Name: Otimização do Modelo de Oclusão de Veia da Retina em Camundongo para Limitar a Variabilidade (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 23 s
Description: Aprenda a otimizar o modelo de oclusão de veia da retina em camundongos usando rosa bengala e laser. Este método permite investigar lesões vasculares e edema de forma não invasiva, facilitando testes de tratamentos eficientes.

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<div>Este trabalho foi apoiado pelo National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program (NSF-GRFP) DGE - 1644869 (para CCO), o National Eye Institute (NEI) 5T32EY013933 (para AMP) e o National Institute on Aging (NIA) R21AG063012 (para CMT).</div>

Este protocolo segue a declaração da Associação de Pesquisa em Visão e Oftalmologia (ARVO) para o uso de animais em pesquisas oftálmicas e de visão. Experimentos com roedores foram aprovados e monitorados pelo Comitê Institucional de Cuidado e Uso de Animais (IACUC) da Universidade de Columbia.
NOTA: Todos os experimentos usaram camundongos machos de dois meses de idade que pesavam aproximadamente 20 g.
1. Preparação e administração de tamoxifeno para ablação genética induzível de genes floxados
NOTA: O diâmetro dos vasos da retina pode ser afetado pelo peso do animal. Certifique-se de que todos os animais utilizados para uma experiência têm pesos semelhantes.
<ol><li>Diluir o tamoxifeno em óleo de milho a uma concentração de 20 mg/mL. NOTA: O tamoxifeno é um tóxico e é sensível à luz. Proteja da luz, por exemplo, com papel alumínio.</li>
	<li>Vórtice a solução por alguns segundos.</li>
	<li>Deixar no forno a 55 °C durante 15 min. NOTA: Certifique-se de que o tamoxifeno se dissolveu completamente. Vórtices adicionais podem ser necessários.</li>
	<li>Conservar a solução a 4 °C durante um período máximo de 1 semana.</li>
	<li>Use uma seringa de 1 mL equipada com uma agulha de 26 G para injeção de tamoxifeno. Limpe a área de injeção com etanol a 70%.  Administrar 2 mg de tamoxifeno (100 μL de 20 mg/mL) por via intraperitoneal (IP) uma vez ao dia pelo tempo estabelecido de acordo com a linha de Cre induzível específica.</li>
	<li>Permita dois dias de descanso para os animais antes de iniciar os experimentos.</li>
</ol>2. Preparação de reagentes para fotocoagulação a laser
<ol><li>Rosa bengala NOTA: A rosa bengala é sensível à luz. Armazenar no escuro até o uso e preparar fresco para melhores resultados.<ol><li>Preparar a rosa bengala diluindo-a em 5 mg/ml em solução salina estéril e filtrá-la através de um filtro de seringa de 0,2 μm.</li>
		<li>Prepare uma seringa de 1 ml equipada com uma agulha de 26 G com rosa bengala.</li>
	</ol></li>
	<li>Cetamina/xilazina<ol><li>Diluir cetamina e xilazina em solução salina estéril de acordo com as seguintes concentrações: cetamina (80-100 mg/kg) e xilazina (5-10 mg/kg).</li>
	</ol></li>
	<li>Carprofeno<ol><li>Diluir o carprofeno a 1 mg/ml em solução salina estéril.</li>
		<li>Prepare uma seringa de 1 ml equipada com uma agulha de 26 G com carprofeno.</li>
	</ol></li>
	<li>Solução salina estéril<ol><li>Prepare uma seringa de 5 ml equipada com uma agulha de 26 G com solução salina estéril.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Configuração do laser
<ol><li>Manuseie suavemente o cabo de fibra óptica e conecte-o à caixa de controle a laser e ao adaptador a laser do microscópio de imagem da retina.</li>
