Abordagem Genética Reversa para Identificar Reguladores de Pigmentação usando Zebrafish
1 de março de 2022
Reguladores das funções dos melanócitos governam diferenças visíveis no resultado da pigmentação. Decifrar a função molecular do gene de pigmentação candidato representa um desafio. Neste trabalho, demonstramos o uso de um sistema modelo de peixe-zebra para identificar candidatos e classificá-los em reguladores do conteúdo de melanina e número de melanócitos.
Este protocolo é uma amálgama de várias técnicas que permitiriam aos pesquisadores delinear o papel do gene candidato na biologia dos melanócitos. É uma abordagem holística para alcançar uma inferência lógica. Ao combinar vários métodos, fatores de confusão podem ser evitados e podem ajudar os pesquisadores a obter um resultado substancial.
Para iniciar a análise, imobilizar os 48 embriões de HPF com 0,016% de tricaína. Monte os embriões usando alguns mililitros de 1,5 a 2% de metilcelulose em uma placa de Petri. Pegue os embriões com uma pipeta de Pasteur e coloque-os em metilcelulose para restringir o movimento durante a imagem.
Para obter imagens laterais ou dorsais ideais, ajuste sua posição com uma ampliação de mais de 5X. Coloque a placa de Petri sob o microscópio. Usando um manipulador, ajuste o peixe para que todas as cinco listras embrionárias de melanócitos sejam visíveis simultaneamente.
Usando o software de aquisição, capture as imagens. Se o peixe despertar, coloque-o em água de tricaína até estabilizar. Usando a ferramenta aberta no software ImageJ, abra a imagem a ser quantificada.
Selecione a ferramenta de forma à mão livre para delinear a área a ser analisada. Selecione a opção definir medidas, clique no valor cinza médio e, em seguida, na área. Para calcular o valor médio de cinza para a área selecionada, clique em M ou vá para analisar e selecionar a medida.
Com base no estágio de interesse, transferir os embriões para uma placa de Petri contendo 0,6 miligramas por mililitro de Pronase. Usando uma pipeta de Pasteur, transfira os embriões descorionados para uma placa de Petri contendo água pura do embrião após cinco a 10 minutos. Com uma pipeta de vidro Pasteur, colete e transfira cerca de 100 embriões para um tubo de microcentrífuga de dois mililitros.
Descarte o meio e adicione 200 microlitros de solução gelada de Deyolking Ringers. Coloque o tubo sobre gelo e misture o conteúdo cerca de 20 vezes com uma pipeta para dissolver o jugo. Centrifugar os tubos a 100 G por um minuto a quatro graus Celsius duas vezes e descartar o sobrenadante.
Transfira os embriões desgemados usando uma pipeta de um mililitro em uma placa de Petri contendo 10 mililitros de solução de tripsina. Misture a solução uma ou duas vezes usando uma pipeta de um mililitro para diminuir a agregação. Passe a suspensão tripsinizada através de um filtro de 70 micrômetros colocado em um tubo cônico de 50 mililitros para coletar uma suspensão de célula única.
Lave as placas de Petri com a suspensão tripsinizada para remover as células aderidas da superfície. Para contar as células fluorescentemente marcadas usando um citômetro de fluxo, depois de criar uma nova pasta de experimento, desenhe um gráfico de dispersão para frente versus lateral. Faça um histograma para a intensidade do isotiocianato de fluoresceína.
Carregue as células do tipo selvagem primeiro para definir as portas de dispersão frontal e lateral e o limite FITC. Em seguida, carregar as células isoladas de embriões transgênicos da linhagem FTYRP GFP para contar os melanócitos. Montar os embriões em 1,5 a 2% de metilcelulose em uma placa de Petri.
Coloque-o sob o microscópio e ajuste-o na orientação desejada usando uma ponta de pipeta. Utilizando o software de aquisição, adquira as imagens. Para embriões com menos de 24 HPF, usando ampliação de 10X, capturar a imagem inteira, enquanto para embriões com mais de 24 HPF, adquirir vários campos de varredura e posteriormente montá-los.
