Name: Micropatterning Transmissão Electron Microscopy Grids para Posicionamento Direto celular dentro de fluxos de trabalho de tomografia crio-elétron inteira (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 53 s
Description: Aprenda a micropadronar grades de microscopia eletrônica para direcionar o crescimento celular em experimentos de tomografia criogênica. Este protocolo reprodutível utiliza matriz extracelular e aumenta a eficiência da criomicroscopia eletrônica.

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Agradecemos ao Dr. Jill Wildonger, Dr. Sihui Z. Yang e Sra. Josephine W. Mitchell no Departamento de Bioquímica da Universidade de Wisconsin, Madison por compartilhar generosamente a cepa de mosca elav-Gal4, UAS-CD8::GFP (Bloomington stock center, #5146). Também gostaríamos de agradecer ao Dr. Aurélien Duboin, Ao Sr. Laurent Siquier e à Sra. Marie-Charlotte Manus de Alvéole e ao Sr. Serge Kaddoura da Nanoscale Labs pelo seu generoso apoio durante este projeto. Este trabalho foi apoiado em parte pela Universidade de Wisconsin, Madison, o Departamento de Bioquímica da Universidade de Wisconsin, Madison, e o serviço público de saúde concede R01 GM114561, R01 GM104540, R01 GM104540-03W1 e U24 GM139168 a E.R.W. e R01 AI150475 a P.W.S. do NIH. Parte desta pesquisa foi apoiada pela bolsa NIH U24 GM129547 e realizada na PNCC da OHSU e acessada através da EMSL (grid.436923.9), um DoE Office of Science User Facility patrocinado pelo Escritório de Pesquisa Biológica e Ambiental. Também somos gratos pelo uso de instalações e instrumentação no Cryo-EM Research Center no Departamento de Bioquímica da Universidade de Wisconsin, Madison.

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<li>Lu, W., Lakonishok, M., Gelfand, V. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinesin-1-powered+microtubule+sliding+initiates+axonal+regeneration+in+Drosophila+cultured+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Kinesin-1-powered microtubule sliding initiates axonal regeneration in Drosophila cultured neurons.</a> Molecular Biology of the Cell. 26 (7), 1296-1307 (2015).</li>
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Os autores não têm nada a revelar.

