Name: Sensibilidade de perfil a terapias-alvo em organoides derivados do paciente NSCLC EGFR-Mutant (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: Aprenda a avaliar a sensibilidade a fármacos em organoides de câncer de pulmão derivados de pacientes usando ensaios de viabilidade celular. Este protocolo aprimora estratégias de tratamento personalizado em oncologia.

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Agradecemos aos laboratórios de Jeroen P Roose (UCSF) e Calvin J Kuo (Stanford) por sua contribuição em relação à cultura organoide e desenvolvimento de protocolos. Agradecemos ainda a Oghenekevwe M. Gbenedio (laboratório Roose, UCSF) por protocolos e entrada de estabelecimento de amostras. Este projeto de pesquisa foi realizado com apoio do NIH [U54CA224081]. F. Haderk foi apoiado pela bolsa de pós-doutorado Mildred Scheel da Ajuda alemã ao Câncer.

Para pesquisa de seres humanos, o consentimento informado foi obtido e a coleta de tecidos foi realizada nos protocolos aprovados pelo Conselho de Revisão Interna da UCSF (IRB, protocolo nº 13-12492, ou CC#17-23309). O estabelecimento de culturas organoides a partir de amostras clínicas desidentidas foi realizado em colaboração com parceiros de pesquisa de acordo com métodos publicados anteriormente13,14,15,16. Culturas organoides foram recuperadas para experimentos de manutenção e escalonamento de drogas na passagem três ou posteriores. Todos os protocolos a seguir foram realizados em condições assépticas em um ambiente de laboratório de cultura de tecidos mamíferos.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63039/63039fig1v2.jpg"> Figura 1: Esquema de protocolo de fluxo de trabalho e passos críticos na técnica. (A) Fluxo de trabalho experimental, incluindo semeadura de organoides em formato de 96 poços, tratamento com escalada de medicamentos em 7 dias após a semeadura e leitura de sobrevivência celular baseada em luminescência 5 dias após o tratamento usando um leitor de placas ELISA. (B) Uma imagem de exemplo das culturas organoides TH107 e EGFRL858R-positivo TH330 NSCLC. Culturas originais, células no momento da semeadura (dia 0), e organoides no tratamento começam 7 dias após a semeadura (dia 7) são mostradas. Barra de escala = 100 μm. Alterações no diâmetro organoide durante o período de cultura inicial de 7 dias são quantificadas e indicam &gt;2 vezes aumento no tamanho organoide. Alterações relativas da dobra nos tamanhos no dia 7 em comparação com o tamanho médio no dia 0 são apresentadas abaixo das imagens representativas. Para o TH107, observa-se uma variação de 2,38 em 7 dias, indicando um tempo duplicado de 5,88 dias (141,12 h). Para o TH330, observa-se uma variação de 2,41 em 7 dias, indicando um tempo duplicado de 5,81 dias (139,42 h). Quantificação de alterações no tamanho organoide e avaliação estatística (à direita). A significância estatística é calculada pelo teste t não pago, p &lt; 0,0001. (C) Layout de tratamento para a escalada de medicamentos no formato de placa organoide de 96 poços. O número de réplicas técnicas e doses exemplares são indicados, incluindo um controle negativo. Os esquemas são criados com o BioRender, uma ferramenta de ilustração baseada na Web. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63039/63039fig1v2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
1. Preparações experimentais
<ol><li>Prepare o meio de crescimento (GM) como relatado anteriormente15: mistura de nutrientes Demálbecco's Medium/Ham F12 (DMEM/F-12) com L-alanyl-L-glutamina, suplementada com penicilina/estreptomicina de 10 mM, 25 nM hRsdin, 1x B27, 5 mM Nicotinamida, 1,25 mM N-Acetylcysteine, 500 nM A-8301, 500 nM SB202190, 50 μg/mL Primocin, 100 ng/mL hNoggin, 100 ng/mL hFGF-10, 25 ng/mL hFGF-7 (ver Tabela de Materiais). NOTA: Misture suavemente para evitar espuma e filtre através de um sistema de filtragem de 0,22 μm. Mídia quente a 37 °C dentro de 1h antes de usar.</li>
	<li>Prepare a mídia de fator de baixo crescimento (LGM) como relatado anteriormente16 sem a adição de fator de crescimento epidérmico (EGF): Mistura de nutrientes De médio/presunto modificado da Águia Modificada de Dulbecco F12 (DMEM/F-12), suplementada com HEPES de 1 mM, 1x L-alanyl-L-glutamina, 1x Penicillin-Streptomycin-Glutamine, 10 mM Nicotinamida, 1 mM N-Acetylcysteine, 1x B27, 500 nM A-8301, 100 ng/mL hNoggin. NOTA: Misture suavemente para evitar espuma e filtre através de um filtro de 0,22 μm. Mídia quente a 37 °C dentro de 1h antes de usar.</li>
	<li>Degelo BME2 (Extrato de membrana de porão do fator de crescimento reduzido, tipo 2, ver Tabela de Materiais) no gelo, a 4 °C, durante a noite.</li>
</ol>2. Gerando suspensão de células únicas e semeadura de células
<ol><li>Dissociar a cultura organoide BME2 submersa, conforme descrito nas etapas seguintes (2.1.1-2.1.6).<ol>
<li>Aspirar cuidadosamente a mídia das placas de cultura. Evite tocar na cultura organoide BME2 submersa. NOTA: A aspiração da mídia pode ser feita como o pesquisador prefere, por exemplo, com um sistema básico de aspiração de fluidos ou usando uma pipeta. Evite tocar nos organoides incorporados BME2, pois isso pode resultar na perda de biomassa organoide.</li>
		<li>Trypsinize a cultura organoide BME2 submersa com uma enzima recombinante adequada (ver Tabela de Materiais). Em formato de placa de 6 poços, adicione 2 mL por poço. Quebrar mecanicamente o BME2, encanar repetidamente para cima e para baixo. Incubar placas a 37 °C na incubadora de cultura celular por 5 min.</li>
		<li>Transfira a suspensão para um tubo de centrífuga de 15 mL e centrífuga a 600 x g por 5 min a temperatura ambiente.</li>
		<li>Aspire a enzima recombinante cuidadosamente sem tocar na pelota organoide. NOTA: Pode estar presente o BME2 residual. Repita a digestão da enzima, se necessário.</li>
		<li>Resuspend a pelota organoide em GM (etapa 1.1). Adicione DNase I 1x 100 U/mL e incubar por 5 min a temperatura ambiente (ver Tabela de Materiais).</li>
		<li>Centrifugar a 600 x g por 3 min a temperatura ambiente. Pipeta fora da mídia cuidadosamente sem tocar na pelota organoide e descartar. Resuspend em GM fresco.</li>
	</ol></li>
	<li>Semeadura de suspensão organoide unicelular<ol><li>Pré-aqueça uma nova placa preta, de fundo claro, de 96 poços a 37 °C na incubadora de cultura celular por 10 minutos. NOTA: O uso de placas inferiores claras é essencial para monitorar o crescimento organoide e a resposta de drogas.</li>
		<li>Para contar, prepare uma diluição de 1:5 da suspensão celular em PBS (volume total: 500 μL) e conte a suspensão celular usando um analisador de células (ver Tabela de Materiais). NOTA: Certifique-se de multiplicar pelo fator de diluição (x 5) para receber a concentração celular final. Podem ser utilizados métodos alternativos de contagem, como um hemócito. A viabilidade celular deve ser monitorada usando um ensaio de coloração de viabilidade (por exemplo, com Trypan Blue17). Usando um analisador de células, a viabilidade é avaliada automaticamente. A viabilidade das suspensões organoides unicelulares avaliadas pelo analisador celular deve ser ≥95% (Figura Suplementar 1).</li>
		<li>Calcule o volume da suspensão celular necessária à semente para o experimento. NOTA: A concentração de semeadura é de 1500 células/μL BME2, com 5 μL BME2 necessário por poço (número total: 7500 células/bem). Para uma placa de 96 poços, são necessárias células 6 x 10E5. Isso inclui a semeadura de 60 poços com cúpulas organoides (4,5 x 10E5) e excedente experimental (cálculo para um total de 80 poços).</li>