	<li>Ligue a caixa da lâmpada do microscópio de imagem da retina.</li>
	<li>Ligue o computador e abra o programa de criação de imagens.</li>
	<li>Ajuste o balanço de branco usando um pedaço de papel branco e colocando-o na frente do olho do mouse e clicando em Ajustar no programa de imagem.</li>
	<li>Ligue a caixa de controle a laser girando a tecla e seguindo as instruções na tela da caixa de controle a laser. NOTA: O laser utilizado nesta experiência é de Classe 3B e pode causar danos oculares. Use óculos de proteção ao operar o laser.</li>
	<li>Verifique a potência do laser de linha de base.<ol><li>Use um medidor de energia a laser.</li>
		<li>Ajuste a tela da caixa de controle a laser para os seguintes parâmetros: 50 mW e 2.000 ms.</li>
		<li>Ligue o laser e coloque o medidor de energia na frente da ocular. NOTA: Certifique-se de que a luz do microscópio está apagada durante o teste da potência do laser de linha de base.</li>
		<li>Pressione o pedal do pedal do pedal para ativar o laser.</li>
		<li>Apontar para a leitura de potência do laser para ser 13-15 mW. NOTA: A leitura de energia do laser determinará a taxa de sucesso para oclusões da veia da retina. Se a leitura da potência do laser for muito baixa, ajustes podem ser feitos na potência e no tempo de exposição ao laser. Consulte a Tabela 1 para obter recomendações.</li>
	</ol></li>
	<li>Ajuste a potência experimental do laser configurando a tela da caixa de controle do laser para os seguintes parâmetros: 100 mW, 1.000 ms.</li>
	<li>Desligue o laser. NOTA: Por segurança e para evitar o superaquecimento, é melhor manter o laser desligado entre os ratos.</li>
</ol>4. Injeção de veia da cauda do rato de rosa bengala
<ol><li>Despeje 300 mL de água em um copo de 500 mL.</li>
	<li>Aqueça o copo em um forno de micro-ondas por 1 min.</li>
	<li>Coloque gaze na água morna no copo.</li>
	<li>Coloque o mouse em uma contenção.</li>
	<li>Pressione a gaze na cauda do rato suavemente e procure as veias dilatadas. Desinfete o local de injeção usando um toalhete de álcool após a dilatação da água morna.</li>
	<li>Insira a agulha no local de injeção e puxe a seringa para garantir que está na veia. Em seguida, injete a veia da cauda do rato, administrando a quantidade correta de acordo com o peso do animal (37,5 mg/kg). Aplique pressão no local da injeção para evitar hematoma ou sangramento. Limpe o site.</li>
	<li>Solte o mouse da contenção e devolva-o à gaiola.</li>
	<li>Aguarde 8 minutos para que a rosa bengala circule antes da injeção de anestésicos. NOTA: Isso proporcionará um total de 10 minutos entre a injeção de rosa bengala e a irradiação a laser.</li>
</ol>5. Oclusão das veias maiores
<ol><li>Ligue a plataforma do mouse aquecida.</li>
	<li>Adicione uma gota de fenilefrina e tropicamida em cada olho.</li>
	<li>Injete 150 μL dos anestésicos, cetamina (80-100 mg/kg) e xilazina (5-10 mg/kg) IP. NOTA: Durante este procedimento, o rato recebeu duas injeções IP. Assim, os lados foram alternados. A injeção de IP para a anestesia foi administrada no quadrante abdominal inferior direito, e a solução salina foi injetada no quadrante abdominal inferior esquerdo. Recomenda-se puxar a seringa antes da injeção para garantir que a agulha esteja no abdômen e não em nenhum órgão.</li>
