Name: Estudo de modelos experimentais de doação de órgãos para transplante pulmonar (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-03-15T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: Aprenda a estabelecer modelos experimentais de doação pulmonar em ratos, incluindo morte encefálica, circulatória e choque hemorrágico. Este método compara processos inflamatórios e perfis patológicos para melhorar resultados de transplante.

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Agradecemos à FAPESP (Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo) pelo apoio financeiro.

Os experimentos com animais foram submetidos ao Comitê de Ética para Uso e Cuidados com Animais de Experimentação da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo (protocolo número 112/16).
1. Agrupamento de animais
<ol><li>Atribuir aleatoriamente doze ratos machos Sprague Dawley (250-300 g) a um dos três grupos experimentais (n=4) para analisar e comparar os efeitos associados aos modelos animais.</li>
	<li>Atribuir animais ao grupo choque hemorrágico (SH, n=4): animais submetidos a cateterismo vascular com indução de choque hemorrágico + manutenção por 360 min + extração de bloqueio cardiopulmonar + preparo da amostra para análise.</li>
	<li>Atribuir animais ao grupo morte encefálica (BD, n=4): animais submetidos à morte encefálica + manutenção por 360 min + extração do bloqueio cardiopulmonar + preparo da amostra para análise.</li>
	<li>Atribuir animais ao grupo morte circulatória (DC, n=4): animais submetidos a cateterismo vascular + indução de morte circulatória + suspensão da ventilação + isquemia à temperatura ambiente por 180 min + preparo da amostra para análise.</li>
</ol>2. Anestesia e preparo pré-cirúrgico
<ol><li>Coloque o rato em uma câmara fechada com isoflurano a 5% por 1 - 4 min. Confirme a anestesia adequada verificando o reflexo de pinça do dedo do pé. Na ausência de reações reflexas (sem retração da pata), realizar intubação orotraqueal (angiocath 14G) com auxílio de laringoscópio pediátrico.</li>
	<li>Com ventilador mecânico previamente ajustado (FiO2 100%, volume corrente 10 mL/kg, 90 ciclos/min e PEEP 3,0 cmH2O), conecte o cateter traqueal ao ventilador e ajuste a concentração anestésica para 2%. OBS: Todos os procedimentos relacionados aos modelos animais seguiram o mesmo protocolo anestésico descrito nesta seção.</li>
	<li>Remova os pelos das regiões de interesse (cabeça, pescoço, tórax e abdômen). Em seguida, com gaze, desinfetar o campo cirúrgico e a cauda do animal. A desinfecção é realizada com três rodadas alternadas de uma solução alcoólica de esfoliante de digluconato de clorexidina.</li>
	<li>Corte a ponta da cauda do animal, coloque o polegar e o indicador sobre a base da cauda e, em seguida, pressione e deslize-os para longe da base. Coletar uma amostra de sangue periférico (20 μL) através da cauda para a contagem total de leucócitos8. OBS: Este procedimento deve ser realizado antes do início da traqueostomia e imediatamente ao final de cada protocolo (BD e EH - após 360 min).</li>
	<li>Utilizar uma pipeta de precisão para diluir o sangue coletado em 380 μL (1:20) de solução de Turk (ácido acético glacial 99%). Uma vez diluída, pipetar a amostra de sangue para uma câmara de Neubauer e colocá-la sob um microscópio (40x). Realizar a contagem total de leucócitos nos quatro quadrantes laterais da câmara.</li>
</ol>3. Traqueostomia
<ol><li>Com o auxílio de tesoura e pinça apropriadas, realizar dissecção longitudinal da traqueia cervical, iniciando do terço médio do pescoço até a fúrcula esternal (<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62975/62975eq01.jpg" style="margin: auto;">incisão de 1,5 cm). Após a incisão da pele e tecido subcutâneo, dissecar os músculos cervicais até que a traqueia fique exposta.</li>
	<li>Coloque uma ligadura de seda 2-0 sob a traqueia.</li>
	<li>Com microtesoura, traqueostomize o terço superior da traqueia para obter uma ventilação uniforme. Cortar horizontalmente a traqueia entre dois anéis cartilaginosos para acomodar o diâmetro de uma cânula metálica (3,5 cm).</li>
	<li>Insira o tubo de ventilação e fixe-o com ligaduras preparadas.</li>
	<li>Conecte o tubo de ventilação ao sistema de ventilação de pequenos animais.</li>
	<li>Ventilar o rato com volume corrente de 10 mL/kg, velocidade de 70 ciclos/min e PEEP de 3 cmH2O.</li>
</ol>4. Cateterismo de artéria e veia femoral