		<li>Prepare uma alíquota de suspensão celular em um tubo de microcentrifuuge de 1,5 mL por cada placa de 96 poços planejada para ser semeada se várias placas de 96 poços forem incluídas no experimento. NOTA: São necessários alíquotas experimentais excedentes e alíquotas separadas por placa semeada de 96 poços para explicar o aumento do viés experimental devido ao manuseio do BME2.</li>
		<li>Células de alíquota da suspensão unicelular como calculada (etapa 2.2.3) após cuidadosa ressuspensão por tubulação para cima e para baixo. Células de pelota a 600 x g por 5 min à temperatura ambiente. Remova cuidadosamente a mídia usando uma pipeta P200 sem tocar na pelota celular. Coloque a pelota de célula no gelo em breve (~1 min) e resuspense a pelota celular em BME2. NOTA: A mídia residual pode comprometer a estrutura e a rigidez do BME2. Pipeta fora de todos os meios de comunicação com cuidado. Coloque células no gelo em breve para aclimatar a pelota celular e permitir que as células sejam resuspengidas no BME2 sem aglomeração. Mantenha o BME2 no gelo constantemente para que ele permaneça no estado líquido. Para uma placa de 96 poços, 400 μL BME2 é necessário para a ressuspensão da pelota celular. Resuspend pelotas de célula com cuidado, evitando a introdução de bolhas.</li>
		<li>Incline seu prato preto pré-aquecido, fundo claro 96-bem em sua direção. Células de placa usando 5 μL de suspensão celular por poço e cúpulas celulares semeadas na posição das 6 horas de cada poço (Figura 1A).  Semente as cúpulas celulares nos poços internos restantes (colunas 2-10 e linhas B-G de uma placa de 96 poços). NOTA: Recomenda-se a pipetação reversa18 ao manusear o BME2.</li>
		<li>Não mova a placa de 96 poços e incubam cúpulas celulares recém-semeadas na capa de fluxo laminar da cultura celular por 5 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, mova a placa para a incubadora de cultura celular e incuba-a por 10 min a 37 °C.</li>
		<li>Adicione cuidadosamente 100 μL de GM por poço a todos os poços que contêm organoides (colunas 2-10 e linhas B-G de uma placa de 96 poços). Adicione 100 μL de PBS aos poços externos na borda da placa.</li>
		<li>Cultura BME2 incorporado organoides em mídia GM a 37 °C na incubadora de cultura celular por um total de 7 dias. Inspecione o crescimento de organoides sob o microscópio leve regularmente. NOTA: Consulte a Figura 1B e a Tabela Suplementar 1 para um exemplo do crescimento esperado da semeadura para o dia do tratamento.</li>
		<li>Mude a mídia uma vez após 3-4 dias de cultura: gire a placa no sentido horário em 180° (organoides agora na posição das 12 horas), aspire cuidadosamente GM da posição oposta à cúpula organoide usando um aparelho multicanal se disponível e, em seguida, adicione GM fresco.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Tratamento medicamentoso
<ol><li>Prepare uma diluição de drogas seriais em LGM para a droga de escolha, por exemplo, osimertinib, para tratar organoides NSCLC mutantes EGFR. Inclua um controle negativo (mídia LGM + 0,1% DMSO). Prepare alíquotas suficientes de todas as doses de acordo com o número de poços semeados mais excedentes experimentais. NOTA: Recomenda-se uma série de diluição, incluindo ≥8 doses e variando de 1 nM-10 μM para inibidores direcionados.</li>
	<li>Gire a placa organoide no sentido horário em 180° (organoides agora na posição das 12 horas). Aspire cuidadosamente a GM usando um aparelho multicanal de preferência. NOTA: Evite tocar na cúpula organoide ao aspirar o GM, pois isso pode resultar em perda de biomassa organoide e resultados de impacto.</li>
	<li>Adicione 100 μL de controle (por exemplo, mídia LGM + 0,1% DMSO) ou solução de medicamentos por poço. NOTA: Consulte a Figura 1C para o esquema de tratamento de escalonamento de medicamentos no formato de placa de 96 poços.</li>
	<li>Incubar organoides tratados a 37 °C na incubadora de cultura celular por 5 dias.</li>
</ol>4. Leitura por ensaio de sobrevivência baseado em luminescência
<ol><li>Leitura de colheita e sobrevivência<ol>
<li>Realize o ensaio de sobrevivência de acordo com o Reference19.<ol>
<li>Degelo (ver Tabela de Materiais) durante a noite a 4 °C. Equilibre o reagente em um banho de água à temperatura ambiente por 30 minutos antes do uso e misture invertendo.</li>
			<li>Adicione um volume igual do reagente a cada poço (100 μL por poço). Misture bem por pipetar para cima e para baixo, com a ponta de pipeta colocada na posição da cúpula organoide. Incubar por 5 minutos à temperatura ambiente no escuro.</li>
			<li>Usando uma pipeta multicanal, transfira aproximadamente 75% (150 μL) do lysate (passo 4.1.1.2) para uma nova placa branca, de fundo opaco de 96 poços. NOTA: Transferir 75% dos lisatos para uma nova placa garante a ausência de bolhas na leitura posterior sem afetar a sensibilidade do ensaio.</li>
			<li>Incubar por mais 25 min à temperatura ambiente no escuro.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Regissão de registro utilizando um leitor de placas ELISA (tempo de integração 0,25-1 s/per well) (ver Tabela de Materiais).</li>
		<li>Salve os dados em um formato apropriado, por exemplo, uma tabela de dados contendo todas as leituras cruas e o registro do layout da placa e das drogas utilizadas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Análise de dados utilizando software de análise estatística (ver Tabela de Materiais)<ol>
<li>Crie uma nova tabela XY e insira dados em um formato XY: As linhas (X) são controle negativo seguido do aumento das doses de drogas, com doses como log [Inibidor] na concentração molar. Colunas (Y) são valores de leitura que incluem réplicas empilhadas junto com colunas. NOTA: A concentração do controle negativo deve ser indicada como um valor mínimo (dado 0 não é possível na escala de log), por exemplo, log [Inibidor], M = -10.</li>
		<li>Normalizar valores selecionando Analisar &gt; Normalizar e usando os seguintes parâmetros: normalizar cada subcolumn separadamente, Y = 0 como 0 %, "último valor em cada subcolumn (ou primeiro, o que for maior)" como 100 %, resulta em percentagens, gráfico dos resultados.</li>
		<li>Ajuste a curva de regressão não linear em dados normalizados selecionando Análise &gt; análises XY &gt; regressão não linear &gt; resposta dose - Inibição &gt; log (inibidor) vs . resposta normalizada -- Inclinação variável.</li>
		<li>Relatório resulta como uma tabela de valores IC50 produzidos após análise de regressão não linear e gráfico da curva de resposta, incluindo pontos de dados normalizados como desvio padrão médio +/- e curva de regressão instalada.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>de Bono, J. S., Ashworth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translating+cancer+research+into+targeted+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Translating cancer research into targeted therapeutics.</a> Nature. 467 (7315), 543-549 (2010).</li>
<li>Dagogo-Jack, I., Shaw, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour+heterogeneity+and+resistance+to+cancer+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Tumour heterogeneity and resistance to cancer therapies.</a> Nature Reviews Clinical Oncology. 15 (2), 81-94 (2018).</li>
<li>Drost, J., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids+in+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Organoids in cancer research.</a> Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).</li>
