Name: Detecção de expressão receptora acoplada à proteína G em neurônios aferentes do mouse vagal usando multiplex in situ hibridização (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 16 s
Description: Aprenda a detectar receptores acoplados à proteína G em neurônios vagais de camundongos usando hibridização in situ multiplex. Este método permite mapear perfis transcricionais com alta sensibilidade.

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Este trabalho foi apoiado pelo Núcleo de Neuronatomia/Histologia/Injeção Cerebral financiado pela concessão do NIH #5P01DK119130-02. Os autores gostariam de reconhecer a assistência do UT Southwestern Live Cell Imaging Facility (liderado pelo Dr. Phelps) e sua equipe (Abhijit Bugde e Marcel Mettlen), apoiado em parte pelo NIH Grant #1S10OD021684-01, um recurso compartilhado do Centro de Câncer Harold C. Simmons, apoiado em parte por uma subvenção de apoio ao Centro de Câncer NCI, P30 CA142543.

NOTA: Os camundongos utilizados neste estudo eram machos do tipo selvagem em um fundo C57BL/6J puro. Um total de 4 camundongos foram usados para multiplex ISH. Todos os ratos tinham aproximadamente 8 semanas de idade na época do sacrifício. Um rato macho (aproximadamente um ano de idade) também foi usado para demonstrar fluorescência endógena associada ao envelhecimento. Os animais estavam alojados em gaiolas ventiladas dentro de uma instalação de barreira com acesso a ad libitum a alimentos e água. O Comitê de Cuidados e Uso Institucional de Animais do Centro Médico do Sudoeste da UT Southwestern analisou e aprovou os procedimentos descritos abaixo. Detalhes sobre reagentes e ferramentas podem ser encontrados na Tabela de Materiais.
1. Coleta de amostras
<ol><li>No dia do sacrifício, administre uma overdose de hidrato de cloro (500 mg/kg, i.p.) aos camundongos. Perfume os camundongos profundamente anestesiados transcardialmente usando uma bomba peristáltica com 5 mL de soro fisco tamponado de fosfato de 1x (PBS), seguido por 50 mL de 10% de formalina à temperatura ambiente. NOTA: Isto é feito em um capô de fumaça para evitar a inalação de formalina.</li>
	<li>À medida que a gânglios nodose, petrosal e jugular são fundidos para formar uma única massa gangliônica no rato15, coletar cuidadosamente toda a massa gânnica vagal de cada lado (esquerda e direita) com a ajuda de um escopo dissecando e tesouras de mola fina e fórceps (ver a Tabela dos Materiais).</li>
	<li>Ao decapitar o rato com um par de tesouras grandes (veja a Tabela de Materiais),evite esmagar o tronco cerebral.</li>
	<li>Seguindo uma abordagem de dissecção descrita antes no rato40,remova os músculos esternonóides e omohioides laterais à traqueia com pequenos fórceps(Tabela de Materiais) para expor o osso occipital. Limpe toda a região do músculo, tecido adiposo e tecido conjuntivo até que a artéria carótida, o nervo vago, o nervo hipoglossal e o foien magnum sejam visíveis. Corte todo o nervo hipoglossal com uma pequena tesoura de mola(Tabela de Materiais).</li>
	<li>Procure o gânglio de nodose como uma massa translúcida perto do foramen magnum15. Utilizando uma tesoura pequena(Tabela de Materiais),quebre cuidadosamente o osso occipital para expor ainda mais o gânglio jugular. Procure por melanócitos negros na superfície da jugular como um marco visual.</li>