<ol><li>Expor o triângulo femoral através de uma pequena incisão (<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62975/62975eq01.jpg" style="margin: auto;">1,5 cm) na região inguinal. Identificar e isolar os vasos femorais. Para este procedimento, utilizar um estereomicroscópio (aumento de 3,2x).</li>
	<li>Coloque duas ligaduras de seda 4-0 sob os vasos sanguíneos (veia ou artéria), uma distalmente e outra proximalmente. Fechar a ligadura mais distal, colocar um nó pré-ajustado na ligadura proximal e puxar.</li>
	<li>Insira o cateter através de uma pequena incisão pré-formada nos vasos. Fixar a cânula para evitar luxação. OBS: Realizar os cateteres a partir de extensor neonatal de 20 cm soldado por aquecimento a cateter intravenoso periférico adequado ao calibre da rede venosa do animal, evitando assim a regurgitação do conteúdo sanguíneo. Lubrificar a cânula com heparina, evitando a formação de trombos e complicações durante a medida da pressão arterial média (PAM).</li>
	<li>Conecte o cateter arterial a um transdutor de pressão e a um sistema de monitorização de sinais vitais para registrar a pressão arterial média (PAM). O transdutor deve ser posicionado ao nível do coração do animal. Registre o MAP a cada período de 10 minutos.</li>
	<li>Colocar o cateter da seringa (3 mL) na veia, visando hidratação e exsanguinação quando necessário.</li>
</ol>5. Indução de choque hemorrágico
<ol><li>Por acesso venoso e com seringa heparinizada, retirar pequenos volumes de sangue até atingir valores de PAM de <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62975/62975eq01.jpg" style="margin: auto;">50 mmHg, estabelecendo-se choque hemorrágico. NOTA: Coletar uma alíquota de 2 mL de sangue a cada 10 min na primeira hora do experimento e a cada 30 min nas horas subsequentes.</li>
	<li>Manter a pressão estável em aproximadamente 50 mmHg por um período de 360 min. Para fazer isso, remova ou adicione alíquotas de sangue se a pressão aumentar ou diminuir, respectivamente.</li>
	<li>Coloque uma fonte de calor nas proximidades para evitar hipotermia. NOTA: Aqui, uma lâmpada de calor é usada.</li>
	<li>Ao final do protocolo, colher o bloqueio pulmonar na capacidade pulmonar total (CPT) e congelar em nitrogênio líquido ou colocá-lo em solução fixadora para estudos posteriores. OBS: Com o auxílio de um ventilador para pequenos animais, os parâmetros ventilatórios podem ser acessados durante o protocolo. No presente estudo, esses parâmetros foram avaliados imediatamente antes da indução com EH (Baseline) e 360 min depois (Final).</li>
</ol>6. Indução da morte circulatória
<ol><li>Para induzir morte circulatória, administrar 150 mg/kg de tiopental sódico através da linha venosa. Em seguida, desligue o sistema de ventilação.</li>
	<li>Notar a diminuição progressiva da PAM até atingir 0 mmHg. A partir deste ponto, considere o início do período de isquemia quente e comece a contagem de tempo. O animal deve permanecer à temperatura ambiente (aproximadamente 22 °C) durante 180 minutos.</li>
	<li>Ao final do protocolo, reconectar os pulmões ao ventilador mecânico e retirar o bloqueio pulmonar em CPT para coleta. Congelar rapidamente usando nitrogênio líquido ou colocá-lo na solução de fixação para estudos posteriores.</li>
</ol>7. Indução da morte encefálica
<ol><li>Coloque o rato na posição prona.</li>
	<li>Retire a pele do crânio usando tesoura cirúrgica. Perfurar um furo de calibre 1mm 2,80 mm anterior e 10,0 mm ventral ao bregma e 1,5 mm lateral à sutura sagital.</li>
	<li>Insira todo o cateter-balão na cavidade craniana e certifique-se de que o balão seja pré-preenchido com soro fisiológico (500 μL).</li>
	<li>Com a ajuda de uma seringa, inflar rapidamente o cateter.</li>
	<li>Confirmar a morte encefálica observando elevação abrupta da PAM (reflexo de Cushing), ausência de reflexos, midríase bilateral e apneia. Após a confirmação, suspender a anestesia e manter o animal em ventilação mecânica por 360 min.</li>
	<li>Coloque uma fonte de calor nas proximidades para evitar hipotermia.</li>
	<li>Ao final do protocolo, colher o bloco pulmonar em CCT para coleta e congelar em nitrogênio líquido ou colocá-lo em solução fixadora para estudos posteriores. OBS: Com o auxílio de um ventilador para pequenos animais, os parâmetros ventilatórios podem ser acessados durante o protocolo. No presente estudo, avaliamos esses parâmetros imediatamente antes da indução do DO (Baseline) e após 360 minutos (Final).</li>
</ol>