<li>Tiriac, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+profiling+identifies+common+responders+to+chemotherapy+in+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">Organoid profiling identifies common responders to chemotherapy in pancreatic cancer.</a> Cancer Discovery. 8 (9), 1112-1129 (2018).</li>
<li>Ooft, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+organoids+can+predict+response+to+chemotherapy+in+metastatic+colorectal+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Patient-derived organoids can predict response to chemotherapy in metastatic colorectal cancer patients.</a> Science Translational Medicine. 11 (513), (2019).</li>
<li>Vlachogiannis, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+organoids+model+treatment+response+of+metastatic+gastrointestinal+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers.</a> Science. 359 (6378), 920-926 (2018).</li>
<li>Dijkstra, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+in+establishing+pure+lung+cancer+organoids+limit+their+utility+for+personalized+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Challenges in establishing pure lung cancer organoids limit their utility for personalized medicine.</a> Cell Reports. 31 (5), 107588(2020).</li>
<li>Lo, Y. -H., Karlsson, K., Kuo, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+organoids+for+cancer+biology+and+precision+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cancer%22%5BJournal%5D)">Applications of organoids for cancer biology and precision medicine.</a> Nature Cancer. 1 (8), 761-773 (2020).</li>
<li>Bivona, T. G., Doebele, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+framework+for+understanding+and+targeting+residual+disease+in+oncogene-driven+solid+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">A framework for understanding and targeting residual disease in oncogene-driven solid cancers.</a> Nature Medicine. 22 (5), 472-478 (2016).</li>
<li>Jabs, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+drug+effects+in+patient-derived+cancer+cells+links+organoid+responses+to+genome+alterations%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Systems+Biology%22%5BJournal%5D)">Screening drug effects in patient-derived cancer cells links organoid responses to genome alterations.</a> Molecular Systems Biology. 13 (11), 955(2017).</li>
<li>Tashiro, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+and+ex+vivo+cetuximab+sensitivity+assay+using+three-dimensional+primary+culture+system+to+stratify+KRAS+mutant+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">In vivo and ex vivo cetuximab sensitivity assay using three-dimensional primary culture system to stratify KRAS mutant colorectal cancer.</a> PLoS One. 12 (3), 0174151(2017).</li>
<li>van de Wetering, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospective+derivation+of+a+living+organoid+biobank+of+colorectal+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients.</a> Cell. 161 (4), 933-945 (2015).</li>
<li>Neal, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+Modeling+of+the+Tumor+Immune+Microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Organoid Modeling of the Tumor Immune Microenvironment.</a> Cell. 175 (7), 1972-1988 (2018).</li>
<li>Hysenaj, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SARS-CoV-2+infection+studies+in+lung+organoids+identify+TSPAN8+as+novel+mediator%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">SARS-CoV-2 infection studies in lung organoids identify TSPAN8 as novel mediator.</a> bioRxiv. , (2021).</li>
<li>Sachs, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+expanding+human+airway+organoids+for+disease+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Long-term expanding human airway organoids for disease modeling.</a> The EMBO Journal. 38 (4), 100300(2019).</li>
<li>Salahudeen, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progenitor+identification+and+SARS-CoV-2+infection+in+human+distal+lung+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Progenitor identification and SARS-CoV-2 infection in human distal lung organoids.</a> Nature. 588 (7839), 670-675 (2020).</li>
<li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypan+blue+exclusion+test+of+cell+viability%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocol+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Trypan blue exclusion test of cell viability.</a> Current Protocol in Immunology. , Appendix 3, Appendix 3B (2001).</li>
<li>Pushparaj, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revisiting+the+micropipetting+techniques+in+biomedical+sciences%3A+A+fundamental+prerequisite+in+good+laboratory+practice%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformation%22%5BJournal%5D)">Revisiting the micropipetting techniques in biomedical sciences: A fundamental prerequisite in good laboratory practice.</a> Bioinformation. 16 (1), 8-12 (2020).</li>
<li>Promega Corporation. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CellTiter-Glo+3D+Cell+Viability+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22Promega+Corporation%22%5BJournal%5D)">CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay.</a> Promega Corporation. , (2021).</li>
<li>Kim, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+lung+cancer+organoids+as+in+vitro+cancer+models+for+therapeutic+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">Patient-derived lung cancer organoids as in vitro cancer models for therapeutic screening.</a> Nature Communication. 10 (1), 3991(2019).</li>
<li>Hu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+cancer+organoids+analyzed+on+microwell+arrays+predict+drug+responses+of+patients+within+a+week%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">Lung cancer organoids analyzed on microwell arrays predict drug responses of patients within a week.</a> Nature Communication. 12 (1), 2581(2021).</li>
<li>Shi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+cultures+as+preclinical+models+of+non-small+cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Organoid cultures as preclinical models of non-small cell lung cancer.</a> Clinical Cancer Research. 26 (5), 1162-1174 (2020).</li>
<li>Collisson, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+molecular+profiling+of+lung+adenocarcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Comprehensive molecular profiling of lung adenocarcinoma.</a> Nature. 511 (7511), 543-550 (2014).</li>
<li>Ramalingam, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overall+Survival+with+Osimertinib+in+untreated%2C+EGFR-mutated+advanced+NSCLC%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Overall Survival with Osimertinib in untreated, EGFR-mutated advanced NSCLC.</a> New England Journal of Medicine. 382 (1), 41-50 (2019).</li>
<li>Soria, J. -C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osimertinib+in+untreated+EGFR-mutated+advanced+non-small-cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Osimertinib in untreated EGFR-mutated advanced non-small-cell lung cancer.</a> New England Journal of Medicine. 378 (2), 113-125 (2017).</li>
<li>Rotow, J., Bivona, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+and+targeting+resistance+mechanisms+in+NSCLC%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Understanding and targeting resistance mechanisms in NSCLC.</a> Nature Reviews Cancer. 17 (11), 637-658 (2017).</li>
<li>Zhang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+the+AXL+kinase+causes+resistance+to+EGFR-targeted+therapy+in+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Activation of the AXL kinase causes resistance to EGFR-targeted therapy in lung cancer.</a> Nature Genetics. 44 (8), 852-860 (2012).</li>