Microscópios eletrônicos modernos e avançados e pacotes de software agora suportam a coleta automatizada de dados crio-EM e crio-ET, onde centenas a milhares de posições podem ser direcionadas e imagens dentro de alguns dias32,33,34,35. Um fator limitante significativo para fluxos de trabalho crio-ET de células inteiras tem obtido um número suficiente de metas colecionáveis por rede. Recentemente, vários grupos desenvolveram protocolos para redes de micropatterning para crio-EM, com uma vantagem sendo a eficiência da coleta de dados 16,17,18. Aqui, um protocolo é apresentado para o uso de um sistema de micropatterning comercialmente disponível para micropattern redes TEM para estudos crio-ET de neurônios primários de Drosophila e linhas de células humanas cultivadas (não infectadas ou infectadas pelo RSV). Este sistema de micropatterning é versátil e muitos passos podem ser otimizados e adaptados para atender a objetivos experimentais específicos. Um usuário com experiência em microscopia de tem e fluorescência pode rapidamente se tornar qualificado na preparação da grade e micropatterning. Com uma prática cuidadosa, bons resultados devem ser alcançáveis após algumas iterações. Abaixo, algumas das opções disponíveis, considerações do usuário, benefícios potenciais e aplicações futuras de micropatterning para crio-EM são discutidas.
Uma das considerações importantes para o crio-ET de células inteiras é a seleção da grade EM. As grades EM são compostas de duas partes: uma estrutura de malha (ou suporte estrutural) e a folha (ou filme), que é a superfície de filme contínua ou furada na qual as células crescerão. As grades de malha de cobre são comumente usadas para crio-EM de proteínas e complexos isolados. No entanto, eles são inadequados para crio-ET de células inteiras devido à citotoxicidade do cobre. Em vez disso, uma malha de ouro é comumente usada para tomografia celular. Outras opções incluem níquel ou titânio, que pode proporcionar benefícios sobre o ouro, como o aumento da rigidez16. As grades EM estão disponíveis com diferentes dimensões de malha para suportar uma variedade de aplicativos. Tamanhos de malha maiores fornecem mais espaço para as células crescerem entre barras de grade e mais áreas que são favoráveis à coleta de séries de inclinação, embora ao custo do aumento da fragilidade geral dos espécimes. A folha mais usada é carbono amorfo perfurado ou furado, como quantifoils ou grades C-flat. Alvos biológicos podem ser imagens através dos buracos no carbono ou através do carbono translúcido de elétrons. Grades como R 2/1 ou R 2/2, onde os orifícios têm 2 μm de largura que são espaçados 1 e 2 μm de distância, respectivamente, fornecem um grande número de buracos e, portanto, um grande número de áreas potenciais para coleta de dados. No entanto, algumas células podem crescer e expandir melhor em superfícies mais uniformes, como redes R 1,2/20 ou carbono contínuo. Para o processamento da amostra a jusante por moagem de feixe de íons focados (crio-FIB), a folha é removida através da fresagem, reduzindo as preocupações sobre a presença contínua do filme subjacente. Assim como na malha, também estão disponíveis folhas de outros materiais, com o protocolo de padronização aqui apresentado sendo igualmente adequado para grades SiO2 . As grades comumente usadas incluem quantifoil de ouro, carbono contínuo ou grades de 200 malhas de filme SiO2 (~90 μm espaçamento entre grades) para crio-ET de células inteiras.
Há uma série de considerações ao projetar um padrão. A maioria dessas decisões são guiadas pelo tipo celular e propósito do experimento. Um bom ponto de partida é escolher um padrão que se aproxime da forma e dimensões das células na cultura. Muitos estudos demonstraram efeitos significativos da forma padrão no crescimento celular e arranjo citoesquelético13,36,37. Deve-se tomar cuidado especial durante o projeto de padrão se isso pode alterar o alvo de interesse. Vários padrões para cada tipo de célula foram testados para determinar quais padrões promoveram a adesão e o crescimento celular. A flexibilidade do sistema de micropatterning permite o teste de vários padrões em uma única grade e a mudança de padrões para diferentes grades dentro de um único experimento. Padrões maiores (~50-90 μm), como os usados aqui, aumentam a probabilidade de que várias células aderam a uma única região do padrão e permitem que as células se expandam e se estendam após a adesão. Padrões mais restritos (20-30 μm) podem ser apropriados em experimentos onde o isolamento celular é mais crítico do que a expansão celular, como para experimentos de moagem de feixe de íons focados (crio-FIB). Para aplicações de tomografia, pode-se precisar considerar o impacto do eixo de inclinação. Se um padrão for posicionado de tal forma que todas as células cresçam paralelamente umas às outras em uma única direção, é possível que todas as células sejam perpendiculares ao eixo de inclinação quando carregadas no estágio do microscópio, resultando em uma menor qualidade de dados.
Em grades não respingadas, as células geralmente aderem preferencialmente às barras de grade, onde não podem ser imagens pelo TEM. Mesmo em grades padronizadas, as células são frequentemente observadas para serem posicionadas nos cantos dos quadrados de grade parcialmente tanto na folha de carbono padronizada quanto na barra de grade. Recentemente, o micropatterning foi usado para posicionar intencionalmente parte da célula sobre a barra de grade18. Isso pode ser considerado para experimentos onde não é crítico ter toda a periferia celular na folha. Isso pode ser especialmente importante para células que podem crescer maiores que um único quadrado de grade, como neurônios primários crescendo ao longo de vários dias.
