Geração de Unidades Motoras Humanas com Junções Neuromusculares Funcionais em Dispositivos Microfluidos

Este método relativamente simples pode ajudar a pesquisa com foco em neurônios motores e junções neuromusculares em saúde e doenças. Este protocolo usa tecnologia padrão de células-tronco e dispositivos microfluidos disponíveis comercialmente, o que aumenta a reprodutibilidade. A desconexão de neurônios motores e células musculares é um fenômeno precoce em várias doenças neuromusculares.

Um modelo simples humanizado poderia ajudar a desenvolver estratégias para combater esse fenômeno. Utilizamos esse modelo para investigar a desordem do neurônio motor, a esclerose lateral amiotrófica, porém, esse modelo também pode ser usado para outras desordens em que a unidade motora é essencial. Comece transferindo o dispositivo usando as fórceps do contêiner de transporte para a placa de Petri contendo 10 mililitros de 70% a 100% de etanol para esterilização por 10 segundos.

Transfira o dispositivo com fórceps para um pedaço de papel para secar no Fluxo Laminar por cerca de 30 minutos. Uma vez que um dispositivo é seco, use fórceps para mover cada dispositivo para uma placa de Petri individual de 10 centímetros. Para revestir o dispositivo com Poli-L-ornithine ou PLO, adicione 100 microliters de solução de OLP para a parte superior bem e observe o fluido passando de cima bem através do canal até o poço inferior.

Em seguida, adicione 100 microliters de solução de OLP ao fundo bem, e repita do outro lado das micro ranhuras. Finalize adicionando 100 microliters de solução PLO de um lado para criar um gradiente de volume entre os dois lados espelhados do dispositivo para revestir as micro ranhuras. Incubar por três horas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.

Depois de três horas, lave o dispositivo três vezes por cinco minutos com DPBS. Cubra o dispositivo com 20 microgramas por laminina mililitro e meio neurobásal seguindo o procedimento semelhante ao revestimento da OLP. Incubar o dispositivo durante a noite a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.

No dia seguinte use uma pipeta de 200 microliter e posicione a ponta no poço oposto à abertura do canal para remover o revestimento de laminina dos poços. Depois de adicionar DPBS a todos os poços, deixe os dispositivos com DPBS no Fluxo Laminar à temperatura ambiente para semeadura celular. Corte as folhas de SCM para o tamanho do dispositivo, deixando alguns milímetros de cada lado.

Depois de esterilizar os dispositivos e as folhas de SCM em uma placa de Petri contendo 10 mililitros de 70% a 100% de etanol por 10 segundos, transfira os dispositivos com fórceps para uma placa de seis poços e as folhas de SCM para uma placa de Petri de 10 centímetros para secagem de ar no Lam Flowinar. Posicione o dispositivo na borda para permitir que todos os lados sequem por cerca de 30 minutos. Cubra os dispositivos adicionando um mililitro de solução PLO por poço a cada dispositivo na placa de seis poços.

Certifique-se de que o dispositivo está flutuando em cima da solução PLO com o lado do canal e do micro sulco voltado para baixo no líquido. Cubra as folhas de SCM adicionando 10 mililitros de solução de OLP à placa de Petri de 10 centímetros e use os fórceps para empurrar as folhas de SCM para o líquido. Incubar dispositivos e folhas de SCM por três horas, como demonstrado anteriormente.

Após três horas, lave os dispositivos e as folhas de SCM duas vezes por cinco minutos com DPBS seguido de outra lavagem por cinco minutos com água estéril. Em seguida, transfira cada folha de SCM para uma placa de Petri individual de 10 centímetros para secar o ar. Enquanto estiver trabalhando sob um microscópio no Fluxo Laminar, use fórceps para montar o dispositivo de silicone com o canal e o lado micro sulco para baixo em um ângulo de 90 graus na folha SCM, garantindo que todos os lados estejam alinhados.

Pressione levemente para baixo no dispositivo para ter certeza de selar não apenas bordas externas, mas também em torno de poços, canais e micro ranhuras. Para revestir o dispositivo com laminina, dentro do Fluxo Laminar e sob o microscópio, adicione 100 microlitros de 20 microgramas por solução mililitro de laminina no poço superior usando uma pipeta de 200 microliteres. Observe o fluido passando do topo bem através do canal até o poço inferior sem qualquer vazamento ao redor do poço e do canal.

Posteriormente, adicione 100 microliters de solução de laminina ao fundo bem, repita do outro lado das micro ranhuras e finalize com 100 microliters adicionais de laminina de um lado para criar um gradiente de volume entre os dois lados espelhados do dispositivo para cobrir as micro ranhuras, em seguida, incubar o dispositivo durante a noite. No dia seguinte, remova o revestimento dos poços com a pipeta de 200 microliters posicionando a ponta no bem oposto à abertura do canal, depois de adicionar DPBS a todos os poços, deixe os dispositivos com DPBS no Fluxo Laminar à temperatura ambiente para semeadura celular. Para emplacar as células progenitoras neurais ou NPCs no dispositivo microfluido, remova DPBS de dois poços de um lado das micro ranhuras no dispositivo usando uma pipeta de 200 microliter.