<li>Kanda, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Erlotinib+resistance+in+lung+cancer+cells+mediated+by+integrin+%CE%B21%2FSrc%2FAkt-driven+bypass+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Erlotinib resistance in lung cancer cells mediated by integrin β1/Src/Akt-driven bypass signaling.</a> Cancer Research. 73 (20), 6243-6253 (2013).</li>
<li>Bruun, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+organoids+from+multiple+colorectal+cancer+liver+metastases+reveal+moderate+intra-patient+pharmacotranscriptomic+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Patient-derived organoids from multiple colorectal cancer liver metastases reveal moderate intra-patient pharmacotranscriptomic heterogeneity.</a> Clinical Cancer Research. 26 (15), 4107-4119 (2020).</li>
<li>Hafner, M., Niepel, M., Chung, M., Sorger, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+rate+inhibition+metrics+correct+for+confounders+in+measuring+sensitivity+to+cancer+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+methods%22%5BJournal%5D)">Growth rate inhibition metrics correct for confounders in measuring sensitivity to cancer drugs.</a> Nature methods. 13 (6), 521-527 (2016).</li>
<li>Yuki, K., Cheng, N., Nakano, M., Kuo, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+models+of+tumor+immunology%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Organoid models of tumor immunology.</a> Trends in Immunology. 41 (8), 652-664 (2020).</li>
<li>Gerlinger, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intratumor+heterogeneity+and+branched+evolution+revealed+by+multiregion+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing.</a> New England Journal of Medicine. 366 (10), 883-892 (2012).</li>
<li>McGranahan, N., Swanton, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+and+therapeutic+impact+of+intratumor+heterogeneity+in+cancer+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Biological and therapeutic impact of intratumor heterogeneity in cancer evolution.</a> Cancer Cell. 27 (1), 15-26 (2015).</li>
<li>Rambow, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+minimal+residual+disease-directed+therapy+in+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Toward minimal residual disease-directed therapy in melanoma.</a> Cell. 174 (4), 843-855 (2018).</li>
<li>Marine, J. C., Dawson, S. J., Dawson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-genetic+mechanisms+of+therapeutic+resistance+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Non-genetic mechanisms of therapeutic resistance in cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 20 (12), 743-756 (2020).</li>
<li>Frismantas, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+drug+response+profiling+detects+recurrent+sensitivity+patterns+in+drug-resistant+acute+lymphoblastic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Ex vivo drug response profiling detects recurrent sensitivity patterns in drug-resistant acute lymphoblastic leukemia.</a> Blood. 129 (11), 26-37 (2017).</li>
<li>Drusbosky, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predicting+response+to+BET+inhibitors+using+computational+modeling%3A+A+BEAT+AML+project+study%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia+Research%22%5BJournal%5D)">Predicting response to BET inhibitors using computational modeling: A BEAT AML project study.</a> Leukemia Research. 77, 42-50 (2019).</li>
</ol>

T.G.B. é conselheiro da Array Biopharma, Revolution Medicines, Novartis, AstraZeneca, Takeda, Springworks, Jazz Pharmaceuticals, Relay Therapeutics, Rain Therapeutics, Engine Biosciences, e recebe financiamento de pesquisa da Novartis, Strategia, Kinnate e Revolution Medicines.

Este manuscrito desenvolve e descreve um protocolo padronizado para avaliar a sensibilidade medicamentosa em modelos PDO 3D derivados do NSCLC. Além dos estudos de sensibilidade a medicamentos, é necessária uma caracterização adicional dos modelos organoides disponíveis para determinar as causas subjacentes às diferenças na sensibilidade medicamentosa. Isso pode incluir o perfil genético de organoides e amostras de pacientes e outras análises disponíveis para organoides, como a coloração imunohistoquímica para marcadores de diferenciação e biomarcadores de sinalização celular geral e fisiologia13,29.
Passos críticos no protocolo O protocolo aqui descrito fornece um fluxo de trabalho padronizado que permite análises precisas e reprodutíveis de sensibilidade a medicamentos quando seguidos cuidadosamente. Deve-se tomar cuidado especial nas seguintes etapas: Digestão trypLE e DNAse I durante a geração de suspensões unicelulares, semeadura de suspensões unicelulares no BME2, monitoramento do crescimento organoide até o tratamento, alterações na mídia e interrupção e lise de organoides incorporados BME2 durante a leitura de células baseadas em luminescência. (1) Embora a digestão adicional de DNAse I após a dissociação de organoides baseada em TrypLE não seja essencial para a expansão de modelos organoides durante a manutenção regular da cultura, a digestão DNAse I não deve ser omitida ao semear experimentos de escalonamento de drogas, pois garante uma melhor separação dos aglomerados organoides em suspensões unicelulares e contagem precisa de células. (2) A semeadura da suspensão unicelular no BME2 representa um passo crítico dada a solidificação do BME2 à temperatura ambiente. Assim, um máximo de 1-2 linhas precisa ser semeado de uma só vez, e as amostras devem ser colocadas no gelo antes que linhas adicionais sejam semeadas. Note-se que as células precisam ser es tubos para cima e para baixo quando a semeadura é continuada para permitir uma suspensão celular homogênea. (3) O crescimento organoide precisa ser monitorado cuidadosamente durante a expansão de 7 dias da semeadura para o tratamento. Um exemplo do desenvolvimento esperado é dado na Figura 1B e Na Tabela Suplementar 1. Note-se que avaliar alterações no tamanho organoide por microscopia de campo brilhante e análise de imagem apresentada na Figura 1B pode permitir uma avaliação precisa das diferenças no crescimento organoide e dos tempos de duplicação. Dobrar tempos pode ter impacto nas respostas a medicamentos, como discutido recentemente na literatura30. Se a taxa de crescimento organoide exceder significativamente o exemplo apresentado, pode-se considerar um menor tempo de expansão até o início do tratamento e menor duração do tratamento. (4) Além disso, deve-se tomar cuidado especial ao mudar a mídia para evitar a aspiração de organoides. A posição de semeadura dos organoides incorporados BME2 na posição das 6 horas permite uma aspiração segura da mídia quando as placas são viradas no sentido horário por 180° e a mídia é aspirada na posição oposta dos organoides. (5) Finalmente, a lise completa dos organoides incorporados BME2 durante a leitura de sobrevivência é essencial para registrar resultados precisos. De acordo com as instruções do fabricante, as amostras devem ser escoadas para cima e para baixo repetidamente, idealmente usando pontas não filtradas, para garantir a lise adequada. Os tempos de incubação devem ser seguidos como descrito. Além disso, transferir 75% do lisato (em vez do volume total) para uma placa branca, de fundo opaco de 96 poços para a leitura final usando um leitor de placa ELISA permite uma avaliação adequada, pois isso garante o mesmo volume em cada poço e a ausência de bolhas de ar que podem ser introduzidas por tubulação vigorosa.