Existem muitas ferramentas que podem ser usadas para projetar um padrão. Aqui, o padrão foi limitado a menos de 800 pixels em qualquer dimensão, de modo que o padrão pode ser girado para qualquer ângulo e ainda se encaixar dentro da área máxima que pode padronizar em uma única projeção por este sistema de micropatterning. Isso permite que o usuário gire o padrão para ser devidamente orientado com a grade, independentemente da orientação da grade no microscópio. Aqui, a grade foi dividida em seis áreas de padronização. Em primeiro parte, isso permite o ajuste de foco entre diferentes regiões da rede. As grades de ouro, em particular, são muito maleáveis e podem não se deitar completamente planas no vidro. O foco adequado é essencial para resultados de padronagem limpos e refinados. Ao utilizar padrões segmentados, apenas pequenos ajustes na posição padrão precisam ser feitos se a grade mudar ligeiramente durante o processo de padronização, embora isso geralmente não seja um problema ao usar o gel PLPP com os estêncil PDMS. Finalmente, as quatro praças centrais da grade permaneceram sem ser respingadas. Isso suporta que um usuário seja capaz de identificar claramente o centro da rede, o que é muito útil para experimentos de imagem correlativa.
O software de padronização para este sistema de micropatterning, Leonardo, também tem características mais avançadas, como costura e a capacidade de importar padrões como PDFs, que estão além do escopo deste protocolo. Este software também inclui detecção de microestruturas e posicionamento automatizado de padrões que podem ser usados em grades TEM. Este recurso é mais útil quando a grade é muito plana e pode ser padronizada sem a necessidade de ajustar o foco entre diferentes áreas.
A seleção de uma proteína ECM pode ter um impacto significativo na adesão e expansão celular. Algumas células são conhecidas por sofrer alterações fisiológicas quando cultivadas em substratos específicos38. Várias proteínas e concentrações de ECM foram testadas para qualquer novo tipo de célula com base em trabalhos anteriores relatados na literatura. Laminina, fibrinogênio, fibronectina e colágeno são amplamente utilizados para células cultivadas e podem ser usados como ponto de partida se outros dados não estiverem disponíveis. No entanto, outras proteínas ECM também devem ser consideradas se as proteínas ECM comumente utilizadas não conferem propriedades adequadas de adesão para as células. Isso foi particularmente verdadeiro para os neurônios primários de Drosophila , uma vez que a alta concentração da lectina vegetal concanavalina A era necessária para a adequada adesão celular. A compatibilidade da adesão celular e o crescimento com o ECM podem ser testados por padronização em pratos de vidro ou slides antes da transição para grades TEM. Essa abordagem de pré-triagem é tempo e custo-benefício se um grande número de combinações precisar ser examinada. A inclusão de uma proteína ECM conjugada fluorescente é valiosa para avaliar o sucesso e a qualidade da padronização.
A semeadura celular é um dos passos mais importantes para crio-ET celular inteiro, com ou sem micropatterning6,16,39. Para drosophila primária ou outros neurônios, que são frágeis, instáveis em suspensão, e podem ser limitados em quantidade, abordagens únicas de semeadura são preferidas em vez de sequenciais e monitoradas. Um único passo de semeadura em uma densidade celular otimizada, como descrito no protocolo para neurônios Drosophila, é uma opção viável para a maioria dos tipos de células. No entanto, também é possível semear células no substrato em uma concentração inicial mais baixa e adicionar mais células de forma monitorada como descrito aqui e em outras literaturas18. Esta sequencial sequencial pode proporcionar resultados mais consistentes em alguns casos. Semelhante à cultura celular padrão, deve-se sempre ter cuidado para manter a viabilidade celular e minimizar a aglomeração celular durante o isolamento.
Quando começam com a micropattering, existem algumas armadilhas potenciais que são prejudiciais para o resultado final. O manuseio cuidadoso da grade e a técnica estéril, a distribuição uniforme do gel PLPP, a dose adequada e o foco durante a padronização e a manutenção da viabilidade celular antes da semeadura estão entre as considerações mais importantes para o sucesso. Uma lista de alguns dos problemas potenciais, bem como soluções foram montadas na Tabela 1.
Redes micropatriadas podem ser usadas para ajudar a posicionar as células para estabelecer uma densidade celular consistente em toda a rede e para posicionar regiões de interesse em áreas adequadas para a coleta de séries de inclinação16,18. A colocação e o posicionamento das células podem ser usados como marcadores fiduciais para correlação em experimentos crio-CLEM, reduzindo a necessidade de frágeis grades de localizador e marcadores fiduciais fluorescentes. No entanto, deve-se notar que tais marcadores fiduciários ainda podem ser úteis para a correlação de precisão de subdultímetro29,40. Além disso, uma distribuição uniforme de células isoladas também é altamente benéfica para experimentos de moagem de feixe de íons focados (crio-FIB) para maximizar o número de células das quais a lamella pode ser cortada16.
A adição de micropatterning aos fluxos de trabalho crio-EM resultará em melhorias mensuráveis no throughput de dados e potencialmente permitirá novos experimentos. À medida que a técnica é ainda mais adotada e desenvolvida, aplicações mais avançadas de micropatterning, incluindo gradientes de ECM, deposições múltiplas de ECM e montagem de microestruturas expandirão ainda mais as capacidades do crio-ET para estudar metas e processos biológicos em pleno contexto celular.

