência óptica</td><td>HIOKI</td><td>3664</td><td></td></tr><tr><td>Sensor óptico</td><td>HIOKI</td><td>9742-10</td><td></td></tr><tr><td>Solução vermelha de fenol 0,5%</td> <td>Merck</td><td>P0290-100ML</td><td></td></tr><tr><td>PrimeSTAR GXL DNA Polimerase</td><td>TAKARA</td><td>R050A</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick Kit de extração de gel</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>Prato de seis poços</td><td>FALCON</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>Sonda de espectrômetro BLUE-Wave</td><td>StellerNet Inc.</td><td>VIS-50</td><td></td></tr><tr><td>Agulha de seringa</td><td>TERUMO</td><td>NN-2725R</td><td></td></tr><tr><td>TaKaRa Ex Taq</td><td>TAKARA</td><td>RR001A</td><td></td></tr><tr><td>Tricane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>Zebrafish BAC clone CH211-172N16</td><td>BACPAC Genômica</td><td>CH211-172N16</td><td></td></tr></tbody></table>

transição de fase optogenética do tdp-43 em neurônios motores espinhais de larvas de zebrafish

Optogenetic Phase Transition of TDP-43 in Spinal Motor Neurons of Zebrafish Larvae

A agregação anormal de proteínas e a vulnerabilidade neuronal seletiva são duas marcas principais de doenças neurodegenerativas. As relações causais entre essas características podem ser interrogadas controlando a transição de fase de uma proteína associada à doença em um tipo celular vulnerável, embora essa abordagem experimental tenha sido limitada até agora. Aqui, descrevemos um protocolo para induzir a transição de fase da proteína de ligação de RNA/DNA TDP-43 em neurônios motores espinhais de larvas de zebrafish para modelagem da agregação citoplasmática de TDP-43 ocorrendo em neurônios motores degenerados na esclerose lateral amiotrófica (ELA). Descrevemos um método genético baseado em cromossomo artificial bacteriano (BAC) para fornecer uma variante optogenética TDP-43 seletivamente aos neurônios motores espinhais de zebrafish. A alta translucência das larvas de zebrafish permite a transição de fase do TDP-43 optogenético nos neurônios motores espinhais por uma simples iluminação externa usando um diodo emissor de luz (LED) contra peixes desenfreados. Também apresentamos um fluxo básico de imagens ao vivo dos neurônios motores espinhais do zebrafish e análise de imagem com software Fiji/ImageJ livremente disponível para caracterizar respostas do TDP-43 optogenético à iluminação da luz. Este protocolo permite a caracterização da transição de fase TDP-43 e formação agregada em um ambiente celular vulnerável à ALS, o que deve facilitar a investigação de suas consequências celulares e comportamentais.

Imagem ao vivo de proteínas TDP-43 optogenéticas e não optogenéticas nos neurônios motores espinhais mnr2b+ de larvas de zebrafish Para induzir a transição de fase TDP-43 nos neurônios motores espinhais em zebrafish, um TDP-43h humano que é marcado com mRFP1 e CRY2olig22 no N-e C-termini, respectivamente, foi construído e designado como opTDP-43h14 (Figura 1A). O fragmento genético...

Descrevemos um protocolo para induzir a transição de fase da proteína de ligação de DNA TAR 43 (TDP-43) por luz nos neurônios motores espinhais usando zebrafish como modelo.

Transição de fase optogenética do TDP-43 em neurônios motores espinhais de larvas de zebrafish

Abnormal protein aggregation and selective neuronal vulnerability are two major hallmarks of neurodegenerative diseases. Causal relationships between ...