Após a realização do ensaio, a imagem de Brightfield após 48 horas revelou a presença de todas as cinco listras de melanóforos pigmentados. No estágio de 48 CGA, o número de melanóforos laterais foi calculado e verificou-se que os morfos da variante histona h2afv demonstraram um número reduzido de melanóforos em relação ao controle. O valor médio de cinza foi medido para os morfantes CA14 e h2afv, o que revelou que os valores foram maiores para as variantes do que para os morfantes controle.
Empregando um método espectrofotométrico de absorção baseado em hidróxido de sódio, o conteúdo de melanina foi quantificado onde os morfantes CA14 apresentaram menor conteúdo do que os morfantes controle. Imagens de fluorescência foram realizadas para avaliar a alteração morfolínica para diferentes estágios de desenvolvimento do melanóforo do peixe-zebra. O número de melanóforos nos morfos CA14 e h2afv foi analisado usando FACS.
Observou-se que o número de melanóforos no CA14 permaneceu inalterado, enquanto eles foram significativamente reduzidos no h2afv em comparação com o morfo controle. A intensidade média de fluorescência por área também foi calculada, demonstrando que os morfontes h2afv apresentam uma diminuição considerável no valor em relação aos morfantes controle. Ao ajustar os peixes antes de fazer a imagem, certifique-se de que você possa visualizar todas as cinco listras de melanóforo.
Você precisa inclinar um pouco o peixe para distinguir entre as duas listras laterais. Depois de estabelecer o papel de um gene candidato no desenvolvimento de melanócitos, podemos eliminar o gene de forma tecido-específica usando a tecnologia CRISPR. Essa será uma abordagem mais direcionada.
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Visão Geral
Este estudo investiga o papel de genes candidatos à pigmentação na biologia dos melanócitos utilizando um sistema modelo de peixe-zebra. Ao empregar diversas técnicas de imagem e ensaios, a pesquisa identifica reguladores-chave do conteúdo de melanina e do número de melanócitos.
Componentes Principais do Estudo
Área de Pesquisa
- Desenvolvimento de melanócitos
- Genética da pigmentação
- Peixe-zebra como organismo modelo
Contexto
- Compreender a função molecular dos genes de pigmentação é essencial para decifrar as variações na cor da pele.
- Fatores de confusão na pesquisa podem dificultar a avaliação precisa das funções gênicas.
- Os embriões de peixe-zebra fornecem um modelo eficaz para o estudo dos processos iniciais de desenvolvimento na pigmentação.
Métodos Utilizados
- Imobilização de embriões e técnicas de imagem
- Peixe-zebra como modelo biológico
- Citometria de fluxo para contagem de melanócitos e ensaios espectrofotométricos para conteúdo de melanina
Resultados Principais
- Foram observados números reduzidos de melanóforos em morfantes de h2afv em comparação com os controles.
- Morfantes de CA14 exibiram menor conteúdo de melanina do que os morfantes controles.
- A imagem de fluorescência confirmou diferenças no desenvolvimento dos melanóforos.
Conclusões
- Os achados ilustram a importância de genes específicos de pigmentação no desenvolvimento dos melanócitos.
- Esta pesquisa tem implicações mais amplas para a compreensão das influências genéticas sobre a pigmentação.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este protocolo permite a investigação sistemática de reguladores genéticos no desenvolvimento de melanócitos, apoiando a validação de alvos em distúrbios relacionados à pigmentação. Ao combinar imagens fenotípicas, citometria de fluxo e ensaios bioquímicos, fornece leituras quantitativas para reduzir riscos em hipóteses mecanicistas no início da descoberta. A abordagem aumenta a confiança preditiva na distinção entre genes que afetam o número de melanócitos versus o conteúdo de melanina por célula, orientando a priorização de portfólios para moduladores tópicos ou sistêmicos.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a análise funcional de genes candidatos em especificadores e diferenciadores de melanócitos com base nos efeitos sobre o número de células versus síntese de pigmento.