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<li>Wohlauer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nebulized+hypertonic+saline+attenuates+acute+lung+injury+following+trauma+and+hemorrhagic+shock+via+inhibition+of+matrix+metalloproteinase-13%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Nebulized hypertonic saline attenuates acute lung injury following trauma and hemorrhagic shock via inhibition of matrix metalloproteinase-13.</a> Critical Care Medicine. 40 (9), 2647-2653 (2012).</li>
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<li>Kang, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+signatures+in+donor+lungs+from+donation+after+cardiac+death+vs+after+brain+death%3A+a+functional+pathway+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Heart+and+Lung+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Transcriptional signatures in donor lungs from donation after cardiac death vs after brain death: a functional pathway analysis.</a> The Journal of Heart and Lung Transplantation. 30 (3), 289-298 (2011).</li>
</ol>

Gostaríamos de confirmar que não há conflitos de interesse conhecidos associados a esta publicação e que não houve apoio financeiro significativo para este trabalho que pudesse ter influenciado seu resultado.

Nos últimos anos, o crescente número de diagnósticos de morte encefálica fez com que se tornasse o maior provedor de órgãos e tecidos destinados a transplante. Esse crescimento, no entanto, tem sido acompanhado por um aumento incrível de doações após a morte circulatória. Apesar de sua natureza multifatorial, a maioria dos mecanismos desencadeantes das causas de morte inicia-se após ou acompanha o trauma com extensa perda de conteúdosanguíneo4,18.
Nesse contexto, modelos experimentais de morte encefálica, parada circulatória e choque hemorrágico são ferramentas importantes para o estudo prospectivo das complicações associadas à causa de morte do doador e seu impacto na viabilidade de potenciais órgãos destinados ao transplante6,8,10. Várias linhagens animais têm sido sugeridas para o estabelecimento de modelos, como suínos, coelhos, ratos e camundongos. Modelos em ratos e camundongos são mais comuns na literatura por serem pouco dispendiosos e envolverem baixa dificuldade logística, ao mesmo tempo em que reproduzem satisfatoriamente os eventos fisiopatológicos estudados8,13,14,15.
Gostaríamos de enfatizar que diretrizes e estudos recentes endossaram o uso da analgesia pré-anestésica como parte integrante de protocolos cirúrgicos, mesmo em situações agudas, visando um manejo mais abrangente da dor perioperatória e do bem-estar animal. Recomendamos que os pesquisadores avaliem tal abordagem em estudos futuros.
Morte encefálica (ME) O modelo de BD mostrou-se reprodutível por meio de um aumento abrupto da PIC. O uso de instrumental apropriado e pessoal treinado permite o sucesso cirúrgico e a reprodução da técnica com poucas semanas de treinamento. Durante o desenvolvimento da técnica de ME, a trepanação deve ser realizada com uma broca motorizada apropriada para que não haja folga no cateter, evitando assim a projeção de tecido cerebral para fora do orifício. Além disso, durante a perfuração, o movimento anterior da broca deve ser interrompido assim que a resistência inicial oferecida pelo crânio for superada.
Os pesquisadores devem permanecer alertas e garantir a rápida insuflação do cateter, pois a insuflação gradual promove respostas inflamatórias e hemodinâmicasdistintas21. As alterações da pressão arterial, por sua vez, devem ser monitoradas constantemente durante todo o protocolo, especialmente durante a insuflação do cateter, que deve ser acompanhada por um aumento abrupto da PAM e durante a primeira hora após o estabelecimento do BD (período de hipotensão pós-insuflação). Esses resultados estão de acordo com a literatura, que mostra o estabelecimento de um pico hipertensivo imediatamente após a insuflação do cateter, seguido de uma diminuição dos níveis pressóricos, em provável resposta ao aumento transitório dos níveis circulantes de catecolaminas22.
A manutenção do animal em ME por períodos prolongados pode levar à hipotensão seguida de morte circulatória, inviabilizando o experimento. Nesse sentido, a maioria dos protocolos utilizados na literatura estabelece um período de seguimento que varia de 4 a 6 horas, após o qual drogas vasoativas devem ser administradas 12,13,21,22,23.
Além das alterações hemodinâmicas, o infarto cerebral e a isquemia promovem aumento da circulação sistêmica de fatores pró-inflamatórios que, quando atingem os pulmões, contribuem para a lesão do parênquima pulmonar 24,25,26.