Assim, este protocolo nos permite induzir transições de fase patológica do TDP-43 e abordar sua consequência celular nos neurônios motores espinhais in vivo, o que é relevante para entender por que os neurônios motores degeneram em ELA. Devido à alta transparência das larvas de zebrafish, os neurônios motores da medula espinhal são diretamente visíveis. Assim, pode-se visualizar o comportamento dinâmico do TDP-43 passando por transições de fase em neurônios motores únicos espinhais.Este método oferece um novo modelo animal de ELA. Acreditamos que qualquer método que possa impedir a transição e agregação de fase tdp-43 induzidos pela luz neste modelo de ELA pode ser um potencial candidato à terapia de ELA. Outras proteínas relacionadas à ELA com regiões intrinsecamente desordenadas podem ser expressas para explorar a neurotoxicidade associada às transições de fases anormais.A chave para o sucesso nesta abordagem é expressar o TDP-43 optogenético nos neurônios motores espinhais a nível nãotóxico. A transgênese BAC é um passo demorado, mas uma vez que você cria um peixe transgênico adequado, os seguintes passos são relativamente mais fáceis e simples. Para começar, ligue o diodo emissor de luz, ou painel LED, usando o aplicativo associado instalado em um tablet ou telefone.Em seguida, coloque a sonda espectrômetro em um poço vazio de um prato de 6 poços. Em seguida, usando o aplicativo, ajuste a luz LED para um comprimento de onda de 456 nm. Coloque o sensor óptico de um medidor óptico no poço vazio e ajuste a potência da luz LED.Em seguida, coloque o prato com a configuração do painel LED em uma incubadora a 28 C.Para a imagem das larvas de peixe zebra expressando TDP-43 optogenética, descoriorar o peixe transgênico duplo e anestesia-los em tampão E3 contendo 250 g/mL de Tricane. Em seguida, pré-aqueça 1% de baixa temperatura de fusão agarose contendo 250 g/mL de etil 3-aminobenzoato metanosulfonato a 42 C.Em seguida, coloque uma gota da agarose no prato de base de vidro. O diâmetro da gota de agarose em forma de cúpula no prato de vidro deve ser de 8 a 10 mm.Em seguida, usando uma pipeta Pasteur, adicione o peixe anestesiado à agarose no prato à base de vidro. Minimize a quantidade de tampão E3 adicionado à agarose junto com o peixe. Em seguida, misture por pipetting algumas vezes.Durante a solidificação da agarose, mantenha o peixe de lado usando uma agulha de seringa, de tal forma que a medula espinhal esteja em uma posição horizontal apropriada. Depois que a agarose se solidificar, adicione algumas gotas de tampão E3 no peixe montado em agarose em forma de cúpula. Usando um microscópio confocal equipado com uma lente objetiva de imersão de água 20 vezes, adquira seções z confocal serial da medula espinhal.Inclua a cloaca no lado ventral do peixe nas regiões de interesse como referência para identificar e comparar os segmentos espinhais através dos pontos de tempo. Assim que a imagem estiver completa, use uma agulha de seringa para quebrar cuidadosamente a agarose e remover o peixe da agarose. Mantenha a quantidade de tempo que o peixe está embutido na agarose o mais curto possível, embora a garose incorporando por menos de 30 minutos não afete a viabilidade do peixe.Adicione 7,5 mL de tampão E3 a um poço de um prato de 6 poços e coloque o peixe duplo transgênico imaged nesse poço. Em seguida, coloque o prato no painel LED, mantendo o prato e o painel LED 5 mm separados com um espaçador, e ligue a luz LED azul. Mantenha alguns peixes transgênicos duplos em um prato separado de 6 poços coberto com papel alumínio para peixes de controle nãoilluminados.Após o tempo de iluminação desejado, imagem da medula espinhal do peixe iluminado como demonstrado anteriormente. A realocação citoplasmática do opTDP-43h em neurônios motores espinhal único foi visualizada separando as imagens da série Z adquiridas aos 48. e 72 horas pós fertilização em cada canal EGFP-TDP-43z e opTDP-43h.A partir de imagens de projeção de intensidade máxima de EGFP-TDP-43z, um único neurônio espinhal isolado identificável em ambos os 48. e 72 horas após a fertilização foram selecionadas. Regiões de interesse que cobriam as somas dos neurônios motores foram definidas pelo rastreamento da borda do sinal EGFP em 48.e 72 horas após a fertilização. A intensidade fluorescente normalizada ao longo do eixo principal da soma foi traçada. E em 48 horas após a fertilização, os padrões de ambos os sinais se sobrepuseram em grande parte um ao outro.Em contraste, às 72 horas, o pico para o sinal opTDP-43h foi encontrado na região onde o sinal EGFP-TDP-43z estava baixo, indicando a realocação citoplasmática de opTDP-43h. Para quantificar os sinais opTDP-43h e EGFP-TDP-43z antes e depois da estimulação da luz azul, algumas fatias de imagens de projeção para cada canal das mesmas imagens da série Z foram produzidas em 48. e 72 horas após a fertilização.Das quatro células mnr2b+que foram investigadas, a célula 1, notavelmente exibiu um sinal EGFP-TDP-43z saturado. Os valores relativos de opTDP-43h para EGFP-TDP-43z foram calculados dividindo o valor RFP pelo valor de GFP. As células 2 a 4 apresentaram níveis de opTDP-43h decrescentes após a iluminação da luz azul.É importante minimizar o tempo em que os peixes estão embutidos na agarose para mantê-los saudáveis. Ajustando a intensidade e duração da iluminação LED, controlamos a transição de fase TDP-43 de forma regulamentada temporária, o que pode ajudar a dissecar a progressão da transição patológica de fase TDP-43 no neurônio motor.

optogenetic-phase-transition-tdp-43-spinal-motor-neurons-zebrafish

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Este vídeo descreve técnicas optogenéticas ativando neurônios somatossensoriais geneticamente modificados e registrando a resposta comportamental provocada com uma câmera de vídeo de alta velocidade.