	<li>Corte os apegos nervosos entre a massa gangliônica vagal e extraia toda a massa gangliônica puxando suavemente a extremidade periférica do nervo vago enquanto simultaneamente corta o gânglio jugular em direção ao tronco cerebral com uma pequena tesoura de mola(Tabela de Materiais).</li>
	<li>Remova o tecido conjuntivo e a gordura grudando no nervo vago e na massa gangliônica o máximo possível.</li>
	<li>Como é fácil perder um gânglio durante a transferência de um tubo para o outro, mantenha ~0,5 cm do nervo vago para facilitar o manuseio e localização das amostras.</li>
	<li>Coloque gânglios com a ajuda de fórceps finos em tubos de microcentrifus de 1,5 mL e incubar a 4 °C em formalina por 24h e com 30% de sacarose por mais 24 h.</li>
	<li>Posicione o gânglio dentro de uma pequena gota (~4 mm Ø) do meio de temperatura de corte ideal (OCT) em um pedaço de papel alumínio. Em seguida, congele a amostra em um leito de gelo seco.</li>
	<li>Corte as amostras com um criostat a -20 °C em seções de 14 μm de espessura e colete em lâminas de microscópio de vidro como 3 séries 42 μm de distância. NOTA: Evite colocar seções próximas às bordas do slide. Para salvar os reagentes, mantenha as seções de tecido o mais apertadas possível, mas sem sobrepor.</li>
	<li>Armazene as amostras em um congelador de -80 °C até que seja necessário para ish por pelo menos 6 meses. NOTA: Consulte a Figura 1 para solucionar problemas para fluorescência endógena.</li>
</ol>2. Pré-tratamento e ISH
<ol><li>Antes do dia dos experimentos, vidros de laboratório autoclave para serem usados para ISH, incluindo pratos de coloração e frascos de tampão de lavagem. NOTA: Enquanto trabalhar em condições sem RNase não é crítico, use luvas o tempo todo. Mantenha as garrafas de solução de descontaminação RNase(Tabela de Materiais) ao alcance no caso de suspeita de contaminação.</li>
	<li>No primeiro dia, leve os slides à temperatura ambiente em um banco especificamente dedicado ao ISH. Enxágüe os slides em 1x PBS e asse-os por 30 minutos a 60 °C em um forno de cozimento(Tabela de Materiais).</li>
	<li>Corrija os slides em 4% de formalina para 15 min a 4 °C.</li>
	<li>Leve os reagentes no kit multiplex(Tabela de Materiais)para temperatura ambiente.</li>
	<li>Desidratar os slides em 50%, 70% e 100% etanol por 5 min cada. Aplique solução H2O2 às amostras por 10 minutos e depois enxágue em água duplamente destilada (ddH2O).</li>
	<li>Trate as amostras com o reagente de recuperação alvo por 5 min, enxágue em ddH2O seguido de 100% etanol e ar-seca. Usando uma caneta hidrofóbica, crie uma barreira ao redor das amostras. NOTA: Não aplique a barreira hidrofóbica muito próxima das seções teciduais.</li>
	<li>Aplique protease por 30 min a 40 °C em forno de hibridização(Tabela de Materiais).</li>
	<li>Enquanto isso, pré-aquece as sondas a 40 °C e esfrie-as à temperatura ambiente antes de usar. Incubar os slides com a combinação desejada de sondas-alvo (Cck1r-C3, Ghsr-C1, Phox2b-C2; ou Cck1r-C3, Ghsr-C1, Prdm12-C2) por 2h a 40 °C em um forno de hibridização.</li>
	<li>Incubar tecido de controle negativo com a sonda C1 (Dihydrodipicolinate reductase) por 2h a 40 °C em forno de hibridização.</li>
	<li>Enxágüe os slides no tampão de lavagem e armazene durante a noite em 5x citrato de sódio salino (SSC) à temperatura ambiente. Por conveniência, divida o experimento em dois dias. No dia seguinte, enxágue os slides com tampão de lavagem e incuba-os com reagentes de amplificação listados abaixo (veja o manual do usuário na Tabela de Materiais).</li>
