Abordagem Genética Reversa para Identificar Reguladores de Pigmentação usando Zebrafish
March 1st, 2022
Reguladores das funções dos melanócitos governam diferenças visíveis no resultado da pigmentação. Decifrar a função molecular do gene de pigmentação candidato representa um desafio. Neste trabalho, demonstramos o uso de um sistema modelo de peixe-zebra para identificar candidatos e classificá-los em reguladores do conteúdo de melanina e número de melanócitos.
Este protocolo é uma amálgama de várias técnicas que permitiriam aos pesquisadores delinear o papel do gene candidato na biologia dos melanócitos. É uma abordagem holística para alcançar uma inferência lógica. Ao combinar vários métodos, fatores de confusão podem ser evitados e podem ajudar os pesquisadores a obter um resultado substancial.
Para iniciar a análise, imobilizar os 48 embriões de HPF com 0,016% de tricaína. Monte os embriões usando alguns mililitros de 1,5 a 2% de metilcelulose em uma placa de Petri. Pegue os embriões com uma pipeta de Pasteur e coloque-os em metilcelulose para restringir o movimento durante a imagem.
Para obter imagens laterais ou dorsais ideais, ajuste sua posição com uma ampliação de mais de 5X. Coloque a placa de Petri sob o microscópio. Usando um manipulador, ajuste o peixe para que todas as cinco listras embrionárias de melanócitos sejam visíveis simultaneamente.
Usando o software de aquisição, capture as imagens. Se o peixe despertar, coloque-o em água de tricaína até estabilizar. Usando a ferramenta aberta no software ImageJ, abra a imagem a ser quantificada.
Selecione a ferramenta de forma à mão livre para delinear a área a ser analisada. Selecione a opção definir medidas, clique no valor cinza médio e, em seguida, na área. Para calcular o valor médio de cinza para a área selecionada, clique em M ou vá para analisar e selecionar a medida.
Com base no estágio de interesse, transferir os embriões para uma placa de Petri contendo 0,6 miligramas por mililitro de Pronase. Usando uma pipeta de Pasteur, transfira os embriões descorionados para uma placa de Petri contendo água pura do embrião após cinco a 10 minutos. Com uma pipeta de vidro Pasteur, colete e transfira cerca de 100 embriões para um tubo de microcentrífuga de dois mililitros.
Descarte o meio e adicione 200 microlitros de solução gelada de Deyolking Ringers. Coloque o tubo sobre gelo e misture o conteúdo cerca de 20 vezes com uma pipeta para dissolver o jugo. Centrifugar os tubos a 100 G por um minuto a quatro graus Celsius duas vezes e descartar o sobrenadante.
Transfira os embriões desgemados usando uma pipeta de um mililitro em uma placa de Petri contendo 10 mililitros de solução de tripsina. Misture a solução uma ou duas vezes usando uma pipeta de um mililitro para diminuir a agregação. Passe a suspensão tripsinizada através de um filtro de 70 micrômetros colocado em um tubo cônico de 50 mililitros para coletar uma suspensão de célula única.
Lave as placas de Petri com a suspensão tripsinizada para remover as células aderidas da superfície. Para contar as células fluorescentemente marcadas usando um citômetro de fluxo, depois de criar uma nova pasta de experimento, desenhe um gráfico de dispersão para frente versus lateral. Faça um histograma para a intensidade do isotiocianato de fluoresceína.
Carregue as células do tipo selvagem primeiro para definir as portas de dispersão frontal e lateral e o limite FITC. Em seguida, carregar as células isoladas de embriões transgênicos da linhagem FTYRP GFP para contar os melanócitos. Montar os embriões em 1,5 a 2% de metilcelulose em uma placa de Petri.
Coloque-o sob o microscópio e ajuste-o na orientação desejada usando uma ponta de pipeta. Utilizando o software de aquisição, adquira as imagens. Para embriões com menos de 24 HPF, usando ampliação de 10X, capturar a imagem inteira, enquanto para embriões com mais de 24 HPF, adquirir vários campos de varredura e posteriormente montá-los.
Após a realização do ensaio, a imagem de Brightfield após 48 horas revelou a presença de todas as cinco listras de melanóforos pigmentados. No estágio de 48 CGA, o número de melanóforos laterais foi calculado e verificou-se que os morfos da variante histona h2afv demonstraram um número reduzido de melanóforos em relação ao controle. O valor médio de cinza foi medido para os morfantes CA14 e h2afv, o que revelou que os valores foram maiores para as variantes do que para os morfantes controle.
Empregando um método espectrofotométrico de absorção baseado em hidróxido de sódio, o conteúdo de melanina foi quantificado onde os morfantes CA14 apresentaram menor conteúdo do que os morfantes controle. Imagens de fluorescência foram realizadas para avaliar a alteração morfolínica para diferentes estágios de desenvolvimento do melanóforo do peixe-zebra. O número de melanóforos nos morfos CA14 e h2afv foi analisado usando FACS.
Observou-se que o número de melanóforos no CA14 permaneceu inalterado, enquanto eles foram significativamente reduzidos no h2afv em comparação com o morfo controle. A intensidade média de fluorescência por área também foi calculada, demonstrando que os morfontes h2afv apresentam uma diminuição considerável no valor em relação aos morfantes controle. Ao ajustar os peixes antes de fazer a imagem, certifique-se de que você possa visualizar todas as cinco listras de melanóforo.