Com o desenvolvimento, expansão e versatilidade da microscopia crio-elétron (crio-EM), pesquisadores examinaram uma ampla gama de amostras biológicas em um estado quase nativo, de resolução macromolecular (~1 nm) a alta (~2 Å). As técnicas de crio-EM de partículas únicas e difração eletrônica são melhor aplicadas a macromoléculas purificadas em solução ou em estado cristalino, respectivamente 1,2. Considerando que a tomografia crio-elétron (crio-ET) é exclusivamente adequada para estudos estruturais e ultraestruturais quase nativos de objetos grandes e heterologos, como bactérias, vírus pleomórficos e células eucarióticas3. No crio-ET, as informações tridimensionais (3D) são obtidas inclinando fisicamente a amostra no estágio do microscópio e adquirindo uma série de imagens através da amostra em diferentes ângulos. Essas imagens, ou séries de inclinação, geralmente cobrem uma faixa de +60/-60 graus em incrementos de um a três graus. A série de inclinação pode então ser reconstruída computacionalmente em um volume 3D, também conhecido como tomograma4.
Todas as técnicas crio-EM requerem que a amostra seja incorporada em uma fina camada de gelo amorfo, não cristalino e vítreo. Uma das técnicas de criopensa mais utilizadas é o congelamento de mergulho, onde a amostra é aplicada à grade EM, borrada e rapidamente mergulhada em etano líquido ou uma mistura de etano líquido e propano. Esta técnica é suficiente para a vitrificação de amostras de <100 nm a ~10 μm de espessura, incluindo células humanas cultivadas, como células HeLa5,6. Amostras mais grossas, como mini-organóides ou biópsias teciduais, até 200 μm de espessura, podem ser vitrificadas por congelamento de alta pressão7. No entanto, devido ao aumento da dispersão de elétrons de amostras mais espessas, a amostra e a espessura do gelo para crio-ET é limitada a ~0,5 - 1 μm em microscópios eletrônicos de transmissão de 300 kV. Portanto, crio-ET de células inteiras de muitas células eucarióticas está limitado à periferia celular ou extensões de células, a menos que sejam usadas etapas adicionais de preparação de amostras, como crio-seccionamento8 ou moagem de feixe de íons focais9,10,11.
Uma limitação de muitos experimentos de imagem crio-ET de células inteiras é a coleta de dados através de 12. Ao contrário do crio-EM de partículas únicas, onde milhares de partículas isoladas podem muitas vezes ser imagens de um único quadrado de grade TEM, as células são grandes, espalhadas, e devem ser cultivadas em baixa densidade suficiente para permitir que as células sejam preservadas em uma fina camada de gelo vítreo. Muitas vezes a região de interesse é limitada a uma característica particular ou subárea da célula. Limitando ainda mais o throughput é a propensão de as células crescerem em áreas que não são favoráveis à imagem TEM, como em ou perto de barras de grade TEM. Devido a fatores imprevisíveis associados à cultura celular nas redes TEM, os desenvolvimentos tecnológicos são necessários para melhorar a acessibilidade e o throughput da amostra para aquisição de dados.
Micropatterning substrato com proteínas de matriz extracelular (ECM) é uma técnica bem estabelecida para microscopia de luz de células vivas para direcionar o crescimento de células em superfícies rígidas, duráveis e opticamente transparentes, como vidro e outras culturas teciduais substratos13,14. A micropatters também foi realizada em superfícies macias e/ou tridimensionais (3D). Tais técnicas não só permitiram o posicionamento preciso das células; eles também apoiaram a criação de redes multicelulares, como circuitos de células neurais padronizadas15. Trazer micropatterning para crio-ET não só aumentará o rendimento, mas também pode abrir novos estudos para explorar microambientes celulares complexos e dinâmicos.
Recentemente, vários grupos começaram a usar técnicas de micropattering em grades TEM através de múltiplas abordagens16,17. Aqui, o uso de uma técnica de fotopatterning sem máscara para grades TEM é descrito usando o sistema de micropatterning Alvéole PRIMO, que possui padronização de alta resolução e sem contato. Com este sistema de micropatterning, uma camada anti-incrustação é aplicada na parte superior do substrato, seguida pela aplicação de um fotocatalyst e ablação da camada anti-incrustação em padrões definidos pelo usuário com um laser UV. As proteínas ECM podem então ser adicionadas aos padrões para a cultura celular apropriada. Este método tem sido usado por vários grupos para estudos crio-ET de pigmento retiniano epitelial-1 (RPE1), Madin-Darby canino kidney-II (MDCKII), fibroblast de prepúcio humano (HFF) e linhas celulares endoteliais16,17,18. Este sistema de micropatterning é compatível com vários substratos de camada anti-incrustar, bem como um reagente de fotocatalyst líquido ou gel. Uma variedade de proteínas ECM pode ser selecionada e adaptada para a especificidade da linha celular, conferindo versatilidade para o usuário.
A micropattersão foi aplicada com sucesso a uma série de projetos dentro do laboratório19. Aqui, é apresentado um protocolo de micropatterning, incluindo adaptações específicas para estudar células HeLa cultivadas, células BEAS-2B infectadas pelo vírus sincicial respiratório (RSV) e neurônios mamóquios 20 larval primários.