	<li>Aplique AMP1 (30 min a 40 °C), AMP2 (30 min a 40 °C) e AMP 3 (15 min a 40 °C). Enxágüe no tampão de lavagem entre cada passo.</li>
	<li>Dissolva cada corante opala (Tabela de Materiais) em sulfóxido de dimetil e armazene as soluções a 4 °C até que seja necessário.</li>
	<li>Para o canal 1, incubar os slides com HRP-C1 (15 min a 40 °C) e Opal 520 (cor verde; diluição 1/1.500; 30 minutos a 40°C). Enxágüe no tampão de lavagem entre cada passo.</li>
	<li>Para o canal 2, incubar os slides com HRP-C2 (15 min a 40 °C) e Opal 570 (cor amarela; diluição 1/1.500; para 30 min a 40 °C). Enxágüe no tampão de lavagem entre cada passo.</li>
	<li>Para o canal 3, incubar os slides com HRP-C3 (15 min a 40 °C) e Opal 690 (cor vermelha distante; diluição 1/1.500; para 30 min a 40 °C). Enxágüe no tampão de lavagem entre cada passo.</li>
	<li>Lave os slides e exponha-os a 4′,6-diamidino-2-fenilôdole (DAPI) por 30 s.</li>
	<li>Aplique imediatamente o meio de montagem em cada lâmina e coloque uma mancha de cobertura sobre a seção tecidual.</li>
	<li>Mantenha os tecidos horizontais em um suporte de deslizamento a 4 °C até a imagem.</li>
</ol>3. Microscopia e análise de dados
NOTA: Os dados multiplex ISH podem ser visualizados com uma ampla gama de instrumentos com os filtros apropriados. No entanto, um método de imagem preferido é a microscopia confocal com objetivos de 20x e 63x (óleo); referem-se à discussão pelas razões. Consulte a Figura 2 para determinar a relação sinal-ruído ideal.
<ol><li>Use um microscópio confocal equipado com linhas laser de 488, 561 e 633 nm. Use os seguintes parâmetros de aquisição (ver Tabela 1): Opal 690 (HeNe 633 nm, faixa de detecção 668-696 nm, potência 2.0, ganho 724); Opala 570 (laser DPSS 561 nm, faixa de detecção 579-627 nm, <power 15.0, <gain 450); Opala 520 (laser de argônio 488 nm, faixa de detecção 499-535 nm , <power 6.0, <gain 830); DAPI (laser de diodo 405, faixa de detecção 415-502 nm, <power 12.0, <gain 532).</li>
	<li>Para melhorar a qualidade das imagens, adquira com uma média de linha de 4 e um tamanho de pixel de pelo menos 1024 x 1024. NOTA: Os parâmetros acima são fornecidos apenas como exemplo, e modificações são recomendadas dependendo de um instrumento, ampliação (20x ou 63x), níveis de expressão e níveis endógenos de fluorescência para qualquer tecido.</li>
	<li>Uma vez satisfeito com os parâmetros de aquisição, colete imagens usando as mesmas configurações. Atribua cores falsas a cada canal para facilitar a visualização. NOTA: Por exemplo, vermelho (Phox2b ou Prdm12), ciano (Cck1r), amarelo (Ghsr) e cinza (DAPI).</li>
	<li>Realize a contagem de células usando as imagens digitais identificando o contorno de perfis RNAscope positivos com um núcleo levemente manchado com DAPI. Calcule a porcentagem de perfis rnascope-positivos expressando cada transcrição [Figura 3A-C].</li>
	<li>Para melhorar o rigor e a precisão das estimativas, conte pelo menos 2.000 perfis neuronais de pelo menos 4 animais diferentes. Faça a contagem de gânglios esquerdo e direito separadamente.</li>
	<li>Insira os dados em um gráfico de tortas com o número total de perfis contados.</li>
	<li>Use software de imagem para adquirir imagens e costurar imagens 20x. Use ImageJ-Fiji e outro software de foto e design para gerar as placas finais. Aplique ajustes de contraste e leveza uniformemente a todas as imagens.</li>
</ol>