Note-se que o perfil das respostas de medicamentos nas culturas organoides incorporadas ao BME2 pode mostrar um desvio padrão maior do que o observado nas culturas regulares da linha celular (Figura 2, Figura 3A). O maior desvio padrão baseia-se em vários fatores, incluindo uma maior probabilidade de pequenas variações na semeadura ao trabalhar com bme2 e diferenças nas taxas de crescimento organoide individual em poços durante o período inicial de crescimento de 7 dias. Assim, devem ser semeadas, iguais ou mais de quatro réplicas técnicas por concentração de drogas.
Mais importante, a presença de células malignas que carregam a mutação do driver oncogênico e a contaminação limitada por células epiteliais normais das vias aéreas devem ser cuidadosamente avaliadas. Desafios no estabelecimento do NSCLC podem favorecer o crescimento das células epiteliais normais das vias aéreas7. Copiar perfis de números ou abordagens baseadas em PCR e sequenciamento para confirmar a presença das mutações oncogênicas do driver são os métodos escolhidos para garantir a qualidade das culturas organoides do NSCLC.
Modificações e solução de problemas do método Os fatores de crescimento da mídia e dos respectivos fatores de crescimento adicionados às soluções básicas de mídia podem impactar significativamente a resposta de medicamentos a inibidores direcionados. Eles ativam receptores de bypass e vias de sinalização que influenciam e limitam a resposta a drogas (por exemplo, FGF, HGF, EGF)26. Embora uma mídia rica e personalizada de fator de crescimento possa ser ideal para a expansão da cultura organoide, a escalada de medicamentos e avaliações de sensibilidade devem ser realizadas em uma mídia de fator de crescimento reduzida, como descrito acima. Isso se baseia na experiência interna comparando diferentes formulações de mídia e dados de resposta a medicamentos (Figura 3C). Embora as soluções de mídia possam afetar o grau de sensibilidade a certos tratamentos medicamentosos e podem mudar os valores do IC50, fenótipos robustos de sensibilidade ou resistência são aparentes independentemente da formulação da mídia (Figura 3C,D). Além disso, recomenda-se a consistência geral na formulação de mídia e o perfil das respostas de medicamentos em culturas organoides, e uma quantidade igual ou superior a quatro réplicas técnicas por concentração precisa ser semeada. Isso é particularmente importante para faixas de benchmark em sensibilidade versus. resistência para o Inibidor de Interesse.
Limitações do método O protocolo aqui apresentado descreve a sensibilidade dos modelos organoides de câncer NSCLC 3D aos inibidores direcionados quando as células cancerígenas derivadas do paciente são cultivadas. Experimentos adicionais, incluindo análise farmacodinâmica sobre a inibição da via e análise de sequenciamento para a presença do oncogene do motorista e mutações secundárias, são necessários para uma caracterização detalhada da resistência e sensibilidade medicamentosas. Além disso, fatores de espectadores como estímulos microambientais derivados de interações ou fatores secretados por células não cancerígenas no microambiente tumoral não são contabilizados, e novos protocolos são necessários quando modelos organoides de co-cultura com células imunes ou estromais são tentados. Trabalhos recentes têm destacado o uso de modelos organoides para recapitular interações de microambientes tumorais e respostas de perfil a inibidores de checkpoint imunológico, como o tratamento anti-PD-L1113,31.
A significância do método em relação aos métodos existentes/alternativos Modelos organoides de câncer 3D recapitulam a diversidade genética e os determinantes da resposta ao tratamento presentes no tumor original4,5,6. Notavelmente, a heterogeneidade espacial e temporal pode promover a evolução do tumor, e o surgimento paralelo e o desenvolvimento sequencial de subclonas tumorais podem ocorrer32,33. A heterogeneidade intratumor é significativa para a seleção de células tumorais mais resistentes sob pressão terapêutica9,34,35. O protocolo aqui fornecido permite uma rápida avaliação das sensibilidades ao tratamento com inibidores direcionados em amostras próximas ao paciente. Assim, os modelos organoides têm vantagens sobre modelos de linha celular homogênea mais convencionais sem diversidade genética ou estudos de longo prazo usando linhas celulares ou xenoenxertos derivados do paciente. Além disso, o presente protocolo permite escalar até múltiplos braços de tratamento e abordagens de tratamento combinacional com poucas limitações quanto ao custo e capacidade analítica. Como tal, adicionar uma segunda droga de interesse em uma dose fixa, enquanto escala o inibidor principalmente direcionado e comparando-o com a escalada do inibidor principalmente direcionado sozinho permite avaliar eficientemente os efeitos combinatórios potenciais e com a biomassa adicional mínima necessária (Figura Suplementar 3). Comparado com avaliações baseadas em imagens usadas para monitorar o desenvolvimento organoide e a resposta a medicamentos, o ensaio de sobrevivência celular baseado em luminescência descrito aqui tem sensibilidade semelhante com equipamento mínimo e treinamento necessário.
Importância e aplicações potenciais do método em áreas específicas de pesquisa O desenvolvimento de um pipeline padronizado que permite estabelecer modelos organoides de câncer a partir de amostras de pacientes e as sensibilidades subsequentes das drogas têm um potencial de aplicabilidade clínica significativo. O perfil farmacológico ex vivo ganhou reconhecimento na detecção de vulnerabilidades e características associadas à resistência em tumores, correlacionando-se com a resposta ao tratamento em pacientes36,37. Significativamente, o perfil ex vivo de sensibilidades medicamentosas pode auxiliar na seleção do tratamento na clínica e no desenho de tratamentos combinacionais racionais que abordam mecanismos de resistência. No geral, essa abordagem poderia ajudar a permitir melhores estratégias personalizadas para terapia molecular ou regimes de tratamento combinatório. Este último pode ajudar a direcionar os mecanismos de tolerância e resistência de medicamentos precocemente e aprofundar a resposta clínica para melhorar os resultados dos pacientes no futuro.