Em nosso estudo, o DO foi acompanhado por um aumento significativo na expressão tecidual de IL-1β (sobre a DC) e na relação peso úmido/seco, um índice de edema pulmonar. Estudos prévios indicaram um aumento nos níveis circulantes de citocinas pró-inflamatórias após um evento de TB, o que pode, em última instância, favorecer a modulação da expressão de moléculas de adesão, aumento da permeabilidade vascular e consequente migração leucocitária 27,28,29,30.
Choque hemorrágico (HS) Estabelecido através da retirada ou reinfusão de alíquotas sanguíneas com o objetivo de manutenção prolongada da hipotensão (≤ 50 mmHg), o modelo de pressão fixa da EH visa mimetizar a diminuição da volemia causada pelo processo hemorrágico e, consequentemente, a atenuação da pressão de enchimento sistêmico. Esses eventos levam à diminuição da PAM, acompanhada de diminuição da pressão de perfusão pulmonar 31,32.
Entre as vantagens desse modelo de EH está a possibilidade de controlar o grau e a duração da hipotensão arterial, além da maior reprodutibilidade da técnica quando comparada a modelos baseados em volume sanguíneo pré-fixado. Nesse sentido, a maioria dos protocolos utilizados na literatura estabelece um período de protocolo que varia de 15 min a mais de 180 min, com níveis pressóricos médios variando de 20 a 55 mmHg, dependendo da análise escolhida no estudo 6,32. No presente estudo, a hipotensão arterial foi mantida por 3 horas, levando ao aumento da resistência tecidual, seguido de diminuição da complacência pulmonar nos animais submetidos à EH. Corroborando isso, diferentes estudos na literatura têm indicado relação proporcional entre o tempo despendido na EH e o impacto da hipovolemia na resistência das vias aéreas e complacência pulmonar 6,33,34.
Além disso, no presente estudo, a SH foi acompanhada por leucocitose significativa e aumento da expressão tecidual de IL-1β (em relação à DC) e TNF-α. A lesão do endotélio da microvasculatura pulmonar, induzida pela liberação de espécies reativas de oxigênio do processo primário de hipóxia e isquemia estabelecida, aumentará a permeabilidade vascular que, juntamente com o aumento da pressão da artéria pulmonar, atuará como fator quimiotático para leucócitos e a consequente liberação de mediadores inflamatórios 6,20,31,35,36, 37,38.
Morte circulatória (DC) A principal diferença entre os enxertos marginais oriundos dos processos BD e CD é o tempo de isquemia quente (WIT) ao qual o enxerto será submetido, definido por alguns pesquisadores como o tempo entre a ausência de pulsos periféricos e a interrupção do fluxo sanguíneo devido à retirada do equipamento de suporte vital até a perfusão fria ou regional do órgão17, 39,40.
No presente estudo, os órgãos e tecidos de animais derivados do modelo DC foram submetidos a um período de WIT de 180 min. Vários estudos na literatura têm revelado uma relação proporcional entre o AT e a disfunção pós-transplante, sugerindo que o tempo de isquemia deve variar de acordo com as particularidades e integridade de cada órgão. Nesse contexto, enxertos pulmonares de ratos têm demonstrado tolerar até 3 h de isquemia quente41,42.
Com evidências de lesão tecidual causada pela fase simpática predominante, instabilidade hemodinâmica e inflamação sistêmica decorrente do processo de TB, as doações após parada circulatória têm sido reconsideradas como uma potencial estratégia para diminuir as complicações associadas ao transplante 41,42,43. Nesse sentido, nossos dados indicam uma redução drástica nos níveis de IL-1β e TNF-α no modelo DC em relação aos outros dois modelos estudados. Corroborando isso, Iskender et al.4 observaram os baixos níveis de citocinas teciduais em um modelo de reperfusão pulmonar em ratos com tecidos doados após o AT por mecanismos ainda pouco compreendidos.
Com base no exposto, a escolha da metodologia e suas adaptações devem depender dos objetivos desenvolvidos pelo pesquisador. Uma vez determinados, esses objetivos devem nortear o tipo de modelo de doação, o tempo do protocolo e as análises a serem realizadas. Também é possível relacionar o tipo de doação com modelos animais de recondicionamento e reperfusão pulmonar.
Conclusões Em conclusão, os modelos de doadores de órgãos aqui descritos são ferramentas potenciais no estudo das mudanças associadas às diferentes metodologias de retirada de enxertos e podem fornecer meios para obter uma compreensão completa do impacto da qualidade desses órgãos nos resultados pós-transplante, dada a reprodutibilidade e confiabilidade das metodologias aqui apresentadas.