Os autores não declaram interesses financeiros concorrentes.

A técnica do ISH foi inventada no final da década de 196042. No entanto, não é até meados da década de 1980 que foi aplicado para a detecção de mRNAs nos sistemas nervosos central e periférico43,44. Considerando a heterogeneidade do sistema nervoso e questões recorrentes com anticorpos, a localização de uma transcrição específica no nível celular continua sendo uma ferramenta inestimável. No entanto, os métodos tradicionais do ISH têm perm...

Os corpos celulares de afferents vagais estão contidos na jugular, petrosal e nodose ganglia1,2,3. Seus axônios viajam juntos através de vários ramos do nervo vago para os territórios craniocervical, torácico e abdominal4,5,6,7. A partir de seus finais viscerais, os aferentes vagais podem responder a uma ampla gama de estímulos fisiológicos e nocivos8,9,10. No entanto, a distribuição de moléculas de sinalização e receptores envolvidos no sensor de detecção vagal permanece pouco caracterizada. Isso ocorre em parte porque os gânglios vagais, apesar de seu pequeno tamanho, expressam um amplo espectro de receptores, incluindo um grande número de GPCRs8,11,12,13. Além disso, os neurônios aferentes vagal são inerentemente heterogêneos e apresentam perfis moleculares distintos14. Para complicar a questão, a jugular, petrosal e nodose gânglios estão presos no rato, formando assim uma única massa gangliônica. Por último, em um subconjunto de animais, o gânglio de nodose é ligado ao simpático gânglio cervical superior15.
No passado, os pesquisadores recorreram à imunohistoquímica para estudar a maquiagem neuroquímica dos neurônios aferentesvagal 16,17,18. Embora a imunohistoquímica usando anticorpos validados seja útil, os resultados de estudos imunohistoquímicos devem ser interpretados com cautela. Por exemplo, inúmeros esforços para identificar anticorpos específicos contra GPCRs falharam19,20,21,22,23,24,25, levando os investigadores a concluir que a maioria dos anticorpos contra GPCRs não são confiáveis. Para contornar essas questões, o PCR quantitativo (qPCR) tem sido amplamente utilizado para avaliar a expressão genética na massa gangliônica do rodente vagal26,27,28,29. No entanto, examinar a expressão genética usando qPCR ocorre ao custo de uma perda de informações espaciais. Em particular, não se pode prever quantas células ou quais tipos de células expressam um determinado gene de interesse (por exemplo, nodose vs. células jugulares). As questões recorrentes também incluem a contaminação com tecidos adjacentes e a inclusão de comprimentos variáveis do nervo vago, gânglio cervical superior e jugular durante a dissecação15. Como resultado das dificuldades acima, a controvérsia envolve a expressão e distribuição de vários GPCRs em neurônios aferentes vagal. Um exemplo particularmente intrigante diz respeito ao receptor de grelina (Ghsr). Considerando que alguns estudos encontraram expressão generalizada deste receptor em neurônios aferentes vagal30,31,32, outros descobriram que Ghsr mRNA é quase indetectável no gânglio nodose11,14. O mapeamento detalhado do MRNA ghsr na massa gânnica vagal é, portanto, justificado.
A hibridização in situ (ISH) também tem sido utilizada para avaliar padrões de expressão genética na massa gânnica vagal7,11,12,33,34,35. Como as técnicas baseadas em RNA permanecem mais confiáveis e específicas do que as técnicas baseadas em anticorpos na maioria das circunstâncias36,37, estudos do ISH têm se mostrado valiosos para uma melhor compreensão da codificação neuroquímica de neurônios aferentes vagais. No entanto, as técnicas tradicionais do ISH em si não são sem ressalvas. O ISH radioativo é sensível, mas gera antecedentes e permanece pesado38. O ISH não radioativo é menos complicado, mas também menos sensível38. Em contraste, o método RNAscope ISH recentemente desenvolvido é altamente sensível e gera um mínimo de fundo39. O presente estudo aplicou o RNAscope fluorescente multiplex à detecção de GPCRs em neurônios aferentes do camundongo. Focamos no mapeamento da distribuição de Ghsr e comparamos sua distribuição com a do receptor de colecistocina (Cck1r), outro GPCR bem conhecido por ser expresso no gânglio34. Por fim, os dois fatores de transcrição, homeobox emparelhado 2b (Phox2b) e proteína de dedo de zinco de domínio pr 12 (Prdm12), foram usados como marcadores seletivos para neurônios aferentes de nodose e jugular,respectivamente 14. Sem visualizar Phox2b ou Prdm12, seria desafiador identificar as diferenças jugular vs. nodose com certeza. Potenciais armadilhas técnicas também são discutidas ao longo do artigo.