Terapias personalizadas contra motoristas oncogênicos revolucionaram o tratamento do câncer, melhorando a sobrevivência do paciente e reduzindo os efeitos colaterais mediados pelo tratamento1. Os recentes avanços nas tecnologias de diagnóstico molecular e sequenciamento têm destacado a complexidade dos tumores humanos, com heterogeneidade espacial e temporal impactando a resposta ao tratamento2. Recapitulando essas diferenças subclonais nos modelos de cultura celular tem sido limitado a investigar alterações selecionadas de interesse em linhas celulares uniformes. Modelos de PDO 3D recém-desenvolvidos gerados a partir de biópsias tumorais ou ressecções tumorais cirúrgicas permitem uma melhor representação da complexidade celular e sinalização de crosstalk dentro do tecido tumoral derivado do paciente3. Como tal, organoides tumorais derivados do câncer gastrointestinal e pancreático foram gerados com sucesso e recapitulam a diversidade genética e os determinantes da resposta ao tratamento4,5,6. No câncer de pulmão não-pequeno celular (NSCLC), os desafios de desenvolvimento organoide e estabelecimento são reconhecidos, e a otimização de técnicas de cultura e fatores de mídia seletivas é necessária para permitir o uso mais amplo e sistemático de PDOs NSCLC no futuro7,8.
Desenvolver terapias combinatórias direcionadas às células tumorais residuais que resistem ao tratamento medicamentoso inicial é essencial para inibir o desenvolvimento da resistência e, em última instância, melhorar a sobrevivência do paciente9. Dada a complexidade arquitetônica das culturas organoides, os parâmetros clássicos de resposta a drogas precisam ser otimizados para permitir testes precisos e reprodutíveis de sensibilidades medicamentosas. Leituras baseadas em imagens10,11 e ensaios de viabilidade celular clássica que medem a abundância de ATP celular6,12, entre outras técnicas, estão disponíveis para perfilar respostas de medicamentos nas culturas de PDO. Aqui, desenvolvemos e descrevemos um protocolo padronizado para avaliar sensibilidades medicamentosas à terapia direcionada contra motoristas clínicos conhecidos em modelos PDO NSCLC.

<table><tbody><tr><td>Tubos de 1,5 mL Tubos de</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>centrífuga de 15 mL Sistema</td><td></td><td></td><td></td></tr> de <tr><td>Filtro de Vácuo/Garrafa de Armazenamento de 500 mL, 0,2 &micro; m Poro 33,2 cm2 Membrana</td><td>de Nylon Corning</td><td>430773</td><td>para ambos os meios</td></tr><tr><td>96-Well, Cell Culture-Treated, Flat Clear Bottom Black Microplate</td><td>Corning</td><td>3904</td><td></td></tr><tr><td>96-Well, Cell Culture-Treated, Solid White Flat-Bottom Microplate</td><td>Corning</td><td>3917</td><td></td></tr><tr><td>A-8301</td><td>Tocris Bioscience</td><td>293910</td><td>para ambos os meios</td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F-12</td><td>Gibco</td><td>12634010</td><td>para LGM</td></tr><tr><td>B27</td><td>Life Technologies</td><td>12587010</td><td>para ambas as mídias</td></tr><tr><td>BioRender 2021</td><td>https://biorender.com/</td><td></td> <td>software de ilustração científica online</td></tr><tr><td>BME2 (Extrato de Membrana do Porão Cultrex RGF, Tipo 2)</td><td>R& D Systems</td><td>353301002</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora de cultura de células (37 &deg; C, 5% CO2)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CellTiter-Glo Ensaio de Viabilidade de Células 3D</td><td>Promega</td><td>G9682</td><td>3D-CTG reagente de leitura</td></tr><tr><td>Centrífuga com tubos</td><td></td><td></td><td></td>de centrífuga de 15 mL</tr><tr><td>Desoxirribonuclease I (DNAse I)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>18047019</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco</td><td>Corning</td><td>MT21031CV</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12, suplemento GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>10565018</td><td>para GM</td></tr><tr><td>GlutaMax</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td>para LGM</td></tr><tr><td>GraphPad Software Prism (versão 9.2.0)</td>Software de <td>análise estatística</td> <td>GraphPad</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td>para ambos os meios</td></tr><tr><td>hFGF-10</td><td>PeproTech</td><td>100-26-100ug</td><td>para GM</td></tr><tr><td>hFGF-7</td><td>PeproTech</td><td>100-19-50ug</td><td>para GM</td></tr><tr><td>hNoggin</td><td>PeproTech</td><td>120-10C-100ug</td><td>para ambos os meios</td></tr><tr><td>hRspondin</td><td>PeproTech</td><td>120-38-100ug</td><td>para pontas de</td></tr><tr><td>pipeta GM de baixa retenção, 20 &micro; L (P20)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>2149P-05-HR</td><td></td></tr><tr><td>Ponteiras de pipeta de baixa retenção, 200 &micro; L (P200)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>2069-05-HR</td><td></td></tr><tr><td>Pontas de pipeta de comprimento regular, 1000 &micro; L (P1000)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>2179-HR</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta</td><td></td><td></td><td></td>multicanal</tr><tr><td>N-Acetilcisteína</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-424-777</td><td>para ambos os meios</td></tr><tr><td>Nicotinamida</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N0636-100G</td><td>para ambos os meios</td></tr><tr><td>Osimertinib</td><td>Selleck Checm</td><td>S7297</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina-Glutamina</td><td>Gibco</td><td>10378016</td><td>para</td></tr><tr><td>LGM Penicilina / Estreptomicina</td><td>Cytiva HyClone</td><td>SV30010</td><td>para</td></tr><tr><td>Pipetas GM (tamanhos diferentes)</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Leitor de placas</td><td>Molecular Devices</td><td>SpectraMax M5</td><td>equipamento, leitores alternativos podem ser usados</td></tr><tr><td>Primocin</td><td>Invivogen</td><td>ant-pm-1</td><td>para GM</td></tr><tr><td>SB202190</td><td>Selleck Chem</td><td>S1077</td><td>para GM</td></tr><tr><td>TrypLE Express Enzyme</td><td>Gibco</td><td>12604021</td><td></td></tr><tr><td>Bomba de vácuo e tubulação</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vi-CELL XR Cell Cell Analyzer</td><td>/ contador de células</td> <td>Beckman Coulter</td><td>Vi-CELL XR</td></tr></tbody></table>

sensibilidade de perfil a terapias-alvo em organoides derivados do paciente nsclc egfr-mutant

Profiling Sensitivity to Targeted Therapies in EGFR-Mutant NSCLC Patient-Derived Organoids

Novas culturas organoides de câncer 3D derivadas de amostras clínicas de pacientes representam um importante sistema modelo para avaliar a heterogeneidade intratumor e a resposta ao tratamento a inibidores direcionados no câncer. O trabalho pioneiro em cânceres gastrointestinais e pancreáticos destacou a promessa de organoides derivados do paciente (PDOs) como um sistema de cultura proximate do paciente, com um número crescente de modelos emergindo. Da mesma forma, o trabalho em outros tipos de câncer tem focado no estabelecimento de modelos organoides e na otimização de protocolos culturais. Notavelmente, os modelos organoides de câncer 3D mantêm a complexidade genética dos espécimes originais do tumor e, assim, traduzem dados de sequenciamento derivados do tumor em tratamento com terapias-alvo geneticamente informadas em um ambiente experimental. Além disso, os PDOs podem fomentar a avaliação de tratamentos de combinação racional para superar a adaptação associada à resistência dos tumores no futuro. Este último se concentra em intensos esforços de pesquisa em câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC), pois o desenvolvimento de resistência limita o sucesso do tratamento de inibidores direcionados. Uma avaliação precoce dos mecanismos terapeuticamente direcionados usando PDOs NSCLC poderia ajudar a informar tratamentos de combinação racional. Este manuscrito descreve um protocolo padronizado para a avaliação baseada em placas de cultura celular de sensibilidades medicamentosas a inibidores direcionados em PDOs 3D derivados do NSCLC, com potencial adaptabilidade a tratamentos combinados e outras modalidades de tratamento.