Relevância clínica O transplante de órgãos é uma opção terapêutica bem estabelecida para diversas patologias graves. Nos últimos anos, muitos avanços foram alcançados no campo clínico e experimental dos transplantes de órgãos, como maior conhecimento da fisiopatologia da disfunção primária do enxerto (PGD) e avanços nas áreas de terapia intensiva, imunologia e farmacologia 1,2,3. Apesar das conquistas e melhorias na qualidade dos procedimentos cirúrgicos e farmacológicos relacionados, a relação entre o número de órgãos disponíveis e o número de receptores em lista de espera continua sendo um dos principais desafios 2,4. Nesse sentido, a literatura científica tem proposto modelos animais para o estudo de terapias que podem ser aplicadas a doadores de órgãos para tratar e/ou preservar os órgãos até o momento do transplante5,6,7,8.
Ao mimetizar os diferentes eventos observados na prática clínica, os modelos animais permitem o estudo dos mecanismos patológicos associados e suas respectivas abordagens terapêuticas. A indução experimental desses eventos, na maioria dos casos isolados, tem gerado modelos experimentais de doação de órgãos e tecidos que são amplamente investigados na literatura científica sobre transplante de órgãos6,7,8,9. Esses estudos empregam diferentes estratégias metodológicas, como as indutoras de morte encefálica (ME), choque hemorrágico (EH) e morte circulatória (DC), uma vez que esses eventos estão associados a diferentes processos deletérios que comprometem a funcionalidade dos órgãos e tecidos doados.
Morte encefálica (ME) O THB está associado a uma série de eventos que levam à deterioração progressiva de diferentes sistemas. Geralmente ocorre quando um aumento agudo ou gradual da pressão intracraniana (PIC) ocorre devido a trauma cerebral ou hemorragia. Esse aumento da PIC promove um aumento da pressão arterial na tentativa de manter estável o fluxo sanguíneo cerebral, em um processo conhecido como reflexo de Cushing10,11. Essas alterações agudas podem resultar em disfunções cardiovasculares, endócrinas e neurológicas que comprometem a quantidade e a qualidade dos órgãos doados, além de impactar na morbidade e mortalidade pós-transplante 10,11,12,13.
Choque hemorrágico (HS) A EH, por sua vez, está frequentemente associada a doadores de órgãos, pois a maioria deles é vítima de trauma com perda significativa da volemia. Alguns órgãos, como pulmões e coração, são particularmente vulneráveis à EH devido à hipovolemia e consequente hipoperfusão tecidual14. A EH induz lesão pulmonar por meio do aumento da permeabilidade capilar, edema e infiltração de células inflamatórias, mecanismos que, em conjunto, comprometem as trocas gasosas e levam à deterioração progressiva dos órgãos, inviabilizando o processo de doação 6,14.
Morte circulatória (DC) A utilização da doação pós-DC vem crescendo exponencialmente nos grandes centros mundiais, contribuindo para o aumento do número de órgãos coletados. Órgãos recuperados de doadores pós-DC são vulneráveis aos efeitos da isquemia quente, que ocorre após um intervalo de baixo (fase agônica) ou nenhum suprimento sanguíneo (fase assistólica)8,15. A hipoperfusão ou a ausência de fluxo sanguíneo levará à hipóxia tecidual associada à perda abrupta de ATP e ao acúmulo de toxinas metabólicas nos tecidos15. Apesar de sua utilização atual para transplante na prática clínica, muitas dúvidas permanecem sobre o impacto do uso desses órgãos na qualidade do enxerto pós-transplante e na sobrevida do paciente15. Assim, a utilização de modelos experimentais para melhor compreensão dos fatores etiológicos associados à DC também vem crescendo8,15,16,17.
Modelos experimentais Existem vários modelos experimentais de doação de órgãos (ME, EH e DC). No entanto, os estudos muitas vezes se concentram em apenas uma estratégia de cada vez. É perceptível a lacuna nos estudos que combinam ou comparam duas ou mais estratégias. Esses modelos são muito úteis no desenvolvimento de terapias que buscam aumentar o número de doações e, consequentemente, diminuir a fila de espera dos potenciais receptores. As espécies animais utilizadas para este fim variam de estudo para estudo, sendo os modelos suínos mais comumente selecionados quando o objetivo é uma tradução mais direta com a morfofisiologia humana e menor dificuldade técnica no procedimento cirúrgico devido ao tamanho do animal. Apesar dos benefícios, dificuldades logísticas e altos custos estão associados ao modelo suíno. Por outro lado, o baixo custo e a possibilidade de manipulação biológica favorecem a utilização de modelos de roedores, permitindo ao pesquisador partir de um modelo confiável para reproduzir e tratar lesões, bem como integrar o conhecimento adquirido na área de transplante de órgãos.
Apresentamos um modelo de roedor de morte encefálica, morte circulatória e doação por choque hemorrágico. Descrevemos processos inflamatórios e condições patológicas associadas a cada um desses modelos.

