Imunofluorescência total do ovário, compensação e microscopia multifotínica para análise quantitativa 3D da reserva ovariana em desenvolvimento em mouse

Este método pode ajudar a responder a uma das principais questões no campo reprodutivo, ou seja, como e quando processos geneticamente regulados influenciam o tamanho da reserva ovariana que conhecemos impactar as fêmeas, longevidade reprodutiva Este protocolo pode ser adotado para estudos em larga escala usando as mesmas técnicas para ovários intactos de diferentes estágios de desenvolvimento. Gera dados produziveis fornecendo uma quantificação eficiente das células germinativas. Este método aplicado a animais geneticamente diversos da mesma espécie pode fornecer uma visão dos fatores genéticos diretamente do desenvolvimento de células germinativas e ovarianas e outros órgãos de desenvolvimento.

Demonstrando o procedimento estará Nathaniel Boechat, um estagiário de pesquisa do meu laboratório Para começar com o passo de profusão e garantir o rato feminino pubertal anestesiado em suas costas, fixando suavemente todas as pernas através das patas em uma posição relaxada em uma prancha. Para abrir a cavidade torácica do camundongo, corte cuidadosamente as costelas em ambos os lados do esterno logo abaixo da escápula, evitando perfurar os pulmões pegue a pele ou as abas das costelas com as fórceps e fixe os retalhos para expor os órgãos internos usarem tesouras de dissecção para cortar o átrio direito do coração e liberar sangue do sistema. Em seguida, segurando o coração com fórceps insira uma agulha de perfusão no ventrículo esquerdo e bombeie 10 mililitros de PBS com uma pressão suave e constante.

Quando os tecidos como os rins hepáticos e o trato reprodutivo virou de rosa para branco substituem o PBS por 1%de paraformaldeído ou PFA recém-fabricados e continuam a perfusão com aproximadamente 10 mililitros de PFA. Em seguida, localize a almofada de gordura com os ovários abaixo do rim e disseque suavemente todo o trato reprodutivo, incluindo os ovários da almofada de gordura e chifres uterinos para colocá-lo em um frasco com 4%PFA. Fixar os ovários à temperatura ambiente por 16 a 24 horas antes de substituir o 4%PFA por 70% de etanol.

No dia da coloração aparar os ovários antes de prosseguir com a mancha imuno. No primeiro dia do protocolo de coloração imuno pipeta um mililitro de PBS por poço no número desejado de poços em uma placa limpa de 24 poços. Corte a ponta de uma ponta de pipeta de 1000 microliter para fazer uma abertura larga e use a ponta larga para transferir suavemente os ovários pubertal de frascos com 70% de etanol para os Poços, em seguida, substitua PBS no poço com 0,8 mililitro fresco de PBS No dia seguinte aspirar PBS dos poços para substituí-lo por 0,8 mililitros do tampão de perlitação por poço.

Depois de incubar as placas do agitador à temperatura ambiente por quatro horas substitua o tampão de permeação por tampão de bloqueio No terceiro dia, prepare os anticorpos primários por diluição no tampão de bloqueio. Para visualizar os oócitos incubam os ovários pré-natal e prepubertal com os marcadores oócitos. No oitavo dia, lave as amostras com um tampão de lavagem fresco por duas horas e substitua o tampão de lavagem por 0,5 mililitros das misturas de anticorpos secundários diluídas em um tampão de bloqueio.

Sele a placa com um parafilme para evitar a evaporação e incubar as amostras à temperatura ambiente no escuro por três dias. No dia 11 após a lavagem da coloração imuno, aspire o tampão de lavagem e incuba as amostras com 0,8 mililitros da solução cúbica de escala a 37 graus Celsius por três dias no escuro. Mudando a escala cúbica uma solução diariamente.

No dia 15, lave as amostras três vezes por 10 minutos e 0,8 mililitros de PBS em temperatura ambiente com agitação suave. Em seguida, substitua o PBS por 0,8 mililitros da sacarose desgassada recém-preparada com PBS, seguida de suave agitação à temperatura ambiente. Após uma hora substitua a solução de 20% de sacarose para tratar as amostras por 0,8 mililitros da solução cúbica de escala dois por quatro a cinco dias, como explicado anteriormente.

Para preparar uma amostra configurada, use uma dica de pipeta de 200 microliteres com o corte da ponta para transferir os ovários pubertal com 15 a 20 microliters de solução cúbica de escala dois no meio do poço adesivo. Uma vez que os ovários são transferidos para o poço individual com uma gota de solução de compensação coloque suavemente um copo de tampa no poço adesivo e pressione para criar uma vedação sanduichando as amostras e limpando a solução entre dois deslizamentos de cobertura. Para o local de imagem, o sanduíche de deslizamento de tampa em um slide adaptador de microscópio impresso em 3D.

Configure os parâmetros para aquisição de imagens de acordo com os núcleos de microscopia ou as especificações do fabricante. Se disponível, use a aquisição bidirecional de imagem para reduzir o tempo de digitalização e melhorar a eficiência. Ajuste a média da linha, a média do quadro e o acúmulo de quadros no software.

Configure a pilha Z identificando o início e a posição final, em seguida, selecione um tamanho de passo Z de dois micrômetros para ovários pré-púbertes e cinco micrômetros para ovários pubertal. Em seguida, ative o recurso de compensação Z e o ganho de excitação. Defina a compensação Z para a parte inferior e superior da amostra selecionando uma intensidade de laser para ambos.