<table><tbody><tr><td>10x</td><td>PBS Fisher Scientific</td><td>BP399-4</td><td></td></tr><tr><td>20x SSC</td><td>Invitrogen</td><td>AM9763-80</td><td></td></tr><tr><td>&deg; C freezer</td><td>PHCBI</td><td>MDF-DU901VHA-PA</td><td></td></tr><tr><td>Adobe Photoshop 2021</td><td></td><td></td><td>Adobe software de foto e design</td></tr><tr><td>Forno de cozimento</td><td>Thermo Scientific</td><td>Modelo: 658</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio confocal</td><td>Zeiss</td><td>LSM880 Airyscan</td><td></td></tr><tr><td>Vidro de cobertura</td><td>Brain Research Laboratories</td><td>2460-1.5D</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Leica</td><td>CM 3050 S</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Fórceps</td><td>F.S.T.</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>Ecomount</td><td>Biocare Medical</td><td>EM 897L</td><td>meio de montagem</td></tr><tr><td>HybEZ forno</td><td></td><td></td><td>de hibridização forno</td></tr><tr><td>Caneta hidrofóbica</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ-Fiji</td><td>NIH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tesoura grande</td><td>Henry Schein</td><td>100-7561</td><td></td></tr><tr><td>Micro tubos de centrífuga</td><td>VWR</td><td>20170-333</td><td></td></tr><tr><td>Minibomba de fluxo variável</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-876-1</td><td></td></tr><tr><td>Opal 520</td><td>Akoya biosciences</td><td>FP1 1487001KT</td><td>Biomarcador fluorescente</td></tr><tr><td>Opal 570</td><td>Akoya biosciences</td><td>FP1 1488001KT</td><td>Biomarcador fluorescente</td></tr><tr><td>Opal 690</td><td>Akoya biosciences</td><td>FP1 1497001KT</td><td>Biomarcador fluorescente</td></tr><tr><td>ProLong Gold Meio de montagem antifade Mountant</td><td></td><td></td><td>para células marcadas com fluorescência</td></tr><tr><td>RNAscope Multiplex Kit de Reagentes Fluorescentes v2</td><td>ACD / Bio-Techne</td><td>323100</td><td>kit multiplex</td></tr><tr><td>Sonda RNAscope Mouse Cck1r-C3</td><td>ACD / Bio-Techne</td><td>313751-C3</td><td></td></tr><tr><td>Sonda RNAscope Mouse DapB</td><td>ACD / Bio-Techne</td><td>310043</td><td></td></tr><tr><td>Sonda RNAscope Mouse Ghsr</td><td>ACD / Bio-Techne</td><td></td><td>Sonda 426141</td></tr><tr><td>RNAscope Mouse Phox2b-C2</td><td>ACD / Bio-Techne</td><td>407861-C2</td><td></td></tr><tr><td>Sonda RNAscope Mouse Prdm12-C2</td><td>ACD / Bio-Techne</td><td>524371-C2</td><td></td></tr><tr><td>RnaseZap</td><td>Sigma</td><td>R2020</td><td>Rnase solução de descontaminação</td></tr><tr><td>Tesoura de dissecação pequena</td><td>Millipore Sigma</td><td>Z265977</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus slides</td><td>Fisherbrand</td><td>1255015</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Tek OCT medium</td><td>Sakura</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Manual do usuário</td><td>ACD</td><td>323100 USM</td><td></td></tr><tr><td>Vannas Spring Scissors</td><td>Roboz</td><td>RS 5620</td><td></td></tr><tr><td>ZEN Imaging Software</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

detecção de expressão receptora acoplada à proteína g em neurônios aferentes do mouse vagal usando multiplex in situ hibridização

Detection of G Protein-coupled Receptor Expression in Mouse Vagal Afferent Neurons using Multiplex In Situ Hybridization

Este estudo descreve um protocolo para o multiplex in situ hibridização (ISH) do gânglio jugular-nodose do mouse, com ênfase especial na detecção da expressão de receptores acoplados à proteína G (GPCRs). A gália jugular-nodose com formalina fixa foi processada com a tecnologia RNAscope para detectar simultaneamente a expressão de dois GPCRs representativos (receptores de colecistocina e grelina) em combinação com um gene marcador de nodose (homeobox emparelhado 2b, Phox2b) ou neurônios afferent (proteína de dedo de zinco 12, Prdm12). Os gânglios rotulados foram imagens usando microscopia confocal para determinar os padrões de distribuição e expressão das transcrições acima mencionadas. Resumidamente, os neurônios aferentes phox2b foram encontrados para expressar abundantemente o receptor de colecistocina (Cck1r), mas não o receptor de grelina (Ghsr). Um pequeno subconjunto de neurônios aferentes Prdm12 também foi encontrado para expressar Ghsr e/ou Cck1r. Potenciais ressalvas técnicas no projeto, processamento e interpretação do MULTIPLEX ISH são discutidas. A abordagem descrita neste artigo pode ajudar os cientistas a gerar mapas precisos dos perfis transcritivos de neurônios aferentes vagal.