	<li>Aperte o animal para determinar a profundidade da anestesia e espere até que ele não responda.</li>
	<li>Adicione uma gota de cloridrato de proparacaína por olho (analgésico).</li>
	<li>Adicione pomada de gel a ambos os olhos.</li>
	<li>Injete 150 μL de carprofeno por via subcutânea entre as orelhas.</li>
	<li>Acomodem o mouse na plataforma.</li>
	<li>Ajuste a plataforma até que a visão do fundo retiniano esteja clara e focada.</li>
	<li>Conte as veias da retina e tire uma imagem do fundo. NOTA: As veias da retina são mais escuras e mais largas do que as artérias. Veias e artérias se alternam; no entanto, às vezes pode haver uma artéria ramificada perto do nervo óptico e, portanto, duas artérias adjacentes.</li>
	<li>Ligue o laser e aponte para uma veia da retina a aproximadamente 375 μm do disco óptico.</li>
	<li>Irradiar o recipiente pressionando o pedal e movendo ligeiramente o feixe de laser até 100 μm. Repita este passo três vezes e mova o feixe de laser após cada pulso para que a irradiação não seja focada em um ponto.</li>
	<li>Repita a irradiação em outros vasos principais para alcançar 2-3 oclusões.</li>
</ol>6. Estabelecimento do número de veias ocluídas no dia 0
<ol><li>Desligue a lâmpada depois de irradiar os recipientes e aguarde 10 min. NOTA: A exposição à luz pode causar danos na retina e inflamação; desligue a lâmpada durante o tempo de espera para minimizar a exposição7.</li>
	<li>Ligue a lâmpada novamente e conte o número de veias ocluídas.</li>
	<li>Tire uma imagem do fundo.</li>
</ol>7. Cuidados posteriores
<ol><li>Injete 1 mL de solução salina estéril IP. NOTA: Consulte os detalhes da injeção de IP na seção 5, etapa 3.</li>
	<li>Adicione colírios lubrificantes a ambos os olhos.</li>
	<li>Adicione pomada de gel a ambos os olhos.</li>
	<li>Observe o rato enquanto ele se recupera da anestesia e não o devolva à gaiola com os outros animais até que esteja totalmente recuperado. O carprofeno (5 mg/kg) pode ser administrado diariamente até 2 dias após o procedimento. Se aplicado a seres humanos, a dor não é um sintoma de RVO. NOTA: Não deixe os animais sozinhos até que eles se recuperem totalmente da anestesia.</li>
</ol>8. Avaliação do edema de retina por tomografia de coerência óptica (OCT)
NOTA: Esta etapa pode ser feita no ponto de interesse do investigador. O pico de edema da retina para um rato C57BL/6J é de 1 dia após o procedimento de RVO. Esse ponto de tempo pode variar dependendo do plano de fundo do mouse.
<ol><li>Ligue a caixa de luz do microscópio de imagem da retina, a máquina OCT e a plataforma aquecida do mouse.</li>
	<li>No dia seguinte à oclusão, siga os passos 5.2 a 5.7 para preparar o animal.</li>
	<li>Abra os programas de software de imagem e OCT.</li>
	<li>No programa OCT, ajuste o empurrão para 5.</li>
	<li>Tome OCT a 75 μm distal da queimadura ou 4 cliques.</li>
	<li>Tire imagens OCT em quatro quadrantes da retina.</li>
	<li>Analise as imagens da OCT usando o software de rastreamento.</li>
	<li>Compare a espessura da retina das medidas pré-irradiadas com 1 dia após o RVO ou no ponto de interesse do momento. NOTA: Ao analisar os dados, leve em consideração o número de veias irradiadas, pois isso pode influenciar o desenvolvimento de edema de retina. Os animais são então eutanasiados pela administração de anestésico seguido de cirurgia de perfusão sem sobrevida.</li>
</ol>