<table><tbody><tr><td>Angiocath de calibre 14</td><td>DB</td><td>38186714</td><td>Intubação orotraqueal</td></tr><tr><td>Brasuture</td><td>de seda 2.0</td><td>AA553</td><td>Fixação do tubo traqueal</td></tr><tr><td>Angiocath de calibre 24</td><td>DB</td><td>38181214</td><td>Acesso arterial e venoso</td></tr><tr><td>Brasuture</td><td>AA551</td><td>de seda 4.0</td><td>Fixação de cânulas arteriais e venosas</td></tr><tr><td>Solução alcoólica de digluconato de clorexidina (2%).</td><td>Aparelho de</td> tricotomia Vic <td>Pharma Y/N</td><td>Asepsis</td></tr><tr><td></td><td>Oster</td><td>Y/N</td><td>Dispositivo de recorte</td></tr><tr><td>Balança de precisão</td><td>Shimadzu</td><td>D314800051</td><td>Análise da relação peso úmido/seco</td></tr><tr><td>Barbitúrico (Tiopental)</td><td>Crist&aacute; lia</td><td>18080003</td> Cateter balão de <td>indução DC</td></tr><tr><td>(Fogarty-4F)</td><td>Edwards Life Since</td><td>120804</td><td>Extensor neonatal de indução BD</td></tr><tr><td></td><td>Embramed</td><td>497267</td><td>Utilizado como cateter com o auxílio do angiocath 24 G</td></tr><tr><td>FlexiVent</td><td>Scireq</td><td>1142254</td><td>Análise dos parâmetros ventilatórios</td></tr><tr><td>Heparina</td><td>Blau Farmaceutica SA</td><td>7000982-06</td><td>Anticoagulante</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Crist&aacute; lia</td><td>10,29,80,130</td><td>Micropipeta de anestesia inalatória</td></tr><tr><td>(1000 &micro; L)</td><td>Eppendorf</td><td>347765Z</td><td>Manuseio de líquidos de pequeno volume</td></tr><tr><td>Micropipeta (20 &micro; L)</td><td>Eppendorf</td><td>H19385F</td><td>Manuseio de líquidos de pequeno volume</td></tr><tr><td>Microscópio</td><td>Zeiss</td><td>1601004545</td><td>Assistência na visualização de estruturas para o procedimento cirúrgico</td></tr><tr><td>Monitor multiparamétrico</td><td>Dixtal</td><td>101503775</td><td>Registro MAP</td></tr><tr><td>Broca motorizada</td><td>Midetronic</td><td>MCA0439</td><td>Utilizado para perfurar um furo de calibre 1 mm</td></tr> Câmara <tr><td>Neubauer</td><td>Kasvi</td><td>D15-BL</td><td>Contagem de células</td></tr><tr><td>Laringoscópio pediátrico</td><td>Oxygel</td><td>Y/N</td><td>Assistência durante a intubação traqueal</td></tr><tr><td>Seringa (3 mL)</td><td>SR</td><td>3330N4</td><td>Hidratação e exsanguinação durante o protocolo HS</td></tr><tr><td>Transdutor de pressão</td><td>Edwards Life Since</td><td>P23XL</td><td>Registo MAP</td></tr><tr><td>Tubo traqueal metálico</td><td></td><td>Biomedical 006316/12</td><td>Cânula rígida para análise com o ventilador FlexiVent</td></tr><tr><td>Vaporizador de isoflurano</td><td>Harvard Bioscience</td><td>1,02,698</td><td>Sistema de anestesia</td></tr><tr><td>Ventilador mecânico para pequenos animais (683)</td><td>Harvard Apparatus</td><td>MA1 55-0000</td><td>Ventilação mecânica</td></tr><tr><td>metodologia xMap</td><td>Millipore</td><td>RECYTMAG-65K-04</td><td>Análise de marcadores inflamatórios</td></tr></tbody></table>