Embora o RNAScope possa ser aplicado a animais de qualquer idade, sexo ou origem genética, é aconselhável trabalhar com adultos jovens (&lt;3 meses de idade). Isso ocorre porque artefatos fluorescentes (por exemplo, lipofuscina) são achados comuns em neurônios de animais mais velhos41. Os gânglios fixos formalina de camundongos mais velhos geralmente contêm fluorescência endógena surpreendentemente intensa que pode ser facilmente confundida com coloração genuína(Figura 1A</str...

Multiplex in situ hibridização (ISH) foi empregado para visualizar simultaneamente as transcrições de dois receptores acoplados à proteína G e um fator de transcrição em todo o complexo gônico vagal do camundongo adulto. Este protocolo poderia ser usado para gerar mapas precisos dos perfis transcritivos de neurônios aferentes vagal.

Detecção de expressão receptora acoplada à proteína G em neurônios aferentes do mouse vagal usando multiplex in situ hibridização

This study describes a protocol for the multiplex in situ hybridization (ISH) of the mouse jugular-nodose ganglia, with a particular emphasis on detecting ...

Este procedimento é altamente sensível e permite uma visualização de várias transcrições com mínimo de fundo. Este método pode gerar mapas precisos do perfil transcricional de tipos de células altamente heterogêneas. Demonstrando o procedimento, seremos eu e Johnson Bob-manuel, um técnico de pesquisa no laboratório.Comece coletando toda a massa gânrmônica vagal do rato de oito semanas de cada lado, com a ajuda de um escopo dissecando e instrumentos cirúrgicos. Após a decapitação do camundongo, use pequenos fórceps para remover o esternohyide e os músculos omohióides laterais à traqueia para expor o osso occipital. Limpe toda a região dos músculos e tecidos até que a artéria carótida, o nervo vago e hipoglossal e o foramen magnum sejam visíveis.Em seguida, corte todo o nervo hipoglossal com uma pequena tesoura de mola. Localize para o gânglio de nodose como uma massa translúcida perto do foramen magnum. Usando uma tesoura pequena, quebre cuidadosamente o osso occipital.Para expor ainda mais o gânglio jugular, localize melanócitos negros na superfície da jugular como um marco visual. Quando os gânglios são encontrados, corte os laços nervosos entre a massa gangliônica vagal e puxe suavemente a extremidade periférica do nervo vago enquanto simultaneamente corta o gânglio jugular em direção ao tronco cerebral com pequenas tesouras de mola para a extração de toda a massa gangliônica. Remova o tecido conjuntivo, a massa gangliônica e a gordura grudada no nervo vago.Mantendo aproximadamente meio centímetro do nervo vago para facilitar o manuseio e localização das amostras. Coloque a remoção para gânglios com a ajuda de fórceps finos em tubos de micro centrífugas de 1,5 milímetros. E incubar a 4 graus celsius em formalina por 24 horas.E depois com 30% de sacarose por 24 horas. Após a incubação, posicione o gânglio dentro de uma gota de quatro milímetros de diâmetro de meio de temperatura de corte ideal em um pedaço de papel alumínio. E frase a amostra em um leito de gelo seco.Corte as amostras congeladas com um criostat em seções de 14 micrômetros de espessura a menos 20 graus Celsius e colete as seções de corte nos slides do microscópio de vidro como três séries de 42 micrômetros de distância. Enxágüe as lâminas com seções teciduais em PBS. E asse por 30 minutos a 60 graus Celsius em um forno de cozimento.Em seguida, poste os slides em 4% de formalina por 15 minutos a quatro graus Celsius. Desidratar em série os slides em 50%70% e 100% etanol por cinco minutos cada. E aplique a solução de peróxido de hidrogênio nas amostras por 10 minutos antes de enxaguar em água dupla destilada.Para hibridização In situ, ou ISH, trate as amostras com o reagente de recuperação de destino por cinco minutos. Em seguida, enxágue sequencialmente as amostras em água dupla destilada e 100% etanol seguido de secagem de ar. Usando uma caneta hidrofóbica, crie uma barreira ao redor das amostras.Enquanto as amostras estão sendo tratadas com protease por 30 minutos a 40 graus Celsius e um forno de