<ol><li>Song, P., Xu, Y., Zha, M., Zhang, Y., Rudan, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+epidemiology+of+retinal+vein+occlusion%3A+a+systematic+review+and+meta-analysis+of+prevalence%2C+incidence%2C+and+risk+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Global+Health%22%5BJournal%5D)">Global epidemiology of retinal vein occlusion: a systematic review and meta-analysis of prevalence, incidence, and risk factors.</a> Journal of Global Health. 9 (1), 010427(2019).</li>
<li>Ehlers, J. P., Fekrat, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+vein+occlusion%3A+beyond+the+acute+event%5BTitle%5D)+AND+%22Survey+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Retinal vein occlusion: beyond the acute event.</a> Survey of Ophthalmology. 56 (4), 281-299 (2011).</li>
<li>Iftikhar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+peak+vision+in+retinal+vein+occlusion+patients+treated+for+macular+edema%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Loss of peak vision in retinal vein occlusion patients treated for macular edema.</a> American Journal of Ophthalmology. 205, 17-26 (2019).</li>
<li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+new+mouse+model+of+branch+retinal+vein+occlusion+and+retinal+neovascularization%5BTitle%5D)+AND+%22Japanese+Journal+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Development of a new mouse model of branch retinal vein occlusion and retinal neovascularization.</a> Japanese Journal of Ophthalmology. 51 (4), 251-257 (2007).</li>
<li>Ebneter, A., Agca, C., Dysli, C., Zinkernagel, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+retinal+morphology+alterations+using+spectral+domain+optical+coherence+tomography+in+a+mouse+model+of+retinal+branch+and+central+retinal+vein+occlusion%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Investigation of retinal morphology alterations using spectral domain optical coherence tomography in a mouse model of retinal branch and central retinal vein occlusion.</a> PLoS One. 10 (3), 0119046(2015).</li>
<li>Fuma, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pharmacological+approach+in+newly+established+retinal+vein+occlusion+model%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A pharmacological approach in newly established retinal vein occlusion model.</a> Scientific Reports. 7, 43509(2017).</li>
<li>Zhang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+microglia+and+chemokines+in+light-induced+retinal+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Vision%22%5BJournal%5D)">Activation of microglia and chemokines in light-induced retinal degeneration.</a> Molecular Vision. 11, 887-895 (2005).</li>
<li>Avrutsky, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+activation+of+caspase-9+promotes+neurovascular+injury+in+retinal+vein+occlusion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Endothelial activation of caspase-9 promotes neurovascular injury in retinal vein occlusion.</a> Nature Communications. 11 (1), 3173(2020).</li>
<li>Nicholson, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostic+accuracy+of+disorganization+of+the+retinal+inner+layers+in+detecting+macular+capillary+non-perfusion+in+diabetic+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+%26+Experimental+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Diagnostic accuracy of disorganization of the retinal inner layers in detecting macular capillary non-perfusion in diabetic retinopathy.</a> Clinical & Experimental Ophthalmology. 43 (8), 735-741 (2015).</li>
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<li>Martin, G., Conrad, D., Cakir, B., Schlunck, G., Agostini, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+profiling+in+a+mouse+model+of+retinal+vein+occlusion+induced+by+laser+treatment+reveals+a+predominant+inflammatory+and+tissue+damage+response%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Gene expression profiling in a mouse model of retinal vein occlusion induced by laser treatment reveals a predominant inflammatory and tissue damage response.</a> PLoS One. 13 (3), 0191338(2018).</li>
<li>Drechsler, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+intravitreal+anti-vascular+endothelial+growth+factor+treatment+on+the+retinal+gene+expression+in+acute+experimental+central+retinal+vein+occlusion%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmic+Research%22%5BJournal%5D)">Effect of intravitreal anti-vascular endothelial growth factor treatment on the retinal gene expression in acute experimental central retinal vein occlusion.</a> Ophthalmic Research. 47 (3), 157-162 (2012).</li>
<li>Genevois, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microvascular+remodeling+after+occlusion-recanalization+of+a+branch+retinal+vein+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Microvascular remodeling after occlusion-recanalization of a branch retinal vein in rats.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (2), 594-600 (2004).</li>
<li>Khayat, M., Lois, N., Williams, M., Stitt, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+retinal+vein+occlusion%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Animal models of retinal vein occlusion.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 58 (14), 6175-6192 (2017).</li>
<li>Nguyen, V. P., Li, Y., Zhang, W., Wang, X., Paulus, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+multimodal+photoacoustic+microscopy+and+optical+coherence+tomography+image-guided+laser+induced+branch+retinal+vein+occlusion+in+living+rabbits%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">High-resolution multimodal photoacoustic microscopy and optical coherence tomography image-guided laser induced branch retinal vein occlusion in living rabbits.</a> Scientific Reports. 9 (1), 10560(2019).</li>
<li>Sayyed, S. A. A. R., Beedri, N. I., Kadam, V. S., Pathan, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rose+Bengal+sensitized+bilayered+photoanode+of+nano-crystalline+TiO2-CeO2+for+dye-sensitized+solar+cell+application%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Nanoscience%22%5BJournal%5D)">Rose Bengal sensitized bilayered photoanode of nano-crystalline TiO2-CeO2 for dye-sensitized solar cell application.</a> Applied Nanoscience. 6 (6), 875-881 (2015).</li>
<li>Emmart, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Observations+on+the+absorption+spectra+of+fluorescein%2C+fluorescein+derivatives+and+conjugates%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Biochemistry+and+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Observations on the absorption spectra of fluorescein, fluorescein derivatives and conjugates.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 73 (1), 1-8 (1958).</li>
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<li>LaVail, M. M., Gorrin, G. M., Repaci, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strain+differences+in+sensitivity+to+light-induced+photoreceptor+degeneration+in+albino+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Strain differences in sensitivity to light-induced photoreceptor degeneration in albino mice.</a> Current Eye Research. 6 (6), 825-834 (1987).</li>
<li>Jeffery, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+albino+retina%3A+an+abnormality+that+provides+insight+into+normal+retinal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">The albino retina: an abnormality that provides insight into normal retinal development.</a> Trends in Neurosciences. 20 (4), 165-169 (1997).</li>
<li>Kinnear, P. E., Jay, B., Witkop, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Albinism%5BTitle%5D)+AND+%22Survey+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Albinism.</a> Survey of Ophthalmology. 30 (2), 75-101 (1985).</li>
<li>Stahl, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postnatal+weight+gain+modifies+severity+and+functional+outcome+of+oxygen-induced+proliferative+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Postnatal weight gain modifies severity and functional outcome of oxygen-induced proliferative retinopathy.</a> American Journal of Pathology. 177 (6), 2715-2723 (2010).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

