Modelo de sangramento da transeção da veia da cauda em hemofilia totalmente anestesiada um camundongo

Modelos de sangramento de cauda podem ser ferramentas importantes para avaliar os efeitos farmacológicos dos compostos hemostáticos in vivo para garantir a reprodutibilidade entre os experimentos. Comparado com outros modelos sensíveis de sangramento, nosso modelo usa perda de sangue e tempo de sangramento como pontos finais em vez de sobrevivência. Além disso, o modelo é realizado sob anestesia, reduzindo assim a dor e a angústia para os animais.

Esta técnica é especialmente útil para o estudo pré-clínico de hemofilia e outros distúrbios de coagulação, uma vez que mede a capacidade do sangue de coagular e parar uma hemorragia após uma lesão. Temos usado este modelo extensivamente, testando compostos procoagulantes em nosso trabalho para desenvolver novas terapias de hemofilia usando camundongos de hemofilia A. No entanto, outras cepas de camundongos hemofílicos, ou camundongos nos quais a hemofilia é induzida com um anticorpo anti-fator VIII, também podem ser usadas.

Demonstrando o experimento estarão Sarah e Dennis, que são técnicos experientes no meu laboratório. Depois de anestesiar o mouse, coloque-o em uma placa de aquecimento e certifique-se de que o nariz está no cone do nariz. Aplique uma pomada ocular adequada para evitar o ressecamento enquanto estiver sob anestesia.

Marque a cauda com um diâmetro de 2,5 milímetros usando o bloco de marca da cauda, tomando o cuidado de não forçar a cauda para dentro da fenda e garantindo que ela se encaixe. Em seguida, coloque a cauda no tubo salino por pelo menos cinco minutos para garantir uma veia de cauda quente que seja ideal para a dosagem intravenosa. Se necessário, a dosagem intravenosa pode ser realizada após cinco minutos.

Em seguida, coloque uma tampa de plástico sobre o mouse para reduzir a perda de calor. Deixe as caudas submersas por cinco minutos após a dosagem da solução de teste e, em seguida, realize a transeção da veia traseira colocando a cauda no bloco de corte e girando-a 90 graus para expor a veia. Faça o corte no lado oposto de onde a solução de teste foi dosada.

Desenhe a lâmina de bisturi número 11 através da fenda do bloco de corte, segurando a cauda, para criar sangramento. Em seguida, devolva imediatamente a cauda para o soro fisiológico e reinicie o cronômetro. O sangramento deve ser visível imediatamente.

Submergir a cauda em soro fisiológico é importante para sangramento consistente, uma vez que rapidamente pararia no ar livre. Observe o sangramento e anote o início e pare o sangramento ao longo de 40 minutos no papel de notação do fluxo sanguíneo. Desqualificar e substituir o mouse se o sangramento primário não parar dentro de três minutos após o corte ser feito, o que pode indicar que o corte é muito profundo ou que o rato é deficiente em hemostasia primária.

Desafie o corte da cauda se não houver sangramento, 10, 20 e 30 minutos após a lesão. Usando um swab de gaze encharcado e salino quente, levante a cauda para fora do soro fisiológico e limpe-a duas vezes com a gaze molhada em uma direção distal sobre o corte da cauda. Imediatamente reencalça a cauda no tubo salino após cada desafio.

Quando o experimento estiver concluído, remova a cauda do soro fisiológico, colete amostras de sangue, se desejar, e eutanize os camundongos enquanto ainda estiver sob anestesia total. Centrifugar os tubos de coleta de sangue de 15 mililitros com soro fisiológico a 4.000 vezes G por cinco minutos à temperatura ambiente. Descarte o supernaspe de tubos.

Resuspende a pelota em dois mililitros de solução de eritrócito. Em seguida, dilui-o com até 12 mililitros adicionais de solução de lise até atingir uma cor de café leve. Observe o volume total e transfira dois mililitros da diluição para um tubo de hemoglobina.

Leve à geladeira até a análise da hemoglobina. Observou-se redução significativa da perda de sangue para grupos de tratamento do fator de coagulação recombinante VIII VIII utilizando-se o protocolo otimizado. Uma dose de 20 unidades internacionais por quilograma normalizou completamente o sangramento, e 10 UI por quilograma causaram um efeito significativo, reduzindo a perda de sangue quase ao limite superior da faixa do tipo selvagem.

Resultados semelhantes foram observados para o tempo de sangramento. Observou-se redução nos grupos de 5, 10 e 20 UI por quilograma, sendo completamente normalizada no grupo de 20 UI por quilograma. Em camundongos do tipo selvagem, a perda total de sangue variou de 200 a 840 nanomole de hemoglobina, e em camundongos de veículos, de 5.300 a 7.100 nanomole de hemoglobina.

O sangramento médio foi de 5.200 nanomoles em camundongos tratados com veículos, e 720 nanomole no grupo de 20 UI por quilograma. O tempo de sangramento dos camundongos do tipo selvagem variou de um a nove minutos e os níveis de dose de 10 e 20 UI por quilograma reduziram o tempo de sangramento para dentro dessa faixa. Observou-se forte correlação entre perda de sangue e tempo de sangramento nos dados combinados.

Todos os episódios de sangramento registrados foram plotados para fornecer uma visualização do comprimento e número de sangramentos experimentados para cada rato individual. Note que no grupo de veículos, após o segundo desafio, a maioria dos animais continua sangrando até o final do experimento. A medição da concentração do fator plasma VIII confirmou que o efeito observado na redução da perda de sangue e no tempo de sangramento foi recombinante fator VIII dependente da concentração.

A contagem de plaquetas não foi visivelmente afetada e os níveis de hematócrito estavam dentro da faixa normal em animais que receberam doses moderadas e mais altas do fator REcombinante VIII, mas significativamente menor em animais que sangraram extensivamente, como no veículo e uma UI por quilograma. Em animais com sangramento intenso, pode ocorrer um pequeno impacto na contagem sanguínea, particularmente hemoglobina total ou hematócrito. Para avaliar o efeito do gênero nesse modelo otimizado, tanto os resultados de perda de sangue quanto de tempo de sangramento foram submetidos à análise bidirecional da ANOVA, com sexo e dose como fatores.

Esses resultados indicaram que a resposta ao tratamento não difere entre os sexos. A correta marcação da cauda e a criação do corte são etapas essenciais para garantir a confiabilidade e a reprodutibilidade na técnica, como é o desafio se não houver sangramento. Além disso, a boa indução e manutenção da temperatura corporal animal é particularmente relevante.

Também usamos este modelo para investigar a parada de sangramentos estabelecidos em um ambiente mais sob demanda, tratando com o fator VIIA 10 minutos após induzir sangramento.