<table><tbody><tr><td>0,1% (p/v) Poli-L-Lisina</td><td>Sigma</td><td>P8920-100ML</td><td></td></tr><tr><td>0,22 &micro; m filtros de seringa membrana PVDF</td><td>Genesee</td><td>25-240</td><td></td></tr><tr><td>22x60-1 lamínula de cobertura de vidro</td><td>Fisher</td><td>12545F</td><td></td></tr><tr><td>5/15 Pinças</td><td>EMS (Dumont)</td><td>0203-5/15-PO</td><td></td></tr><tr><td>Antibiótico-Antimicótico (100X)</td><td>ThermoFisher (Gibco)</td><td>15240096</td><td></td></tr><tr><td>Células BEAS-2B</td><td>ATCC</td><td>CRL-9609</td><td></td></tr><tr><td>Colágeno I, bovino</td><td>ThermoFisher ( Gibco)</td><td>A1064401</td><td></td></tr><tr><td>Concanavalina A, Alexa Fluor 350 Conjugado</td><td>ThermoFisher (Invitrogen)</td><td>C11254</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Fisher (Lonza)</td><td>BW12-604F</td><td></td></tr><tr><td>EtOH</td><td>Fisher (Decon Labs)</td><td>22-032-600</td><td></td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino</td><td>ATCC</td><td>30-2020</td><td></td></tr><tr><td>Fibrinogênio de Plasma Humano, Alexa Fluor 647 Conjugado</td><td>ThermoFisher ( Invitrogen)</td> <td>F35200</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectina Proteína Bovina, Plasma</td><td>ThermoFisher (Gibco)</td> <td>33010018</td><td></td></tr><tr><td>Prato de fundo de vidro</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-20-C</td><td></td></tr><tr><td>Glicose</td><td>VWR</td><td>0643-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Suporte de preparação de grade</td><td>EMS</td><td>71175-01</td><td></td></tr><tr><td>Células HeLa</td><td>ATCC</td><td>CCL-2</td><td></td></tr><tr><td>Hemacitômetro</td><td>Fisher (SKC, Inc.)</td><td></td><td></td>22600100</tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher (ACROS Organics)</td><td>AC172572500</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>ThermoFisher (Invitrogen)</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Fisher (Sigma Aldrich)</td><td>NC0520015</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>MP Bio</td><td>194844</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Fisher (ACROS Organics)</td><td>AC212595000</td><td></td></tr><tr><td>Leica-DMi8</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td>Pode ser personalizado com câmera, palco e acessórios de objetiva</td></tr><tr><td>Leonardo</td><td>Alv&eacute; ole</td><td></td><td>https://www.alveolelab.com/our-products/leonardo-photopatterning-software/</td></tr> <tr><td>Liberase Research Grade</td><td>Fisher (Soluções de Fornecimento)</td><td>50-100-3280</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Kit de Viabilidade/Citotoxicidade</td><td>ThermoFisher (Invitrogen)</td><td>L3224</td><td></td></tr><tr><td>Câmera de microscópio</td><td>Hammamatsu</td><td>C13440-20CU</td><td></td></tr><tr><td>Estágio motorizado</td><td>M&auml; rzh&auml; usuário Wetzlar</td><td>00-24-599-0000</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher (Fisher BioReagents)</td> <td>BP358-1</td><td></td></tr><tr><td>NaH 2 PO 4 </td> <td>Fisher (ACROS Organics)</td> <td>AC207802500</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Fisher (Alfa Aesar)</td> <td>AAA1603736</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>PDMS stencils</td><td>nanoscaleLABS</td><td>PDMS_STENCILS_EM</td><td>https://www.alveolelab.com/our-products/pdms-stencil-multiwell-plate/</td></tr> <tr><td>PEG-SVA</td><td>nanoscaleLABS</td><td>PEG-SVA-1GR</td><td>mPEG-Succinimidil Valerato, MW 5.000</td></tr><tr><td>Penicilina</td><td>Fisher (Research Products International Corp)</td> <td>50-213-641</td><td></td></tr><tr><td>tiras de pH</td><td>Fisher (Millipore Sigma)</td><td>M1095350001</td><td>sonda de pH também pode ser usada</td></tr><tr><td>Gel PLPP</td><td>nanoescalaLABS</td><td>PLPP-GEL-300UL</td><td>https://www.alveolelab.com/our-products/plpp-photoactivatable-reagent/</td></tr> <tr><td>PRIMO</td><td>Alv&eacute; ole</td><td></td><td>https://www.alveolelab.com/our-products/primo-micropatterning/</td></tr> <tr><td>pSynkRSV-I19F (BAC contendo RSV A2-mK+ cDNA antigenômico)</td> <td>BEI Resources</td><td>NR-36460</td><td>https://www.beiresources.org/Catalog/BEIPlasmidVectors/NR-36460.aspx</td></tr><tr><td>Quantifoil grids</td><td>EMS (Quantifoil)</td><td>Q2100AR1</td><td>2 &micro; m buracos espaçados 1 &micro; m de distância, outras dimensões estão disponíveis</td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Fisher (Lonza)</td><td>BW12-702F</td><td></td></tr><tr><td>RSV A2-mK+</td><td>ver entrada para pSynkRSV-19F-Descrito</td><td></td> <td>em Hotard et al. [22]. Pode ser gerado a partir de pSynkRSV-ll9F</td></tr><tr><td>Schneider's Media</td><td>ThermoFisher (Gibco)</td><td>21720-024</td><td></td></tr><tr><td>SerialEM</td><td>SerialEM (https://bio3d.colorado.edu/SerialEM/ )</td><td></td><td>https://bio3d.colorado.edu/SerialEM/</td></tr> <tr><td>Pinças</td><td>retas EMS (Dumont)</td><td>72812-D</td><td></td></tr><tr><td>Estreptomicina</td><td>Fisher (Fisher BioReagents)</td><td>BP910-50</td><td></td></tr><tr><td>Sacarose</td><td>Avantor</td><td>4097-04</td><td></td></tr><tr><td>Tetraciclina</td><td>Sigma</td><td>T8032-10MG</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio eletrônico Titan Krios</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td>300kV, com câmera detector de elétrons direto e filtro de energia</td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>ThermoFisher (Gibco)</td><td>15090046</td><td></td></tr><tr><td>Tubo Revólver/Rotador</td><td>Fisher (Thermo Scientific)</td><td>11676341</td><td></td></tr><tr><td>UAS: mcD8: GFP Drosophila fly strain</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>5146</td><td>http://flybase.org/reports/FBtp0002652.html</td></tr></tbody></table>