O modelo RVO de camundongo fornece um caminho para entender melhor a patologia do RVO e testar possíveis terapêuticas. Embora o modelo RVO do mouse seja amplamente utilizado no campo, há a necessidade de um protocolo detalhado atual do modelo que aborde sua variabilidade e descreva a otimização do modelo. Aqui, fornecemos um guia com exemplos da experiência sobre o que pode ser alterado para obter os resultados mais consistentes em uma coorte de animais experimentais e fornecer dados confiáveis.
<p class="jove_conten...

A oclusão da veia retiniana (RVO) é uma doença vascular comum da retina que afetou aproximadamente 28 milhões de pessoas em todo o mundo em 20151. RVO leva ao declínio da visão e perda em adultos em idade ativa e idosos, representando uma doença que ameaça a visão em curso estima-se que aumente ao longo da década próxima. Algumas das patologias distintas do RVO incluem lesão hipóxico-isquêmica, edema de retina, inflamação e perda neuronal2. Atualmente, a primeira linha de tratamento para este distúrbio é através da administração de inibidores do fator de crescimento endotelial vascular (VEGF). Embora o tratamento anti-VEGF tenha ajudado a melhorar o edema da retina, muitos pacientes ainda enfrentam declínio da visão3. Para entender melhor a fisiopatologia desta doença e testar possíveis novas linhas de tratamento, há a necessidade de constituir um protocolo de modelo de camundongo RVO funcional e detalhado para diferentes cepas de camundongos.
Modelos de camundongos foram desenvolvidos implementando o mesmo dispositivo a laser usado em pacientes humanos, emparelhado com um sistema de imagem dimensionado para o tamanho correto para um mouse. Este modelo de RVO em camundongo foi relatado pela primeira vez em 2007 4 e posteriormente estabelecido por Ebneter e outros 4,5. Eventualmente, o modelo foi otimizado por Fuma et al. para replicar as principais manifestações clínicas do RVO, como o edema de retina6. Desde que o modelo foi relatado pela primeira vez, muitos estudos o empregaram usando a administração de um corante fotossensibilizador seguido de fotocoagulação das principais veias da retina com um laser. No entanto, a quantidade e o tipo de corante que é administrado, a potência do laser e o tempo de exposição variam significativamente entre os estudos que usaram esse método. Essas diferenças muitas vezes podem levar ao aumento da variabilidade no modelo, dificultando a replicação. Até o momento, não há estudos publicados com detalhes específicos sobre possíveis caminhos para sua otimização.
Este relato apresenta uma metodologia detalhada do modelo de camundongo RVO na cepa C57BL/6J e uma cepa caspase-9 endotelial induzível por tamoxifeno (iEC Casp9KO) com fundo C57BL/6J e de relevância para a patologia RVO como cepa de referência para um camundongo geneticamente modificado. Estudo prévio havia demonstrado que a ativação não apoptótica da caspase-9 endotelial instiga edema retiniano e promove morte neuronal8. A experiência usando essa cepa ajudou a determinar e fornecer informações sobre possíveis modificações para adaptar o modelo de camundongo RVO, que pode ser aplicável a outras cepas geneticamente modificadas.

<table><tbody><tr><td>Carprofeno</td><td>Rimadyl</td><td>NADA #141-199</td><td>mantenha em 4 &deg; C</td></tr><tr><td>Óleo de Milho</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8267</td><td></td></tr><tr><td>Cabo de Fibra</td><td>Thor Labs</td><td>M14L02</td><td></td></tr><tr><td>GenTeal</td><td>Alcon</td><td>00658 06401</td><td></td></tr><tr><td>Cloridrato de Cetamina</td><td>Henry Schein</td><td>NDC: 11695-0702-1</td><td></td></tr><tr><td>Lasercheck</td><td></td><td>Coherent 1098293</td><td></td></tr><tr><td>Phenylephrine</td><td>Akorn</td><td>NDCL174478-201-15</td><td></td></tr><tr><td>Phoneix Micron IV com Meridiano,&nbsp; Módulos StreamPix e OCT</td><td>Phoenix Technology Group</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cloridrato de Proparacaína</td><td>Akorn</td><td>NDC: 17478-263-12</td><td>manter em 4 &deg; C</td></tr><tr><td>Refresh</td><td>Allergan</td><td>94170</td><td></td></tr><tr><td>Rose Bengal</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>330000-5G</td><td></td></tr><tr><td>Tamoxifeno</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5648-5G</td><td>sensível à luz</td></tr><tr><td>Tropicamida</td><td>Akorn</td><td>NDC: 174478-102-12</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Akorn</td><td>NDCL 59399-110-20</td><td></td></tr></tbody></table>