Foram observados desafios consideráveis no estabelecimento de organoides NSCLC7. Assim, é emocionante ver trabalhos recentes estabelecendo organoides de câncer de pulmão e usando-os para ensaios de tratamento medicamentoso20,21,22. As mutações EGFR representam 11,3% dos casos de NSCLC23. O tratamento direcionado com inibidores de EGFR representa a opção de tratamento de primeira linha no NSCLC mutante EGFR e melhorou a segurança geral de sobrevivência e tratamento em pacientes24. Este trabalho determinou a sensibilidade ao inibidor de tyrosina quinase aprovado pela FDA osimertinib24,25 em organoides NSCLC mutantes EGFR. Os organoides NSCLC mutantes do EGFR foram gerados a partir de ressecção cirúrgica ou amostras de biópsia tumoral de pacientes do NSCLC e confirmados para abrigar a mutação oncogênica indicada pelo sequenciamento de DNA. Como descrito acima, os modelos organoides NSCLC mutantes do EGFR foram tratados com doses crescentes de viabilidade de osimertinib e PDO avaliadas pela leitura de sobrevivência celular baseada em luminescência cinco dias após o início do tratamento. Enquanto os organoides th107 mutantes EGFR (EGFRdel19)positivos mostraram sensibilidade ao tratamento de osimertinibe com concentração inibitória semi-máxima (IC50) de 56 nM (Figura 2 A), EGFR-mutante (EGFRL858R)-positivos organoides TH116 foram resistentes ao tratamento de osimertinibe com ic50 de mais de 1 μM (Figura 2B). A sensibilidade do NSCLC TH107 TH107 positivo do EGFRdel19 foi acompanhada por alterações transcricionais significativas, incluindo a redução da expressão de assinaturas genéticas associadas ao ciclo celular e o aumento da expressão de assinaturas genéticas associadas à apoptose (Figura Suplementar 2A,B). Como referência, são apresentados dados de resposta para a sensível linha celular NSCLC NSCLC sensível PC9 (Figura 3A,B). Este último inclui a análise de sobrevivência para a escalada de doses de osimertinibe por um ensaio de sobrevivência baseado em luminescência 2D (Figura 3A) e o estudo da supressão de sinalização no nível de sinalização EGFR-MAPK por mancha ocidental (Figura 3B). No geral, esses dados destacam a precisão do presente protocolo para determinar a resposta a medicamentos e distinguir entre modelos sensíveis e resistentes do PDO NSCLC. Novas análises do organoide TH116 TH116 th116 positivo e amostras clínicas disponíveis são necessárias para determinar possíveis alterações associadas à resistência.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63039/63039fig02.jpg"> Figura 2: Curva de resposta ao tratamento dos modelos organoides NSCLC mutantes egfr-mutantes à escalada de osimertinibe. (A) Resposta osimertinibe no modelo organoide TH107 NSCLC sensível EGFRdel19-positivo. (B) Resposta osimertinibe no modelo organoide resistente EGFRL858R-positivo TH116 NSCLC. Os pontos de dados são apresentados como valores normalizados mostrando o desvio médio +/- padrão, com uma curva de regressão não linear instalada através dos dados. TH107, n = 6 réplicas técnicas por ponto de dados. TH116, n = 4 réplicas técnicas por ponto de dados. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63039/63039fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63039/63039fig03.jpg"> Figura 3: Dados comparativos para a resposta ao tratamento ao osimertinibe em uma linha celular EGFR-mutante sensível NSCLC e modelos organoides cultivados em diferentes mídias. (A) Resposta osimertinibe na sensível linha celular NSCLC sensível EGFRdel19-positivo PC9, determinada pelo ensaio padrão 2D-CTG. (B) Supressão de sinalização nas células PC9 após tratamento de dois dias com osimertinibe (2 μM). (C) Resposta osimertinibe na sensível cultura de modelo organoide TH330 NSCLC sensível na mídia LGM e GM. (D) Resposta osimertinibe no modelo organoide resistente AZ021 NSCLC em mídia LGM e GM. A confirmação da mutação oncogênica EGFRL858R em AZ021 falhou e pode ser causal pela falta de resposta osimertinibe. Para A e C-D, os pontos de dados são apresentados como valores normalizados mostrando o desvio padrão médio +/- padrão, com uma curva de regressão não linear instalada através dos dados. PC9, n = 3 réplicas técnicas por ponto de dados. TH330, n = 5 réplicas técnicas por ponto de dados. AZ021, n = 6 réplicas técnicas por ponto de dados. Um teste de classificação de Wilcoxon foi realizado em dados normalizados para determinar a significância estatística. Para TH330 (C), LGM vs. GM, ** p = 0,0078. Para AZ021 (D), LGM vs. GM, ns p = 0,0742. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63039/63039fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Figura suplementar 1: Resultados representativos do analisador celular para contagem e avaliação de viabilidade dos modelos organoides mutantes EGFR. TH107 e TH107BC referem-se a diferentes modelos organoides e A e B a réplicas biológicas. Para cada modelo e replicação biológica, são contadas três réplicas técnicas; todos mostram ≥95% de viabilidade. Uma imagem representativa durante a contagem de células é apresentada à direita, mostrando viabilidade robusta e dissociação de células únicas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63039/Suppl-Fig1-R2.pdf" target="_blank">Clique aqui para baixar este Arquivo.</a>
Figura suplementar 2: Análise de enriquecimento de conjunto genético (GSEA) utilizando dados de sequenciamento de RNA em massa obtidos para organoides EGFR-mutante TH107 NSCLC, comparando controle não tratado (DMSO) e células tratadas com Osimertinib por 3 dias (OSI_D3). (A-B) Após o tratamento direcionado, as células sensíveis sofrerão a prisão do ciclo celular G1 e cessarão a proliferação ativa. Como uma expressão de genes do ciclo celular G2M está associada à proliferação ativa, espera-se um enriquecimento nominal de expressão no controle não tratado (DMSO). Para os genes relacionados à apoptose, espera-se um enriquecimento nominal em células tratadas (OSI_D3). Ambos foram confirmados no modelo organoide EGFR-mutante TH107 NSCLC tratado com Osimertinib: (A) GSEA para assinatura de expressão Hallmark G2M (esquerda) mostra enriquecimento em células tratadas com DMSO. Pontuação nominal de enriquecimento (NES): +1.708, FDR &lt; 0,0001. (B) GSEA para assinatura de expressão de Apoptose Hallmark (à direita) mostra enriquecimento em células tratadas com Osimertinib. NES: -1.075, FDR: ns, 0,3275. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63039/Suppl-Fig2-R2.pdf" target="_blank">Clique aqui para baixar este Arquivo.</a>