micropatterning transmissão electron microscopy grids para posicionamento direto celular dentro de fluxos de trabalho de tomografia crio-elétron inteira

Micropatterning Transmission Electron Microscopy Grids to Direct Cell Positioning within Whole-Cell Cryo-Electron Tomography Workflows

A tomografia crio-elétron de células inteiras (crio-ET) é uma tecnologia poderosa que é usada para produzir estruturas de resolução de nível de nanômetros de macromoléculas presentes no contexto celular e preservadas em um estado quase nativo congelado-hidratado. No entanto, há desafios associados à cultura e/ou adesão de células nas grades TEM de uma maneira adequada para a tomografia, mantendo as células em seu estado fisiológico. Aqui, um protocolo passo-a-passo detalhado é apresentado sobre o uso de micropatterning para direcionar e promover o crescimento de células eucarióticas nas redes TEM. Durante a micropattersagem, o crescimento celular é direcionado depositando proteínas de matriz extracelular (ECM) dentro de padrões e posições especificados na folha da grade TEM, enquanto as outras áreas permanecem revestidas com uma camada anti-incrustar. A flexibilidade na escolha do revestimento de superfície e do design de padrões torna a micropatterning amplamente aplicável para uma ampla gama de tipos de células. A micropattersão é útil para estudos de estruturas dentro de células individuais, bem como sistemas experimentais mais complexos, como interações hospedeiro-patógeno ou comunidades multicelulares diferenciadas. A micropattersagem também pode ser integrada em muitos fluxos de trabalho crio-ET de células a jusante, incluindo a microscopia de luz correlativa e elétron (crio-CLEM) e a fresagem de feixe de íons focal (crio-FIB).

O objetivo deste protocolo é direcionar a adesão celular e o crescimento para áreas direcionadas de redes para microscopia crio-elétron. Isso é conseguido aplicando uma camada anti-incrustada que é ablada em padrões especificados pelo usuário seguido pela deposição de proteínas de matriz extracelular nas áreas padronizadas antes da semeadura celular.

Micropatterning Transmissão Electron Microscopy Grids para Posicionamento Direto celular dentro de fluxos de trabalho de tomografia crio-elétron inteira

Whole-cell cryo-electron tomography (cryo-ET) is a powerful technology that is used to produce nanometer-level resolution structures of macromolecules ...