otimização do modelo de oclusão de veia da retina em camundongo para limitar a variabilidade

Optimization of the Retinal Vein Occlusion Mouse Model to Limit Variability

Modelos de camundongos de oclusão da veia retiniana (RVO) são frequentemente usados em oftalmologia para estudar a lesão hipóxico-isquêmica na retina neural. Neste relatório, um método detalhado que aponta etapas críticas é fornecido com recomendações para otimização para alcançar taxas de oclusão consistentemente bem-sucedidas em diferentes cepas de camundongos geneticamente modificados. O modelo de camundongo RVO consiste principalmente na administração intravenosa de um corante fotossensibilizador seguido de fotocoagulação a laser usando um microscópio de imagem da retina ligado a um laser guiado oftálmico. Três variáveis foram identificadas como determinantes da consistência da oclusão. Ajustando o tempo de espera após a administração de rosa bengala e equilibrando a linha de base e a saída experimental do laser, a variabilidade entre os experimentos pode ser limitada e uma maior taxa de sucesso das oclusões alcançada. Este método pode ser usado para estudar doenças da retina que são caracterizadas por edema de retina e lesão hipóxico-isquêmica. Além disso, como esse modelo induz lesão vascular, ele também pode ser aplicado para estudar a neurovasculatura, a morte neuronal e a inflamação.

O modelo de camundongo RVO visa alcançar com sucesso oclusões nas veias da retina, levando a lesão hipóxico-isquêmica, quebra da barreira hemato-retiniana, morte neuronal e edema de retina8. A Figura 1 mostra uma linha do tempo de etapas para garantir a reprodutibilidade, um esquema do desenho experimental e descreve as etapas que podem ser otimizadas dependendo das questões experimentais. As três etapas principais que podem ser modificadas são o tempo de espera após ...

Aqui, descrevemos um protocolo otimizado para oclusão da veia retiniana usando rosa bengala e um sistema de microscópio de imagem retiniana guiado a laser com recomendações para maximizar sua reprodutibilidade em cepas geneticamente modificadas.

Otimização do Modelo de Oclusão de Veia da Retina em Camundongo para Limitar a Variabilidade

Mouse models of retinal vein occlusion (RVO) are often used in ophthalmology to study hypoxic-ischemic injury in the neural retina. In this report, a ...