hibridização, pré-aquecimento as sondas a 40 graus Celsius e esfriá-las à temperatura ambiente antes do uso. Depois de sair do forno, incubar os slides com a combinação desejada de sondas-alvo por duas horas a 40 graus Celsius em um forno de hibridização. Incubar tecido de controle negativo com a reductase dihidrodipicolinate ou DapB, sonda C1 alvo por duas horas a 40 graus Celsius.Enxágüe os slides no tampão de lavagem e armazene em cinco vezes o citrato de sódio salino à temperatura ambiente durante a noite. No dia seguinte, enxágue os slides com tampão de lavagem antes da incubação com reagentes de amplificação. E tratar com reagentes específicos do canal como descrito no manuscrito.Lave os slides seguidos de tratamento com DapB por 30 segundos. Em seguida, aplique imediatamente o meio de montagem em cada slide e coloque um deslizamento de cobertura sobre a seção de tecido. Mantenha os tecidos horizontais em um suporte de slides a quatro graus Celsius até a imagem.Prepare um microscópio confocal para imagens definindo os parâmetros necessários. Adquira as imagens com uma média de quatro linhas e um tamanho de pixel de pelo menos 1024 até 1024 para melhorar a qualidade das imagens. Uma vez satisfeito com os parâmetros de aquisição, comece a adquirir as imagens usando as mesmas configurações.Atribua cores falsas a cada canal para facilitar a visualização. Usando as imagens digitais, realize a contagem de células identificando o contorno de perfis positivos do escopo RNA com um núcleo levemente manchado com DapB. Calcule a porcentagem de perfis positivos de escopo de RNA expressando cada transcrição.Os parâmetros de aquisição ideais foram escolhidos para cada laser com base na fluorescência inespecífica obtida no tecido de controle negativo. A fluorescência endógena no gânglio de nodose de um rato adulto jovem é mínima. E a incubação com uma sonda DapB, não resultou em sinais.Com o aumento do laser de potência e ganho com o laser de 488 nanômetros, o fundo indesejado e os pontos fluorescentes aleatórios aparecem. A técnica de escopo de RNA foi aplicada para detectar três genes em seções teciduais da massa gangliônica vagal. O perfil tecidual foi positivo para GHSR e CCK1R.O perfil incluía transcrições de Phox2b e CCK1R na parte rostral do gânglio nodose. Como resultado do multiplex ISH em neurônios diferentes, sinais de Phox2b especificamente acumulados em neurônios diferentes, localizados no gânglio de nodose. Os sinais CCK1R rotularam intensamente muitos neurônios no gânglio de nodose.Em baixa ampliação, as células expressando sinais baixos de CCK1R ou GSHR não puderam ser observadas facilmente. DapB ajudou a visualizar o tecido e identificar neurônios vagos com um núcleo grande e levemente manchado. Em alta ampliação, perfis positivos de Phox2b são evidentes.Os perfis dois e três são células Phox2b com sinais CCK1R altos e moderados. O perfil quatro expressou ghsr e CCK1R. Como resultado do multiplex ISH dos neurônios aferentes jugular, a transcrição PRDM12 pôde ser vista especificamente acumulada em neurônios diferentes localizados no gânglio jugular.Na alta ampliação, foram detectados sinais moderados para CCK1R nos perfis um e dois. O perfil três é um representante de células PRDM12 negativas para CCK1R ou GHSR. A consistência da dissecção é um fator importante.É igualmente importante verificar se os parâmetros de aquisição de imagens não geram sinais de fundo indesejados. Multiplex A hibridização in situ tornou-se o padrão-ouro em molecular estabelecido, especialmente no campo da neuroanatomia. Este método pode ser facilmente combinado com a imunohistoquímica.

detection-g-protein-coupled-receptor-expression-mouse-vagal-afferent

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Em camundongos, a capacidade de detectar os feromônios é principalmente mediado pelo órgão vomeronasal (OVN). Aqui, uma preparação fatia aguda do tecido de VNO para a realização de imagens de cálcio é descrito. Esta abordagem permite observações fisiológicos de subpopulações e / ou neurônios individuais em um tecido vivo e é conveniente para receptor-ligante de identificação.

