Preparação amostral para visualização tridimensional baseada em tomografia computadorizada de vasos de membros traseiros murinos
7 de outubro de 2021
Aqui, descrevemos um método de visualização e quantificação para vasos de membros traseiros murinos usando tomografia computadorizada de micro-raios-X.
É possível tirar imagens de tomografia dos vasos sanguíneos nos membros inferiores e nos órgãos abdominais usando o protocolo de passo. O método permite a avaliação de todos os vasos sanguíneos de forma abrangente. Além disso, é possível avaliar apenas artérias ou, ao mesmo tempo, artérias e veias.
É muito importante prevenir coágulos sanguíneos, vazamento ou sangue bem, e evitar bolhas de ar. Antes da operação, injete 1 unidade/grama de heparina em PBS na cavidade intraperitoneal do camundongo. Após 30 minutos, faça uma incisão no esterno do rato eutanizado e fixe o tórax aberto com pinos.
Corte a aorta ascendente antes de remover o coração, e depois remova o pulmão para expor a aorta descendente. Corte a aorta descendente diagonalmente para revelar a seção transversal do vaso. Em seguida, insira um cateter de calibre 22 na aorta descendente enquanto executa o tampão de vasodilatação.
Fixar a raiz do cateter e fazer um nó para evitar vazamentos devido ao fluxo de volta. Uma vez feito, inicie a perfusão com uma solução vasodilatante aquecida a uma pressão fixa entre 13 a 15 quilopascals. Após três minutos, perfunda uma solução de 4% paraformaldeído em PBS por 3 min.
Pare a perfusão e encha o tubo de extensão conectado ao cateter com 2 mL do meio de contraste recém-preparado diluído na razão 1:1 para perfuuse em um fixo entre 13 a 15 quilopascals. Para visualizar as artérias, verifique a unha do pé da boca para confirmar que o meio de contraste atingiu a artéria. Da mesma forma, verifique a veia cava inferior do diafragma para confirmar a circulação completa do meio de contraste e visualize todos os vasos.
Se a circulação do meio de contraste estiver completa, feche a torneira de três vias e remova o tubo. Incubar a amostra durante a noite a 4 graus Celsius. Neste protocolo, todos os vasos nas extremidades inferiores do mouse foram visualizados.
Os resultados de um modelo de isquemia de membros traseiros confirmaram que a artéria femoral não ligada estava correndo paralelamente à veia femoral. Além disso, a interrupção nos meios de contraste facilitou a visualização de uma artéria femoral ligada e o desenvolvimento de embarcações colaterais. Alguns vasos cheios com o meio de contraste poderiam ser vistos.
Por outro lado, também foi notada a interrupção nos meios de contraste devido à mistura de mídia não-contrária, ou perfusão insuficiente. Era impossível visualizar as artérias na superfície do corpo por observação microscópica do meio de contraste, o que facilitou a avaliação de defeitos na vasculatura. É muito importante evitar bolhas de ar ao inserir o cateter.
Como seus órgãos abdominais também estão relaxados, é possível retirar os órgãos e fazer uma tomografia. Usando este método, conseguimos identificar um novo quarto de saturação.
Visão Geral
Este artigo descreve um método para visualizar e quantificar vasos dos membros posteriores murinos usando tomografia computadorizada de micro-raios-X. A técnica permite uma avaliação abrangente dos vasos sanguíneos nos membros inferiores e órgãos abdominais.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia Vascular
- Técnicas de Imagem
Fundamentos
- A tomografia computadorizada de micro-raios-X é uma ferramenta de imagem poderosa.
- Compreender a estrutura dos vasos sanguíneos é crucial para vários estudos biológicos.
- Métodos anteriores podem não fornecer visualização abrangente.
- Este estudo visa melhorar as técnicas de visualização para modelos murinos.
Propósito do Estudo
- Desenvolver um método confiável para visualizar vasos dos membros posteriores.
- Permitir a quantificação de estruturas vasculares em modelos murinos.
- Avaliar o impacto de intervenções na saúde vascular.
Métodos Utilizados
- Injeção de heparina para prevenir coágulos sanguíneos.
- Perfusão de meio de contraste para visualizar vasos sanguíneos.
- Imagem de TC para capturar estruturas vasculares detalhadas.
- Avaliação de artérias e veias nos membros posteriores.
Principais Resultados
- Visualização bem-sucedida de todos os vasos nas extremidades inferiores.
- Identificação de vasos colaterais em um modelo de isquemia do membro posterior.
- Desafios observados com bolhas de ar e perfusão incompleta.
- O método permitiu a avaliação de defeitos vasculares.
Conclusões
- O método fornece uma abordagem abrangente para imagem vascular.
- Pode melhorar a compreensão das condições vasculares em modelos murinos.
- Aplicações futuras podem incluir estudos sobre saúde e doenças vasculares.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
This method enables comprehensive 3D visualization of murine vascular networks, supporting preclinical assessment of angiogenic responses and vascular pathology. By providing quantitative structural data from hind-limb and abdominal organ vasculature, it enhances target validation in vascular biology and ischemic disease models. The technique improves predictive confidence in lead identification by reducing reliance on 2D sectioning and enabling direct observation of vascular architecture and collateral formation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses related to angiogenesis and vascular remodeling in ischemic models.
- Operational Value: Provides functional validation of vascular targets through direct 3D imaging of perfusion defects and collateral development.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by quantifying vascular responses to pharmacological or genetic interventions.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares standardized biological systems for downstream compound screening by establishing baseline vascular morphology.
- Quantitative Output: Delivers measurable vascular parameters such as vessel density, branching patterns, and perfusion completeness for assay standardization.
- Scalability: Compatible with micro-CT platforms, enabling reproducible imaging across laboratories and study sites.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models physiological and pathological angiogenesis in hind-limb ischemia, supporting translational biomarker alignment.
- Preclinical Continuity: Bridges discovery findings with preclinical validation by enabling longitudinal vascular assessment.
- Risk-Adjusted Decisions: Informs go/no-go criteria by visualizing vascular defects and compensatory mechanisms that influence drug efficacy.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery-to-preclinical continuum, particularly in target validation and lead optimization stages where vascular phenotypes are critical readouts.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of angiogenic pathways and vascular integrity in disease models.
- Screening: Enables assay-ready vascular models with reproducible, quantitative imaging outputs for compound evaluation.
- Analytics: Provides structural and perfusion-based readouts that allow comparative analysis across experimental conditions.
- Translational Research: Connects molecular findings to vascular outcomes in preclinical models, supporting biomarker-linked efficacy assessment.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging platform for vascular phenotyping across multiple therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in vascular responses.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization through standardized perfusion and imaging protocols.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early detection of vascular liabilities and reducing late-stage attrition.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted advancement decisions based on quantitative vascular morphology and perfusion data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microsurgical vascular perfusion and contrast agent handling.
- Dependent on micro-CT imaging infrastructure and contrast medium preparation capabilities.
- Necessitates cross-team standardization of perfusion pressure, timing, and contrast dilution for reproducible results.
- Adaptation across model systems may require adjustments in cannulation technique and perfusion parameters.
- Practical limitations include sensitivity to air bubbles, incomplete perfusion, and contrast mixing, which can impair visualization quality.