O protocolo fornece um modelo para investigar mecanismos de lesão vascular e subsequente desenvolvimento de edema de forma não invasiva. A principal vantagem desta técnica é que você pode acompanhar a lesão ao vivo ao longo do tempo sem intervenção cirúrgica. Isso fornece caminhos para testar tratamentos de forma mais eficiente.Pode ser um desafio aprender a realizar o veio adequado da cauda e acomodar o animal na plataforma corretamente. Para ambas as técnicas, recomendo ser paciente e levar as coisas devagar. Para começar, manuseie suavemente o cabo de fibra óptica e conecte-o à caixa de controle do laser e ao adaptador a laser do microscópio de imagem da retina e, em seguida, ligue a caixa da lâmpada do microscópio de imagem da retina.Ligue o computador e abra o programa de criação de imagens. Coloque um pedaço de papel branco na frente da ocular do microscópio e ajuste o balanço de branco clicando em Ajustar no programa de imagem. Ligue a caixa de controle a laser girando a tecla e seguindo as instruções na tela da caixa de controle a laser.Para verificar a potência do laser de linha de base, defina a caixa de controle do laser para 50 miliwatts e 2.000 milissegundos. Em seguida, ligue o laser e coloque o medidor de energia na frente da ocular. Pressione o pedal do pedal do pedal para ativar o laser, visando que a leitura de energia do laser seja de 13 a 15 miliwatts.Em seguida, usando a tela da caixa de controle do laser, ajuste a potência experimental do laser para 100 miliwatts e 1.000 milissegundos e desligue o laser. Despeje 300 mililitros de água em um copo de 500 mililitros e aqueça o copo em um forno de micro-ondas por um minuto. Em seguida, coloque uma gaze na água morna.Em seguida, coloque um rato macho de dois meses de idade em uma contenção. Pressione a gaze quente na cauda do rato suavemente e procure as veias dilatadas. Usando uma agulha de calibre 26, injete a quantidade apropriada de rosa bengala de acordo com o peso do animal e aplique pressão no local da injeção para evitar hematoma ou sangramento antes de limpar o local.Em seguida, solte o mouse da contenção e devolva-o à gaiola. Aguarde oito minutos para que a rosa bengala circule antes da injeção de anestésicos. Ligue a plataforma do mouse aquecida.Em seguida, adicione uma gota de fenilefrina e tropicamida em cada olho do rato. Depois de confirmar a anestesia, adicione uma gota de cloridrato de proparacaína por olho e, em seguida, adicione pomada ocular a ambos os olhos. Em seguida, injete 150 microlitros de carprofeno por via subcutânea entre as orelhas.Em seguida, acomode o mouse na plataforma e ajuste a plataforma até que a visão do fundo da retina esteja clara e focada. Conte as veias da retina e tire uma imagem do fundo. Em seguida, ligue o laser e aponte para uma veia da retina a aproximadamente 375 micrômetros do disco óptico.Irradie o vaso pressionando o interruptor do pé e movendo levemente o feixe de laser até 100 micrômetros. Repita este passo três vezes e mova o feixe de laser após cada pulso para que a irradiação não seja focada em um ponto. Repita a irradiação em outros vasos principais para obter duas a três oclusões.Depois de irradiar os vasos, desligue a lâmpada e aguarde 10 minutos. Em seguida, ligue a lâmpada novamente, conte o número de veias ocluídas e tire uma imagem do fundo. Após a aquisição da imagem e injeção salina, adicione colírios lubrificantes e pomada de gel a ambos os olhos.Observe o rato enquanto ele se recupera da anestesia e devolva-o à gaiola com outros animais somente quando totalmente recuperado. O número de oclusões obtidas imediatamente após a irradiação a laser não foi diferente entre os animais que foram laserizados 10 e 20 minutos após a administração de rosa bengala. O número de oclusões sustentadas até um dia após a oclusão da veia retiniana diminuiu significativamente em animais laserizados 20 minutos após a administração de rosa bengala, independentemente do genótipo.Sem modificar a potência experimental de 100 miliwatts, uma baixa potência de laser de linha de base de 11,5 miliwatts resultou em nenhuma oclusão. Em contraste, uma saída de laser basal de 13,5 miliwatts resultou em oclusões bem-sucedidas. Quatro tipos principais de oclusões ocorrem após a fotocoagulação a laser: vasos totalmente ocluídos, vasos parcialmente ocluídos, vasos parcialmente reperfundidos e vasos totalmente reperfundidos.A vasculatura irradiada de camundongos knockout de células endoteliais Casp9 induzíveis por tamoxifeno passou mais tempo em estados parcialmente reperfundidos e parcialmente ocluídos do que a de camundongos C57 Black 6, que passaram mais tempo em estados totalmente ocluídos. O estado de oclusão dos vasos muda rapidamente nos primeiros 10 minutos após a fotocoagulação a laser e hemorragias em forma de chama são observadas 24 horas após a lesão. Diferentes patologias oftálmicas ocorreram após a oclusão da veia retiniana.O nível de edema da retina após a oclusão da veia retiniana pode ser quantificado nos olhos lesados usando imagens de tomografia de coerência óptica. O estado das camadas neuronais também pode ser determinado avaliando a desorganização das camadas internas da retina. Um exemplo de uma imagem de tomografia de coerência óptica com os rótulos correspondentes para cada camada é mostrado aqui.Medir a potência do laser de linha de base é importante. Essa leitura afetará muito o sucesso das oclusões e poderá ser otimizada. Métodos adicionais, como OCT, ERG e Optiger, podem ser realizados.Isso ajudará a abordar os efeitos da lesão neurovascular na integridade neuronal da retina e na função da via visual. Esta técnica abre o caminho para interrogar as vias moleculares que conduzem a doença neurovascular e, ao seguir animais individuais ao longo do tempo, fornece dados que podem ser mais facilmente traduzidos para doenças humanas.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

A retina de roedores tem sido reconhecida como uma janela de acesso para o cérebro. Neste documento técnico que proporcionam um protocolo que utiliza o modelo de ratinho de retinopatia induzida por oxigénio para estudar os mecanismos que levam à insuficiência de regeneração vascular dentro do sistema nervoso central após a lesão isquémica. O sistema descrito também pode ser aproveitada para explorar estratégias para promover o crescimento de vasos sanguíneos funcionais dentro da retina e do...