Você precisa inclinar um pouco o peixe para distinguir entre as duas listras laterais. Depois de estabelecer o papel de um gene candidato no desenvolvimento de melanócitos, podemos eliminar o gene de forma tecido-específica usando a tecnologia CRISPR. Essa será uma abordagem mais direcionada.
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Visão Geral
Este estudo investiga o papel dos genes candidatos à pigmentação na biologia dos melanócitos usando um sistema modelo de peixe-zebra. Ao empregar várias técnicas de imagem e ensaios, a pesquisa identifica reguladores-chave do conteúdo de melanina e número de melanócitos.
Componentes Principais do Estudo
Área de Pesquisa
- Desenvolvimento de melanócitos
- Genética da pigmentação
- Peixe-zebra como um organismo modelo
Contexto
- Entender a função molecular dos genes de pigmentação é essencial para decifrar as variações de cor da pele.
- Fatores de confusão na pesquisa podem dificultar a avaliação precisa das funções genéticas.
- Embriões de peixe-zebra fornecem um modelo eficaz para estudar processos de desenvolvimento precoce na pigmentação.
Métodos Utilizados
- Imobilização de embriões e técnicas de imagem
- Peixe-zebra como modelo biológico
- Citometria de fluxo para contagem de melanócitos e ensaios espectrofotométricos para conteúdo de melanina
Principais Resultados
- Números reduzidos de melanoforos foram observados em morphants h2afv em comparação com os controles.
- Morphants CA14 exibiram menos conteúdo de melanina do que os morphants controle.
- A imagem de fluorescência confirmou diferenças de desenvolvimento nos melanoforos.
Conclusões
- Os resultados ilustram a importância de genes específicos de pigmentação no desenvolvimento de melanócitos.
- Esta pesquisa tem implicações mais amplas para a compreensão das influências genéticas na pigmentação.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
This protocol enables systematic interrogation of genetic regulators in melanocyte development, supporting target validation in pigment-related disorders. By combining phenotypic imaging, flow cytometry, and biochemical assays, it provides quantitative readouts for de-risking mechanistic hypotheses early in discovery. The approach enhances predictive confidence in distinguishing genes affecting melanocyte number versus melanin content per cell, informing portfolio prioritization for topical or systemic modulators.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables functional dissection of candidate genes into melanocyte specifiers and differentiators based on effects on cell number versus pigment synthesis.
- Operational Value: Uses morpholino knockdown in zebrafish larvae to rapidly assess phenotypic consequences on pigmentation pathways.
- Scientific Value: Supports hypothesis testing by linking gene perturbation to measurable changes in melanophore count and melanin content.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized, quantitative outputs including mean gray value from brightfield imaging and melanin concentration via spectrophotometry.
- Operational Value: Integrates FACS-based melanocyte counting with imaging to enable high-content phenotypic screening of genetic modulators.
- Scientific Value: Facilitates assay reproducibility through defined staging (48 HPF), immobilization, and imaging parameters for longitudinal comparison.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Uses transgenic GFP reporters (mitfa, tyrp1) to track melanocyte specification and differentiation stages relevant to human pigmentation biology.
- Operational Value: Enables segregation of hits into mechanistic classes (specifiers vs. differentiators) to guide downstream validation in mammalian models.
- Scientific Value: Provides a disease-relevant system for evaluating genes implicated in piebaldism, albinism, or vitiligo pathways.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery to lead identification, where genetic hits are validated for effects on melanocyte biology before compound screening or mechanistic follow-up.
- Discovery Biology: Supports target validation by isolating gene-specific effects on melanocyte development through morpholino phenocopy and quantitative imaging.
- Screening: Enables assay-ready zebrafish models with fluorescent reporters for scalable evaluation of genetic or small-molecule modulators.
- Analytics: Delivers multiparametric readouts—melanophore number (FACS), melanin content (spectrophotometry), and spatial distribution (imaging)—to support data-driven hit triage.
- Translational Research: Uses conserved melanocyte markers (mitfa, tyrp1) to bridge zebrafish findings to human pigmentation mechanisms.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for pigment genetics screening applicable across target families and therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by distinguishing genes that alter melanocyte specification from those affecting pigment production per cell.
- Operational Value: Standardizes embryo handling, imaging, and dissociation protocols to ensure reproducibility across laboratories and screening campaigns.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early phenotypic confidence in target mechanism before investing in medicinal chemistry.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on genetic validation of melanocyte-specific phenotypes.
Implementation Considerations
- Expertise in zebrafish embryology, microinjection, and morpholino design is required for accurate phenotypic assessment.
- Instrumentation includes fluorescence microscopes, flow cytometers, and spectrophotometers for multiparametric readout.
- Standardization across teams requires synchronized staging (HPF), immobilization protocols, and imaging settings to minimize variability.
- Adaptation to other models may require validation of conserved promoter-driven reporters and phenotypic endpoints.
- Limitations include morpholino off-target effects and transient knockdown, necessitating follow-up with CRISPR or mutant lines for target confirmation.