- Valor Operacional: Utiliza o bloqueio por morpholino em larvas de peixe-zebra para avaliar rapidamente as consequências fenotípicas nas vias de pigmentação.
- Valor Científico: Apoia a formulação de hipóteses ao associar a perturbação gênica a alterações mensuráveis na contagem de melanóforos e no conteúdo de melanina.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Gera saídas padronizadas e quantitativas, incluindo valor médio de cinza a partir de imagens de campo claro e concentração de melanina por espectrofotometria.
- Valor Operacional: Integra a contagem de melanócitos baseada em FACS com imagens para permitir triagem fenotípica de alto conteúdo de moduladores genéticos.
- Valor Científico: Facilita a reprodutibilidade do ensaio por meio de estágios definidos (48 HDP), imobilização e parâmetros de aquisição de imagens para comparação longitudinal.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Utiliza repórteres transgênicos GFP (mitfa, tyrp1) para rastrear as fases de especificação e diferenciação de melanócitos relevantes para a biologia da pigmentação humana.
- Valor Operacional: Permite a segregação de resultados em classes mecanicistas (especificadores versus diferenciadores) para orientar a validação subsequente em modelos mamíferos.
- Valor Científico: Oferece um sistema relevante para doenças, útil na avaliação de genes implicados nas vias do piebaldismo, albinismo ou vitiligo.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se insere na fase inicial de descoberta até a identificação de compostos líderes, na qual as alterações genéticas são validadas quanto aos seus efeitos na biologia dos melanócitos antes da triagem de compostos ou de acompanhamento mecanicista.
- Biologia de Descoberta: Apoia a validação de alvos ao isolar efeitos específicos de genes no desenvolvimento de melanócitos por meio de fenocópia com morpholino e imagem quantitativa.
- Triagem: Permite modelos de peixe-zebra prontos para ensaios com repórteres fluorescentes para avaliação escalável de moduladores genéticos ou de pequenas moléculas.
- Análises: Fornece leituras multiparamétricas — número de melanóforos (FACS), conteúdo de melanina (espectrofotometria) e distribuição espacial (imagem) — para apoiar a triagem de hits baseada em dados.
- Pesquisa Translacional: Utiliza marcadores conservados de melanócitos (mitfa, tyrp1) para conectar descobertas em peixe-zebra aos mecanismos de pigmentação humana.
- Reutilização Corporativa: Estabelece uma plataforma reutilizável para triagem de genética do pigmento aplicável entre famílias de alvos e áreas terapêuticas.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Reduz a ambiguidade mecanicista ao distinguir genes que alteram a especificação de melanócitos daqueles que afetam a produção de pigmento por célula.
- Valor Operacional: Padroniza os protocolos de manipulação, imageamento e dissociação de embriões para garantir a reprodutibilidade entre laboratórios e campanhas de triagem.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de avanço ou interrupção ao fornecer confiança fenotípica precoce no mecanismo-alvo antes de investir em química medicinal.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de alvos com base na validação genética de fenótipos específicos de melanócitos.
Considerações de Implementação
- É necessária experiência em embriologia de peixe-zebra, microinjeção e design de morpholinos para avaliação fenotípica precisa.
- O instrumental inclui microscópios de fluorescência, citômetros de fluxo e espectrofotômetros para leitura multiparamétrica.
- A padronização entre equipes exige estagiamento sincronizado (HPF), protocolos de imobilização e configurações de imagem para minimizar a variabilidade.
- A adaptação a outros modelos pode exigir validação de repórteres conduzidos por promotores conservados e pontos finais fenotípicos.
- As limitações incluem efeitos fora do alvo dos morpholinos e silenciamento transitório, exigindo acompanhamento com CRISPR ou linhagens mutantes para confirmação do alvo.