Assessment of Vascular regeneração no SNC Usando o rato Retina

Aqui, apresentamos o protocolo de neovascularização coroidal induzida por laser de camundongo (CNV), um modelo experimental que recria as características vasculares da degeneração macular relacionada à idade neovascular (DMRI). Uma vez dominado, ele pode induzir a CNV de forma confiável e eficaz como um sistema modelo para testar várias medidas experimentais.

Um modelo de rato para induzida por laser coróide Neovascularização

Aqui vamos demonstrar uma nova abordagem para usando a tomografia de coerência óptica espectral-domínio de alta resolução (HR-SD-OCT) para auxiliar entrega de agentes de terapia do gene para o espaço subretinal, avaliar sua cobertura areal e caracterizar vitalidade fotoreceptor.

Tomografia de coerência óptica Mouse ultra alta resolução para auxiliar a injeção intra-ocular em pesquisa de terapia de genes da retina

Aqui, apresentamos a utilidade da imagem longitudinal na vivo na sequência de alterações morfológicas da neovascularização de coroide do laser-induzida em camundongos.

Na Vivo Imagiologia multimodal e análise do modelo de neovascularização coroide de induzida por Laser de Mouse

A retinopatia induzida pelo oxigênio (OIR) pode ser usada para modelar doenças isquêmicas da retina, como a retinopatia da prematuridade e a retinopatia diabética proliferativa e servir de modelo para estudos de prova de conceito na avaliação de drogas antiangiogênicas para doenças neovasculares. O OIR induz a neovascularização robusta e reprodutível na retina que pode ser quantificada.

Modelo de Retinopatia Induzida por Oxigênio para Doenças Isquêmicas da Retina em Roedores

Este protocolo descreve um método detalhado para a preparação e a coloração da imunofluorescência de montagem e análise plana de retina de camundongos. O uso de fluoresceína fundus angiography (FFA) para filhotes de camundongos e processamento de imagem também são descritos em detalhes.

Monitoramento do crescimento dinâmico dos vasos retinais no modelo de rato de retinopatia induzido pelo oxigênio

Este artigo descreve um ensaio bem estabelecido e reprodutível de manchas de lectina para toda a preparação da retina do montagem e os protocolos necessários para a medição quantitativa dos parâmetros vasculares frequentemente alterados em retinopatias proliferativas e não proliferativas.

Quantificação de Parâmetros Vasculares em Retinas inteiras de Camundongos com Retinopatias Não Proliferativas e Proliferativas

Aqui, descrevemos uma técnica de imagem in vivo usando tomografia de coerência óptica para facilitar o diagnóstico e a medição quantitativa da retinopatia em camundongos.

Aplicação da Tomografia de Coerência Óptica a um Modelo de Retinopatia de Rato

Aqui, apresentamos três protocolos de análise de dados para angiografia fluoresceína (AF) e tomografia de coerência óptica (OCT) no estudo da Oclusão da Veia Retiniana (RVO).

In vivo Leituras de lesões vasculares na retina de camundongos para promover a reprodutibilidade

As injeções sub-retinianas são uma técnica indispensável para o desenvolvimento pré-clínico de terapêuticas para doenças fotorreceptoras e EPR. Descrevemos uma técnica de injeção sub-retiniana transescleral otimizada em camundongos que melhora as taxas de sucesso intraoperatório e minimiza os danos à retina.

Técnica de injeção sub-retiniana transescleral minimamente invasiva otimizada em camundongo

Aprenda a otimizar o modelo de oclusão de veia da retina em camundongos usando rosa bengala e laser. Este método permite investigar lesões vasculares e edema de forma não invasiva, facilitando testes de tratamentos eficientes.

Otimização do Modelo de Oclusão de Veia da Retina em Camundongo para Limitar a Variabilidade

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