estudo de modelos experimentais de doação de órgãos para transplante pulmonar

Study of Experimental Organ Donation Models for Lung Transplantation

Modelos experimentais são ferramentas importantes para a compreensão dos fenômenos etiológicos envolvidos em diversos eventos fisiopatológicos. Nesse contexto, diferentes modelos animais são utilizados para estudar os elementos desencadeantes da fisiopatologia da disfunção primária do enxerto após o transplante, a fim de avaliar possíveis tratamentos. Atualmente, podemos dividir os modelos experimentais de doação em dois grandes grupos: doação após morte encefálica e doação após parada circulatória. Além disso, os efeitos deletérios associados ao choque hemorrágico devem ser considerados quando se consideram modelos animais de doação de órgãos. Descrevemos o estabelecimento de três diferentes modelos de doação pulmonar (doação pós-morte encefálica, doação pós-morte circulatória e pós-doação de choque hemorrágico) e comparamos os processos inflamatórios e distúrbios patológicos associados a esses eventos. O objetivo é fornecer à comunidade científica modelos animais confiáveis de doação pulmonar para o estudo dos mecanismos patológicos associados e busca de novos alvos terapêuticos para otimizar o número de enxertos viáveis para transplante.

Pressão arterial média (PAM) Para determinar as repercussões hemodinâmicas do TAB e da EH, a PAM foi avaliada ao longo dos 360 minutos do protocolo. A medida basal foi coletada após a remoção da pele e perfuração do crânio e antes da coleta de alíquotas de sangue para os animais submetidos a ME ou EH, respectivamente. Antes da indução com ME e EH, a PAM basal dos dois grupos foi semelhante (BD: 110,5 ± 6,1 vs. CC: 105,8 ± 2,3 mmHg; p=0,5; ANOVA de duas vias). Após a insuflação do cateter, o grupo BD apresentou aumento abrupto dos níveis pressóricos (138,7 ± 10,1 mmHg). O pico hipertensivo é um evento peculiar relacionado ao aumento da pressão intracraniana e pode ser considerado a primeira evidência do estabelecimento do ME. Além disso, observamos ausência de reflexos, midríase bilateral e apneia pós-insuflação em todos os animais. Esse pico de pressão foi seguido por uma rápida redução da PAM (10 min - 81,2 ± 10 mmHg). A hipotensão arterial persistiu por aproximadamente 50 min, após o que os níveis da PAM retornaram a valores próximos aos basais (120 min - 120,7 ± 7,5 mmHg) (Figura 1).
Ao contrário do grupo BD, a diminuição da PAM no grupo SH está associada à retirada de alíquotas de sangue nos primeiros 10 min do experimento. O choque hipovolêmico foi mantido por 360 min (variação média ao longo do protocolo de 52,3 ± 1,2 mmHg). Após o término do protocolo, o grupo BD apresentou padrão de PAM significativamente diferente ao longo das 6 h de seguimento do grupo EH (BD: 93,7 ± 4,5 vs. CC: 52,3 ± 0,5 mmHg; p&lt;0,0001; Teste t de Student).
Mecânica pulmonar Para avaliar os parâmetros elásticos e resistivos do sistema respiratório, foi realizada uma análise da mecânica pulmonar dos animais submetidos à ME e EH. 360 min após o início e após a manutenção da hipotensão, o grupo SH exibiu aumento da resistência do tecido pulmonar (G) (HS: Baseline - 0,26 ± 0,02 vs. Final - 0,51 ± 0,05 cmH2O.mL-1; p=0,03; bidirecional ANOVA), seguida de redução da complacência do sistema respiratório (Crs) (SH: Baseline - 0,64 ± 0,05 vs. Final - 0,23 ± 0,004 cmH2O/mL; p=0,001; bidirecional ANOVA) (Figura 2A,B).
Edema pulmonar Ao final do protocolo, o lobo médio do pulmão direito foi coletado para todos os grupos, e seu peso foi medido para análise da relação peso úmido/seco, que foi utilizado como índice de edema pulmonar. O peso úmido foi avaliado imediatamente após a extração do órgão, e o peso seco foi medido após 24 h em estufa a 80 °C. De acordo com essa relação, o grupo BD (2,32 ± 0,1) apresentou maior edema que os grupos EH (1,97 ± 0,03) e CD (2,04 ± 0,02) (Figura 3).
Parâmetros inflamatórios sistêmicos e teciduais Ao final do protocolo, houve aumento significativo do número total de leucócitos sistêmicos no grupo submetido à EH (Linha de base - 13888 ± 887,3 vs. Final - 35263 ± 4076mm3; p=0,0189); bidirecional ANOVA) (Figura 4). O grupo SH também apresentou aumento no número de leucócitos tanto em relação aos valores basais quanto em relação ao grupo BD (p = 0,0132).
A inflamação tecidual foi avaliada pela quantificação de marcadores inflamatórios no tecido pulmonar. Para isso, amostras de biópsia de tecido pulmonar foram homogeneizadas em tampão fosfato e, em seguida, enviadas para análise da expressão de fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) e interleucina 1 beta (IL1-β). A expressão de IL1-β foi maior no grupo BD (304,4 ± 91 pg/mg) e no grupo SH (327,5 ± 25,2 pg/mg) do que no grupo CD (8 ± 2,3 pg/mg; p=0,004; de mão única ANOVA) (Figura 5B). O grupo SH também apresentou níveis mais elevados de TNF-α (4,7 ± 0,3 pg/mg; p&lt;0,0001; de mão única ANOVA) do que os grupos BD (1,3 ± 0,3 pg/mg) e CD (0,4 ± 0,2 pg/mg) (Figura 5B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62975/62975fig01.jpg"> Figura 1: Evolução temporal da pressão arterial média (PAM) nos grupos morte encefálica (ME) e choque hemorrágico (EH). Os valores de todas as medições são expressos como as médias ± os erros-padrão das médias (MES). PAM, pressão arterial média; ME, morte encefálica; EH, choque hemorrágico. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62975/62975fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62975/62975fig02.jpg"> Figura 2: Mecânica pulmonar. A mecânica pulmonar é determinada pela (A) complacência do sistema respiratório e (B) resistência tecidual nos grupos morte encefálica (ME) e choque hemorrágico (CC). * indica diferenças significativas entre os valores basais e finais no grupo SH (p&lt;0,05). Os valores de todas as medidas foram expressos como médias ± erros padrão das médias (SEMs), e a ANOVA two-way foi utilizada para comparações. Crs, complacência do sistema respiratório; G, resistência tecidual; ME, morte encefálica; EH, choque hemorrágico. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62975/62975fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62975/62975fig03.jpg"> Figura 3: Edema pulmonar determinado pela relação peso úmido/seco no grupo morte encefálica (ME) e choque hemorrágico (EH). Os valores de todas as medidas foram expressos como médias ± erros padrão das médias (SEMs), e as comparações foram feitas com ANOVA one-way . ME, morte encefálica; EH, choque hemorrágico; DC, morte circulatória. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62975/62975fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62975/62975fig04.jpg"> Figura 4: Leucograma dos grupos choque hemorrágico (EH) e morte encefálica (ME). * indica diferenças significativas entre os valores basais e finais no grupo SH (p&lt;0,05). Os valores de todas as medidas foram expressos como médias ± erros padrão da média (MES), e as comparações foram feitas com ANOVA two-way . ME, morte encefálica; EH, choque hemorrágico. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62975/62975fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62975/62975fig05.jpg"> Figura 5: As respostas inflamatórias locais foram menos proeminentes no grupo morte circulatória (DC). (A) Expressão tecidual pulmonar de IL-1β; (B) Expressão tecidual de TNF-α. Os valores de todas as medidas foram expressos como médias ± erros padrão da média (MEEs), e as comparações foram feitas com ANOVA one-way . ME, morte encefálica; EH, choque hemorrágico; DC, morte circulatória. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62975/62975fig05large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