Nossa equipe de pesquisa desenvolve tecnologias e protocolos para microscopia crio-elétron e tomografia crio-elétron. Desenvolvemos protocolos para micropatterar redes TEM para direcionar o crescimento celular e o posicionamento para experimentos crio-ET. A tomografia crio-elétron de células inteiras é usada para produzir estruturas de resolução em nível de nanômetro de complexos macromoleculares dentro de células preservadas em um estado hidratado congelado nativo.A micropatterning pode aumentar o rendimento de crio-ET de células inteiras, microscopia de elétrons de luz crio-correlativa e experimentos de moagem de feixe de íon-íon-crio-focado. O número e a distribuição de células nas redes EM são cruciais para estudos crio-ET de células inteiras. Este protocolo fornece um método rápido, reprodutível e amplamente adaptável para direcionar o crescimento celular nas redes EM através de micropatters.O pesquisador deve estar confortável usando pipetas, pinças, técnicas básicas de cultura celular e microscópios eletrônicos de fluorescência e transmissão. Ao padronizar pela primeira vez, use um tipo de célula bem conhecido e combinação ECM e teste-os em tampas ou pratos MatTek. Os membros da equipe de pesquisa envolvidos neste desenvolvimento de protocolos são:Dr.Brian Sibert, Sr. Joseph Kim e Dr. Jae Yang. Para começar, transfira as grades para um suporte de preparação de grade e descarrehe as grades do lado carbono para cima. Em seguida, transfira as grades com o lado carbono até um escorregador de vidro limpo ou deslize com pelo menos um centímetro de separação entre as grades.Pipeta 10 microlitres de 0,05 poli-L-lysine em cada grade e incubar as grades em uma câmara úmida por pelo menos 30 minutos. Após a incubação, lave cada grade três vezes com 15 microlitres de 0,1 molar HEPES em pH 8,5. Incubar a grade em cada lavagem por 30 segundos e, em seguida, remova a maior parte do líquido da rede com uma pipeta sem deixar a grade secar.Após a lavagem final, deixe cada grade em 15 microliters de 0,1 molar HEPES. Em seguida, prepare a solução PEG-SVA e substitua imediatamente a solução HEPES nas redes por 10 microliters da solução PEG-SVA e, em seguida, incubar as grades em uma câmara úmida por pelo menos uma hora. Após a incubação, lave cada grade três vezes com 15 microliters de água estéril, incubando a rede em cada lavagem por 30 segundos.Após a lavagem final, deixe cada grade em 15 microliters de água. Coloque uma gota de água de um microliter no centro de uma nova tampa limpa, em seguida, transfira cuidadosamente a rede da gota de água de 15 microliter para a queda no novo deslizamento de tampas com o lado carbono para cima. Em seguida, coloque cuidadosamente no estêncil PDMS sobre a grade mantendo a grade centrada e minimizando o contato de estêncil com a folha de carbono da rede.Em seguida, adicione um microliter de gel PLPP na grade e pipeta suavemente para misturar. Mova a tampa com a grade para um local escuro para secar. O gel secará em 15 a 30 minutos.Para micropatterning, abra o software com uma visão Brightfield ao vivo do microscópio. Para projetar um novo modelo para uma execução inicial, selecione Adicionar ROI e escolha um círculo de 3.000 micrômetros. Posicione o ROI do círculo sobre a grade usando a imagem Brightfield na tela como guia e pressione Lock para proteger o ROI.Depois de bloquear o ROI no lugar, selecione Adicionar padrão e escolha o padrão apropriado. Usando as opções de replicação, gere cópias do padrão inicial para criar uma região quadrada de oito por oito grades. Ajuste o espaçamento e o ângulo conforme necessário para alinhar os padrões com os quadrados da grade.Posicione o padrão em um canto da grade. Em seguida, duplique o padrão e coloque uma cópia em cada um dos quatro cantos da grade movendo o estágio do microscópio conforme necessário para cada região. Use as opções de replicação para modificar uma região quadrada de oito por oito grades em uma região quadrada de duas por oito grades para ser colocada em ambos os lados do centro.Deixe o centro quatro quadrados de grade sem ser forretado. Para cada padrão, ajuste a dose total, se necessário. 30 milijoules por milímetro quadrado é um bom ponto de partida.Em Opções especializadas, iterar ajustando o ângulo, posição, espaço entre e proporção do padrão para refinar o alinhamento do padrão com os quadrados da grade. Mova o estágio do microscópio para alterar a região da grade no visor Brightfield. Uma vez que o modelo e os padrões estejam posicionados, desmarque todas, exceto uma das regiões do painel de ação do software.Use o estágio do microscópio para navegar até aquela região e se concentrar na folha de carbono. Clique no ícone do globo ocular no painel de ação para alternar a exibição de sobreposição de padrão. Uma vez que a grade esteja em foco, feche o obturador Brightfield e pressione o ícone Play no canto inferior direito do software para iniciar o processo de padronização, que pode ser monitorado ao vivo.Repita esta etapa até que todas as regiões estejam padronizadas. Finalmente, remova o deslizamento de tampa com a grade do microscópio e adicione imediatamente 10 microlitros de PBS estéreis na grade. Após 10 minutos, remova o estêncil com pinças, depois lave a rede três vezes com 15 microliters de PBS e deixe cada grade em PBS em um local escuro.Prepare 15 microliters da matriz extracelular para cada grade, substitua o PBS de cada grade por 15 microliters da matriz extracelular e incubar a rede em uma câmara úmida por pelo menos uma hora. Após a incubação, lave cada grade cinco vezes com 15 microliters de PBS estéril, como demonstrado anteriormente. Após a lavagem final, deixe cada grade na PBS.Usando um microscópio de fluorescência, detecte o fluoróforo na matriz extracelular para confirmar a padronização e que a folha de carbono permanece intacta. As células HeLa semeadas em grades TEM micropatteradas e não despachadas são visíveis por manchas fluorescentes usando um ensaio de viabilidade celular baseado em calcário AM e ethidium homodimer-1. Usando uma matriz extracelular de colágeno e fibrinogênio misto, as células HeLa facilmente aderem a padrões em toda a grade.A morfologia geral das células que se expandiu ao longo do padrão é semelhante à das células cultivadas em grades não padronizadas. Uma imagem brightfield de células BEAS-2B infectadas 18 horas após a semeadura mostra a adesão e crescimento celular ao longo da região central do padrão. A maioria das células infectadas estão posicionadas ao longo da região central de maior densidade do padrão gradiente.As variantes RSV estão localizadas perto da periferia das células BEAS-2B infectadas cultivadas em redes micropatteradas. Muitas proteínas estruturais RSV são identificadas dentro dos tomogramas, incluindo a proteína de fusão nucleocapsida e viral. Em redes micropatteradas, neurônios de Drosophila com expressão GFP pan-neuronal podem ser facilmente rastreados por microscopia leve devido à rotulagem fluorescente e sua localização estar dentro dos micropatterns.Neurônios em redes não respingadas também podem ser rastreados através da sinalização GFP por microscopia leve. No entanto, localizá-los na microscopia crio-elétron torna-se difícil devido a detritos celulares e contaminação da mídia. Devido às dimensões do corpo celular neurônio e neurites estendidos, séries de inclinação crio-elétron são coletadas ao longo de regiões mais finas das células com maior ampliação.A membrana celular neuronal, mitocôndrias, microtúbulos, filamentos de actina, estruturas vesiculares e macromoléculas como ribossomos são bem resolvidas em montagens de imagens de ampliação mais altas e fatias através do tomograma 3D. Características subcelulares semelhantes são observadas a partir de tomogramas 3D de neurônios não padrões. Aplicar o estêncil na grade e adicionar no gel PLPP é a etapa mais sensível que pode afetar os resultados de padronização e deve ser feito com cautela.O Crio-CLEM pode ser usado para localizar alvos de interesse dentro das células para coleta de dados crio-ET. O Crio-FIB-SEM pode ser usado para finar células em áreas de outra forma muito grossas para coleta de dados.