Optogenética do peixe-zebra: ativando neurônios somatossensoriais geneticamente modificados para estudar respostas comportamentais larvais

Neste vídeo, descrevemos um ensaio de separação de fases, em que proteínas intracelulares compreendendo regiões intrinsecamente desordenadas fundidas a um domínio de oligomerização fotossensível são induzidas por meio de exposição à luz azul para se autoassociarem em condensados semelhantes a líquidos sem membrana.

Ensaio de Separação de Fase de Proteína: Um Método Optogenético para Separação de Fase de Proteína de Ligação a RNA Mutante em Neurônios Motores Espinhais de Larvas de Peixe-Zebra

Este vídeo demonstra um ensaio não invasivo para estudar a eletrofisiologia dos neurônios motores em embriões de peixe-zebra. Ao medir o enrolamento da cauda nos embriões como resultado da despolarização espontânea dos neurônios motores da medula espinhal, um bloqueador dos canais de sódio é aplicado para reduzir a frequência de enrolamento Em seguida, os embriões são imobilizados em agarose e colocados sob um microscópio de fluorescência. Os neurônios motores geneticamente modificados...

Uma abordagem não invasiva para estudar a eletrofisiologia dos neurônios motores em embriões de peixe-zebra

Optogenética técnicas tornaram possível estudar a contribuição dos neurónios específicos para o comportamento. Nós descrevemos um método em zebrafish larval para ativar neurônios individuais somatossensoriais expressando uma variante channelrodopsina (chef) com um diodo-bombeado do laser de estado sólido (DPSS) e registrando os comportamentos eliciados com uma câmera de vídeo de alta velocidade.

Optogenética ativação de neurônios Zebrafish somatossensoriais usando chef-tdTomato

Os protocolos descritos aqui permitem o estudo das propriedades elétricas de células excitáveis nas condições fisiológicas mais não invasivas, empregando embriões de peixe-zebra em um sistema in vivo, juntamente com um indicador de voltagem geneticamente codificado (GEVI) baseado em transferência de energia de ressonância de fluorescência (FRET) seletivamente expresso no tipo de célula de interesse.

Potencial de membrana de neurônio motor biossensível em embriões vivos de peixe-zebra

Este manuscrito descreve métodos para registos electrofisiolicos de neurónios espinais de embriões de peixe-zebra e larvas. A preparação mantém neurónios in situ e muitas vezes envolve a dissecção mínima. Estes métodos permitem o estudo electrofisiológico de uma variedade de neurónios espinais, a partir da aquisição inicial excitabilidade eléctrica através dos primeiros estádios larvares.

zebrafish<em&gt; In Situ</em&gt; Spinal Cord Preparação para gravações eletrofisiológicas da Spinal Sensorial e Motor Neurons

Aqui, apresentamos um protocolo para mostrar como célula photoconversion é conseguida através da exposição UV para áreas específicas, expressando a proteína fluorescente, Eos, em animais vivos.

Photoconversion de célula única no Zebrafish intacta vida

Optogenética é uma ferramenta poderosa com aplicações abrangentes. Este protocolo demonstra como alcançar a expressão genética indutível à luz em embriões de zebrafish usando o sistema TAEL/C120 de resposta à luz azul.

Expressão GFP induzida pela luz em embriões de zebrafish usando o sistema OPtogenético TAEL/C120

A manipulação optogenética de vias de sinalização pode ser uma estratégia poderosa para investigar como a sinalização é decodificada no desenvolvimento, regeneração, homeostase e doença. Este protocolo fornece diretrizes práticas para o uso de ativadores de sinalização nodal e proteína morfogênica óssea (BMP) baseados em luz-oxigênio-voltagem no embrião inicial do peixe-zebra.

Ativação da Sinalização Optogenética em Embriões de Zebrafish

Esse protocolo estabelece um paradigma de fenotipagem comportamental em larvas de peixe-zebra tratadas com MPTP para avaliar déficits motores e não motores, semelhantes à doença de Parkinson.

Perfilamento fenotípico de fenótipos comportamentais semelhantes ao parkinsoniano induzidos por MPTP em larvas de peixe-zebra com base em experimento comportamental

Aprenda a induzir transições de fase optogenéticas do TDP-43 em neurônios motores espinhais de larvas de zebrafish. Este método permite visualizar o comportamento dinâmico da proteína in vivo e estabelece um novo modelo animal para estudar a degeneração motora na ELA.

Transição de fase optogenética do TDP-43 em neurônios motores espinhais de larvas de zebrafish

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