O presente estudo mostra o estabelecimento de três diferentes modelos de doação pulmonar (doação pós-morte encefálica, doação pós-morte circulatória e doação pós-choque hemorrágico). Compara os processos inflamatórios e distúrbios patológicos associados a esses eventos.

Estudo de modelos experimentais de doação de órgãos para transplante pulmonar

Experimental models are important tools for understanding the etiological phenomena involved in various pathophysiological events. In this context, ...

Os modelos experimentais de doação de órgãos geralmente mimetizam situações isoladas de lesão tecidual relacionadas ao processo de morte e/ou eventos relacionados à preservação e implantação do órgão. Esses modelos são muito úteis no desenvolvimento de terapias que buscam aumentar o número de doações e, consequentemente, diminuir a lista de ponderação dos potenciais receptores. Nesse sentido, tornou-se importante o desenvolvimento de diferentes modelos, como os indutores de morte encefálica e morte circulatória.Uma vez que esses eventos estão associados a diferentes processos deletérios que comprometem a funcionalidade dos órgãos doados e dos tecidos. Anestesia e preparo pré-cirúrgico. Colocar o rato numa câmara fechada com isoflurano a 5% durante um a quatro minutos.Confirme a anestesia adequada verificando o reflexo de pinça do dedo do pé. Na ausência de reações reflexas, realizar intubação orotraqueal, Angiocath calibre 14 com o auxílio de um laringoscópio pediátrico. Com ventilador mecânico previamente ajustado e volume corrente de 10 mililitros por quilograma, 90 ciclos por minuto e PEEP 3,0 centímetros H2O, conecte o cateter traqueal ao ventilador e ajuste a concentração anestésica para 2% Remova os pelos das regiões de interesse, cabeça, pescoço, tórax e abdômen.Em seguida, com gaze, limpeza do campo cirúrgico e da cauda do animal com solução alcoólica de digluconato de clorexidina, o procedimento de desinfecção a 2% foi repetido três vezes. Corte a ponta da cauda do animal, coloque o polegar e o indicador sobre a base da cauda e, em seguida, pressione e deslize-os para longe da base. Coletar uma amostra de sangue periférico, 20 microlitros através da cauda para a contagem total de leucócitos. Traqueostomia.Realizar dissecção longitudinal da traqueia cervical, iniciando do terço médio do pescoço até a fúrcula esternal. Incisão de aproximadamente 1,5 centímetros. Após incisão da pele e tecido subcutâneo, dissecar os músculos cervicais até que a traqueia fique exposta.Coloque a ligadura de seda 2.0 sob a traqueia. Com a microtesoura, traqueostomia o terço superior da traqueia para uniformizar a ventilação. Corte horizontalmente a traqueia entre dois anéis cartilaginosos para acomodar o diâmetro de uma cânula metálica, 3,5 centímetros.Insira o tubo de ventilação e fixe-o com ligaduras preparadas. Conecte o tubo de ventilação ao sistema de ventilação de pequenos animais. Ventilar o rato com um volume corrente de 10 mililitros por quilograma, taxa de 70 ciclos por minuto e PEEP de 3 centímetros H2O.Cateterismo de artéria e veia femoral. Assim, exponha o triângulo femoral através de uma pequena incisão, de aproximadamente 1,5 centímetros na região inguinal. Identificar e isolar os vasos femorais.Para este procedimento, utilizar um estereomicroscópio com aumento de 3,2 vezes. Coloque duas ligaduras de seda 4.0 abaixo dos vasos sanguíneos, veia ou artéria, uma distalmente e outra proximalmente. Fechar a ligadura mais distal e colocar um nó pré-ajustado na ligadura proximal e puxar.Insira o cateter através de uma pequena incisão pré-formada nos vasos. Fixar a cânula para evitar luxação. Conecte o cateter arterial a um transdutor de pressão e a um sistema de monitorização de sinais vitais para registrar a PAM.O transdutor deve ser posicionado ao nível do coração do animal. Conecte o cateter de arco e flecha a um transdutor de pressão e a um sistema de monitoramento de sinais vitais para registrar a PAM. O transdutor deve ser posicionado ao nível do coração do animal.Coloque o cateter da seringa de 3 mililitros na veia, visando hidratação e exsanguinação quando necessário. Indução de choque hemorrágico. Através do eixo venoso e com uma seringa heparinizada, remova pequenos volumes de sangue até atingir valores de PAM de aproximadamente 50 milímetros de mercúrio.Assim, estabelecendo-se choque hemorrágico. Nota, alíquotas de sangue devem ser colhidas em intervalos de 10 minutos. Mantenha a pressão estável em aproximadamente 50 milímetros de mercúrio por um período de 360 minutos.Para fazer isso, remova ou adicione alíquotas de sangue se a pressão aumentar ou diminuir, respectivamente. Coloque uma fonte de calor nas proximidades para evitar hipotermia. Ao final do protocolo, retirar o bloqueio pulmonar na capacidade pulmonar total para coleta e congelar em nitrogênio líquido ou colocar em solução fixadora para estudos posteriores.Indução de morte circulatória. Para induzir a morte circulatória, administrar 150 miligramas por quilograma de tiopental sódico através da linha venosa. Em seguida, desligue o sistema de ventilação.Nota-se a diminuição progressiva da PAM. O animal deve permanecer em isquemia aquecida à temperatura ambiente por 180 minutos. Ao final do protocolo, reconectar os pulmões ao ventilador mecânico e retirar o bloqueio pulmonar na capacidade pulmonar total para coleta.E congelar rapidamente em nitrogênio líquido, ou colocar em solução de fixação para estudos posteriores. Indução de morte encefálica. Coloque o rato na posição prona.Retire a pele do crânio usando tesoura cirúrgica. Perfurar um furo de calibre 1 milímetro, 2,8 milímetros anterior, 10 milímetros ventral e 1,5 milímetros lateral à sutura sagital. Insira todo o cateter balão na cavidade craniana e certifique-se de que o balão esteja pré-preenchido com soro fisiológico, 500 microlitros.Com a ajuda de uma seringa, inflar rapidamente o cateter. Confirmar a morte encefálica observando elevação abrupta da PAM. Reflexo de Cushing, ausência de reflexos, midríase bilateral e apneia.Após a confirmação, suspender a anestesia e manter o animal em ventilação mecânica por 360 minutos. Coloque uma fonte de calor nas proximidades para evitar hipotermia. Ao final do protocolo, retirar o bloqueio pulmonar na capacidade pulmonar total para coleta. Resultados.Após a insuflação do cateter, o grupo com morte encefálica apresentou aumento abrupto dos níveis pressóricos. O pico hipertensivo é um evento peculiar relacionado ao aumento da pressão intracraniana, podendo ser considerado a primeira evidência do estabelecimento da morte encefálica. Esse pico de pressão foi seguido por uma rápida diminuição da PAM.A hipotensão arterial persistiu por aproximadamente 50 minutos, após os quais os níveis da PAM retornaram a valores próximos aos basais. Ao contrário do grupo de morte encefálica, a diminuição da PAM no grupo choque hemorrágico está associada à retirada de alíquotas de sangue nos primeiros 10 minutos do experimento. O choque hipovolêmico foi mantido por 360 minutos.Seis horas após o início do choque hemorrágico, os animais apresentaram aumento da resistência do tecido pulmonar, seguido de redução da complacência do sistema respiratório. Para avaliar as alterações no edema pulmonar, a relação peso úmido para seco foi examinada. Nesse contexto, a morte encefálica apresentou maior edema em relação ao grupo choque hemorrágico e morte circulatória.Finalmente, o grupo choque hemorrágico associou-se ao aumento do número total de leucócitos sistêmicos em relação aos valores basais e em relação ao grupo morte encefálica. Isso foi acompanhado por níveis aumentados de expressão de IL1 Beta no grupo de morte encefálica e no grupo de choque hemorrágico do que no grupo de morte circulatória. O grupo choque hemorrágico também apresentou níveis mais elevados de TNF alfa em comparação com o grupo morte encefálica e o grupo morte circulatória.Os modelos de doadores de órgãos aqui descritos são ferramentas potenciais no estudo das mudanças associadas às diferentes metodologias de retirada de enxertos e podem fornecer meios para obter uma compreensão completa do impacto da qualidade desses órgãos nos resultados pós-transplante. Dada a reprodutibilidade e confiabilidade das metodologias aqui apresentadas.

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