Use o modo de revestimento para amostras maiores que não podem ser capturadas em um único campo de visão. Ative o navegador de imagem e indique o número de telhas necessárias para capturar toda a amostra com a ferramenta de marcação retangular. Uma vez que a configuração é feita, comece com a aquisição de imagens para as imagens com várias telhas, comece a aquisição de imagens com o navegador para capturar todas as telhas.

Após a aquisição da imagem, salve todas as imagens. E se várias telhas foram adquiridas, execute a ferramenta mesclada do mosaico para fundir as telhas em uma única imagem. Para determinar o tamanho dos oócitos, abra a imagem e selecione a opção fatia para abrir a imagem da pilha Zs.

Selecione a opção de linha e o painel de medida e meça a distância desenhando uma linha de uma borda de um oócito ou marcador para a outra borda no ponto mais largo para determinar o diâmetro X Y do oócito. Mova-se através da pilha e obtenha a faixa de diâmetros para vários oócitos do mesmo tipo. Use o comprimento mais curto como o critério de seleção de tamanho para contagem de oócitos.

Em seguida, na opção de visualização 3D, selecione o recurso de pontos. No painel de cena ativar a função adicionar novos pontos para abrir o painel do algoritmo. Em seguida, desmarque todas as configurações do algoritmo como o filtro de seleção de tamanho com o tamanho dos oócitos obtido anteriormente.

Clique na seta do canal para a frente para mover-se para o canal de origem. Em seguida, selecione o canal com o marcador preferido e digite o diâmetro adquirido no diâmetro estimado X, Y. Após a seleção de tamanho ativar o modelo de alongamento PSF e subtração de fundo que são automaticamente determinados.

Em seguida, escolha a única seta para a frente para mover-se para o painel de pontos do filtro e adicione o filtro de qualidade para determinar um limiar. Para garantir que a estimativa precisa dos números de oócitos amplie a imagem. Mais tarde, clique na seta dupla para terminar contagens automatizadas.

Use a guia de edição para selecionar manualmente oócitos perdidos ou desmarcar partículas nonoócitos selecionadas pelo limiar automático. Quando feito, registo os dados na guia estatísticas sob a guia geral para análise suplementar. Para estimar os números totais de oócitos e os ovários danificados, abra imagens dos ovários intactos com MRS e selecione o recurso de quadro.

Sob as configurações do quadro, selecione as marcas de marca de grade da caixa e as etiquetas de acesso. Na posição, a guia XYZ selecione 200 micróme para gerar marcas de carrapato com 200 espaços de micrômetros em todas as posições XYZ. Usando as marcas de carrapato de 200 micrômetros, selecione oócitos que se enquadram em 50% do volume de cada ovário.

Clique no recurso de manchas e selecione as etiquetas de edição para classificar os oócitos que se enquadram na região de 50%. Na escala de cinza representativa, foram vistas imagens multifótons dos ovários não perfumados e perfumados, os pequenos oócitos em folículos primordiais com a fina camada de coloração DDX4 citoplasmática. Além disso, os oócitos maiores dentro dos folículos em crescimento foram avistados.

Foram estudadas as renderizações 3D das imagens multifótons do pré-natal e dos ovários pós-natais. No pós-natal 28, o ovário da fêmea não irradiada de controle continha uma grande população de pequenos oócitos nos folículos primordiais. Em contraste, os ovários da fêmea irradiada com 0,5 cinza da radiação gama eram completamente desprovidos de pequenos oócitos nos folículos primários.

Mas os oócitos maiores ainda estavam presentes. Para a quantificação dos oócitos, as imagens multifótons 3D foram processadas no software MRS utilizando o filtro gouciano e os oócitos de tamanhos pequenos e grandes foram identificados e quantificados utilizando o recurso spot. Em seguida, o percentual médio dos oócitos foi calculado em cada etapa em comparação com o número médio presente no estágio inicial E 15,5 os números de oócitos diminuíram acentuadamente entre E 15,5 e E 18,5 o E 15,5 e E 18,5 oócitos fetais expressos linha um orf um P como visto nas imagens multi fótons.

A análise de intensidade mostrou expressões mais elevadas da linha um orf um P por oócitos em E 18,5 do que e 15,5. Os ovários com pequenos danos podem ser usados para análise. O total de oócitos é determinado por meio de correção computacional.

O modelo representativo mostra oócitos G CNA positivos no ovário E 15,5 com cinco regiões de 10% destacadas em um ovário intacto. Da mesma forma, foi gerado um ovário simulado com regiões 10% incrementais faltando até 50% do ovário. Os números totais de oócitos e os ovários simulados foram comparados com os ovários intactos originais.

E a diferença foi apresentada como o desvio percentual Boa perfusão resulta em boa qualidade de imagem. Portanto, certifique-se de que todos os tecidos sejam limpos com PBS antes de mudar para PFA. Certifique-se de que os ovários estão completamente expostos, cortando o tecido extra.

O protocolo permite uma análise eficiente de um grande número de amostras, dados quantitativos obtidos de populações de referência genética, como cruzamento colaborativo ou produção de diversidade, ajudarão a identificar modificadores genéticos do desenvolvimento de oócitos e números de oócitos.