Para semear um total de 250.000 NPCs e 60 a 100 microliters do dia 10 neurônio motor médio por dispositivo, no poço superior direito, metade da suspensão celular perto da abertura do canal em um ângulo de 45 graus. Pare por alguns segundos para permitir que a suspensão da célula flua através do canal antes de adicionar a metade restante da suspensão da célula no poço inferior. Use uma caneta para marcar o lado semeado como NPC ou equivalente, para fácil orientação do dispositivo sem microscópio, e incubar por cinco minutos para fixação celular.

Em seguida, rechague lentamente os dois poços semeados NPC com um médio de neurônio motor adicional de 10 dias para um volume total de 200 microliters por poço. Usando uma pipeta de 200 microliteres, remova DPBS dos dois poços do outro lado das micro ranhuras opostas aos NPCs recém-semeados. Adicione 200 microliters do dia 10 de mídia de neurônio motor por poço aos poços não semeados.

Em seguida, adicione seis mililitros de DPBS por prato de 10 centímetros ao redor do dispositivo para evitar a evaporação do meio durante a incubação. Para alterar o meio, remova lentamente a mídia em ambos os poços com NPCs, posicionando a ponta de pipeta de 200 microliters na borda inferior da parede do poço em frente à abertura do canal. Para evitar que um forte fluxo médio danifique as células do canal, adicione lentamente 50 a 100 microliters de médio neurônio motor fresco para cada poço, mudando continuamente entre o topo e o fundo bem.

Repita o processo até que cada poço contenha 200 microliters de meio. No dia 17 da diferenciação do neurônio motor, remova o meio do neurônio motor no lado não semeado das micro ranhuras do dispositivo com uma pipeta de 200 microliter e lave os poços com DPBS. Semente um total de 200.000 mesoangioblasts ou MABs primários humanos, em 60 a 100 microliters de meio de crescimento por dispositivo, semeando metade da suspensão celular no poço superior.

Pare por alguns segundos para permitir que a suspensão da célula flua pelo canal antes de semear a metade restante da suspensão da célula na parte inferior, como demonstrado anteriormente para emplacamento NPCs. Incubar o dispositivo por cinco minutos para fixação celular. Em seguida, reestree os dois poços recém-semeados de MAB com um meio de crescimento adicional e incubar novamente como demonstrado.

Para iniciar a tática de quimioterapia e gradiente volumétrico no 21º dia da diferenciação do neurônio motor, adicione 200 microliters por poço de meio neurobásal de neurônio motor contendo fatores de crescimento ao compartimento do Myotube, em seguida, adicione 100 microliters por poço de meio basal do neurônio motor sem fatores de crescimento ao compartimento do neurônio motor. É importante avaliar o potencial de diferenciação das linhas celulares antes de co-culminá-las em dispositivos microfluidos. O índice de fusão de MABs foi determinado, e estima-se que cerca de 8% foram suficientes para a cocultura.

As culturas de neurônios motores gerados foram 85 a 95% positivas para marcadores de neurônios motores. Para caracterizar e quantificar a quantidade de junções neuromusculares ou NMJs, o número de co-localizações entre o neurônio motor e marcadores pré-sinápticos de cadeia pesada de neurofilamento e sinaptofisina e marcador de astêndio sulinápico marcador alfa bungarotoxin, foi contado através de cada pilha de doenças e foi normalizado em uma série de miotubes rotulados myotubes de cadeia pesada de miotubes rotulados na pilha Z. Os NMJs apareceram como NMJs de ponto de contato único onde neurite tocou em um aglomerado de um receptor de colina sutil em um ponto de interação.

Ou como múltiplos NMJs de ponto de contato onde um neurite se espalhou e se envolveu com um aglomerado de receptores de colina sutil sobre uma superfície maior. A quantificação da porcentagem de neurônio motor inovou myotubes indicaram que nem todos os Myotubes continham NMJs. Após a ativação do neurônio motor com cloreto de potássio, o fluxo de cálcio foi observado nos Myotubes rotulados fluo-4, que confirmaram uma conexão funcional através da neurita do neurônio motor no Myotube, a adição do bloqueador de NMJ d-tubocurarine, ou DTC ao compartimento do Myotube resultou em uma inibição do fluxo de cálcio.

Para ter o maior sucesso com este modelo é incrivelmente importante realizar uma verificação de qualidade da linha celular e evitar a formação de bolhas de ar nos canais do dispositivo. Combinando a junção neuromuscular em um prato com outros tipos de células diretas IPC imita ainda melhor a situação in vitro, isso também permite estudar o papel desses tipos celulares.