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Que vamos mostrar aqui como usar elétron cryotomography (ECT) para estudar a ultra-estrutura das células bacterianas em quase nativo estados, a "macromolecular" (~ 4 nm) resolução.

Electron Cryotomography de células bacterianas

Nós descrevemos um método de microscopia correlativa que combina alta velocidade de microscopia de luz fluorescente de células vivas 3D de alta resolução tomografia crio-eletrônico. Nós demonstrar a capacidade do método dinâmico de imagem por correlativo, as pequenas partículas de HIV-1 que interagem com células HeLa hospedeiras.

Microscopia correlativo para Análise Estrutural 3D de interações dinâmicas

Nós apresentamos um protocolo sobre como utilizar de alto rendimento tomografia crio-eletrônica para determinar alta resolução em estruturas in situ de máquinas moleculares. O protocolo permite que grandes quantidades de dados a serem processados, evita gargalos comuns e reduz o tempo de inatividade de recursos, permitindo que o usuário se concentrar em questões biológicas importantes.

Usando Tomoauto: Um Protocolo de métodos de alta capacidade automatizada Cryo-Electron Tomografia

É apresentado um instrumento e métodos para a preparação dos volumes de nanolitros de tamanho de amostra para microscopia eletrônica de transmissão. Sem papel-mancha passos são necessários, evitando assim as consequências prejudiciais que isso pode ter para proteínas, reduzindo a perda de amostra significativamente e permitindo a análise do lisado para proteômica visual única célula.

Preparação da amostra miniaturizada para microscopia eletrônica de transmissão

Aqui, é apresentado um protocolo descrevendo as etapas de preparação da amostra e coleta de dados necessárias na tomografia criobada de raios-X (SXT) para a imagem da ultraestrutura de células inteiras preservadas de crio-preservo em uma resolução de 25 nm meio passo.

Uma descrição cartográfica 3D da célula por crioma tomografia de raios-X suave

A crescente demanda por coleta de dados em larga escala na tomografia criogênica de elétrons requer rotinas de aquisição de imagens de alto rendimento. Descrito aqui é um protocolo que implementa os recentes desenvolvimentos de estratégias avançadas de aquisição que visam maximizar o tempo-eficiência e o throughput da coleta de dados tomográficos.

Estratégias de Otimização da Aquisição de Dados de Tomografia Eletrônica Criogênica

Aqui, apresentamos um pipeline para fresagem de feixe de íons com foco correlativo 3D na orientação da preparação de amostras celulares para tomografia crio-eletrônica. A posição 3D das proteínas fluorescentemente marcadas de interesse é primeiramente determinada por microscopia de criofluorescência e, em seguida, direcionada para moagem. O protocolo é adequado para células de mamíferos, leveduras e bactérias.

Preparação de amostras por fresagem de feixe de íons com foco correlativo 3D para tomografia crioeletrônica de alta resolução

O presente protocolo descreve a aquisição remota de dados remotos crio-elétrons de alta resolução usando Tomo5 e processamento de dados subsequente e média de subtomogramas usando a emClarity. A apoferritina é usada como exemplo para ilustrar processos passo a passo detalhados para alcançar uma estrutura crio-ET com resolução de 2,86 Å.

Coleta remota de dados de tomografia crio-elétron e média de subtomograma

Este método fornece um protocolo acessível e flexível para a preparação de grades de microscopia eletrônica (ME) para criotomografia celular in situ e microscopia correlativa de luz e eletrônica (CLEM).

Preparo de Amostras para Criotomografia In Situ de Células de Mamíferos

Esse protocolo padroniza a criotomografia eletrônica (crio-ET) para tecidos espessos, integrando congelamento de alta pressão (HPF) com o método waffle, levantamento por feixe de íons de foco criogênico (crio-FIB) e aquisição paralela e dose-simétrica, resultando em lamelas uniformemente finas e amostras vitrificadas para análise in situ reprodutível no hipocampo do camundongo.

Fluxo de trabalho de criotomografia eletrônica para tecidos espessos demonstrado em hipocampo de camundongos

Aprenda a micropadronar grades de microscopia eletrônica para direcionar o crescimento celular em experimentos de tomografia criogênica. Este protocolo reprodutível utiliza matriz extracelular e aumenta a eficiência da criomicroscopia eletrônica.

Micropatterning Transmissão Electron Microscopy Grids para Posicionamento Direto celular dentro de fluxos de trabalho de tomografia crio-elétron inteira (Vídeo) | JoVE Journal

Micropatterning Transmissão Electron Microscopy Grids para Posicionamento Direto celular dentro de fluxos de trabalho de tomografia crio-elétron inteira

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