Imagem Pheromone Sensing em um Preparação Slice rato Vomeronasal aguda do tecido

O órgão vomeronasal (VNO) detecta sinais químicos intraespecíficos que transmitem informações sociais e reprodutivas. Realizamos experimentos de imagem de Ca2+ utilizando camundongos transgênicos que expressam G-CaMP2 no tecido do VNO. Essa abordagem nos permite analisar os padrões complexos de resposta dos neurônios vomeronasais a um grande número de estímulos de feromônios.

Responses imagem Neuronal em Preparações Slice of Organ Vomeronasal Expressando um sensor de cálcio geneticamente codificado

Fonte: Baleriola, J., et. al., Detecção de mRNAs localizados axonalmente em seções cerebrais usando hibridização in situ de alta resolução.  J. Vis. Exp. (2015)Este vídeo demonstra a detecção de mRNA dentro de axônios colinérgicos em fatias fixas de hipocampo de camundongo usando hibridização in situ fluorescente e coloração de anticorpos. A microscopia de fluorescência revela a localização espacial de mRNAs marcados com sonda e colina acetiltransferase em neurônios colinérgicos.

Imunocoloração de neurônios em fatias de cérebro de camundongo após hibridização in situ fluorescente

Localizar a expressão gênica em tipos específicos de células pode ser um desafio devido à falta de anticorpos específicos. Aqui descrevemos um protocolo para detecção tripla simultânea de expressão gênica combinando hibridização in situ de RNA de fluorescência dupla com imunocoloração.

Combinando Duplo Fluorescência<em&gt; In Situ</em&gt; A hibridação com imunomarcação para a detecção da expressão de três genes em secções do cérebro do rato

Aqui, descrevemos uma abordagem fisiológica que permite a identificação e análise aprofundada de uma população definida de neurônios sensoriais em fatias agudas de tecido coronal do órgão vomeronasal de camundongo usando gravações de patch-clamp de células inteiras.

Análise em profundidade Physiological de populações de células definido no aguda Tissue Fatias do mouse Vomeronasal Organ

Este protocolo descreve a detecção de microscopia confocal de receptor acoplado a proteína G (GPCR) internalização em células de mamífero. Ele inclui a cultura de células de base, transfecção, e procedimento de microscopia confocal e fornece um método eficiente e facilmente interpretável para detectar a localização subcelular e internalização de GPCR expresso-fusão.

Detecção de activados por ligandos L acoplado a proteína do receptor de internalização por Microscopia Confocal

Este protocolo descreve os passos críticos e as precauções necessárias para executar a única célula multiplex transcrição reversa reação em cadeia da polimerase após remendo-braçadeira. Esta técnica é um método simples e eficaz para analisar o perfil de expressão de um conjunto predeterminado de genes de uma única célula caracterizada por gravações de remendo-braçadeira.

Única célula transcrição reversa Multiplex cadeia da polimerase após Patch-clamp

Este protocolo descreve um método para combinar hibridização in situ fluorescente (FISH) e imunohistoquímica de fluorescência (IHQ) em cortes frescos congelados e fixos de camundongos em cérebros, com o objetivo de obter sinais de FISH multimarcados e IHC de fluorescência. IHQ teve como alvo proteínas citoplasmáticas e ligadas à membrana.

Combinando Hibridização In Situ por Fluorescência Multiplex com Imunohistoquímica Fluorescente em Seções Cerebrais de Camundongos Frescos Congelados ou Fixos

A hibridização in situ de fluorescência iterativa assistida por expansão (EASI-FISH) é uma técnica robusta que combina microscopia de expansão com hibridização in situ de fluorescência (FISH) para detectar a expressão de vários genes em tecidos espessos. Este protocolo descreve os recentes avanços no método e sua adaptação para rotular o sistema nervoso central intacto da Drosophila.

Detecção multiplex da expressão gênica no cérebro intacto de Drosophila usando hibridização in situ de fluorescência iterativa assistida por expansão

Fluorescência dupla In situ Hibridação nas Seções cérebro fresco

Aprenda a detectar receptores acoplados à proteína G em neurônios vagais de camundongos usando hibridização in situ multiplex. Este método permite mapear perfis transcricionais com alta sensibilidade.

Detecção de expressão receptora acoplada à proteína G em neurônios aferentes do mouse vagal usando multiplex in situ hibridização (Vídeo) | JoVE Journal

Detecção de expressão receptora acoplada à proteína G em neurônios aferentes do mouse vagal usando multiplex in situ hibridização

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