Figura suplementar 3: Tratamento medicamentoso combinatório no modelo organoide EGFR-mutante TH330 tratado com escalada osimertinibe na presença de um segundo inibidor aditivo em uma concentração fixa. Alterações associadas à resistência no NSCLC mutante EGFR, ou seja, ativação SRC e AXL26,27,28, foram alvo farmacológicos por tratamento combinatório com o inibidor de SRC Saracatinib (100 nM) ou inibidor de AXL R428 (500 nM), n = 6 réplicas técnicas por ponto de dados. Ambos os tratamentos combinatórios resultaram em aumento da resposta ao tratamento, com significância para a combinação de Osimertinib com o inibidor de SRC Saracatinib. A significância estatística foi avaliada pelo teste de classificação de Wilcoxon: Osimertinib versus Osimertinib + Saracatinib, *p = 0,0195; Osimertinib vs. Osimertinib + R428, ns, p = 0,2500. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63039/Suppl-Fig3-R2.pdf" target="_blank">Clique aqui para baixar este Arquivo.</a>
Tabela suplementar 1: Mudança do tamanho organoide da semeadura (d0) para 7 dias após o tratamento (d7). (A) Desenvolvimento de crescimento em EGFRdel19-positivo NSCLC organoid TH107. (B) Desenvolvimento de crescimento em EGFRL858R-positivo NSCLC organoide TH330. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63039/63039_Supplementary%20Table%201.xlsx" target="_blank">Clique aqui para baixar esta Tabela.</a>

Este protocolo descreve uma avaliação padronizada da sensibilidade medicamentosa a inibidores de sinalização direcionados em modelos organoides derivados do paciente NSCLC.

Sensibilidade de perfil a terapias-alvo em organoides derivados do paciente NSCLC EGFR-Mutant

Novel 3D cancer organoid cultures derived from clinical patient specimens represent an important model system to evaluate intratumor heterogeneity and ...

Este protocolo é significativo porque trabalhar com sucesso com organoides está nos detalhes, e o campo está faltando protocolos claros e detalhados para outros construirem. A maior vantagem dessa técnica é a escala de tempo, os baixos requisitos de biomassa e a escalabilidade de baixo custo. Embora muito mais trabalho seja necessário, essa técnica poderia ajudar a melhorar o tratamento do câncer de pulmão, permitindo o teste de terapias individuais ou combinadas mais precisas que poderiam ser traduzidas clinicamente.O maior desafio é lidar com o BME2, amplamente conhecido como Matrigel. Recomendo fortemente praticar a pipetação e manuseio líquido BME2 antes de introduzir seus preciosos organoides. Comece dissociando a cultura organoide BME2 submersa, aspirando cuidadosamente a mídia das placas culturais evitando tocar a cultura.Trypsinize a cultura organoide BME2 submersa com uma enzima recombinante adequada adicionando dois mililitros de enzima recombinante por poço em uma placa de seis poços. Quebrar mecanicamente o BME2, escaneando repetidamente para cima e para baixo e incubar placas a 37 graus Celsius na incubadora de cultura celular por cinco minutos. No final da incubação, transfira a suspensão para um tubo de centrífuga de 15 mililitros e centrífuga a 600 vezes G durante cinco minutos em temperatura ambiente.Aspire a enzima recombinante supernace cuidadosamente sem tocar a pelota organoide e resuspende a pelota organoide em meio de crescimento. Depois de adicionar DNase 1, incubar a suspensão por cinco minutos em temperatura ambiente e centrífuga a 600 vezes G por três minutos em temperatura ambiente. Descarte a mídia cuidadosamente sem tocar na pelota organoide e resuspenque a pelota em um novo meio de crescimento.Pré-aqueça uma nova placa de fundo claro preto 96 bem a 37 graus Celsius na incubadora de cultura celular por 10 minutos, em seguida, prepare uma suspensão celular em PBS para contar as células usando um analisador de células. Após calcular o volume de suspensão celular necessário para o experimento, aliquot as células de suspensão unicelular e pelota para baixo por centrifugação como demonstrado anteriormente. Uma vez que a mídia é descartada, mantenha as células no gelo por aproximadamente um minuto antes de reutilizar no BME2.Incline a placa de fundo claro preto pré-aquecida 96 em direção ao corpo e semeee cinco microliters de suspensão celular por poço, seguido pela semeadura das cúpulas celulares na posição das seis horas do poço. Encha os poços externos na borda da placa 96 com PBS e semee as cúpulas celulares nos poços internos restantes. Incubar cúpulas celulares recém-semeadas na capa de fluxo laminar da cultura celular por cinco minutos sem mover a placa, em seguida, transferir a placa para a incubadora de cultura celular para incubação a 37 graus Celsius por 10 minutos.Adicione cuidadosamente 100 microlitros de meio de crescimento por poço a todos os poços que contêm organoides e 100 microlitros de PBS aos poços externos na borda da placa. Cultura os organoides a 37 graus Celsius durante sete dias, mudando a mídia de acordo com as instruções mencionadas no manuscrito do texto, inspecionando o crescimento de organoides sob o microscópio leve regularmente. Prepare uma diluição de drogas em série em mídia de fator de baixo crescimento para osimertinibe para tratar organoides mutantes mutantes mutantes não-células organoides.Inclua um controle negativo adicionando mídia de fator de baixo crescimento e DMSO de 0,1%. Gire a placa organoide no sentido horário em 180 graus de tal forma que os organoides agora estejam na posição das 12 horas e aspiram cuidadosamente a mídia de crescimento usando um aparelho multicanal de preferência. Adicione 100 microliters de controle ou solução de drogas por poço.Incubar organoides tratados novamente a 37 graus Celsius na incubadora de cultura celular por cinco dias. Comece a realizar o ensaio de sobrevivência descongelando o reagente durante a noite a quatro graus Celsius. Equilibre o reagente em um banho de água à temperatura ambiente por 30 minutos antes do uso e misture invertendo.Adicione 100 microliters do reagente a cada poço e misture bem por pipetar para cima e para baixo com a ponta de pipeta colocada na posição da cúpula organoide. Incubar por cinco minutos à temperatura ambiente no escuro. Usando uma pipeta multicanal, transfira aproximadamente 150 microliters do lysate para uma nova placa de fundo opaca 96 e, em seguida, incubar a placa por mais 25 minutos à temperatura ambiente no escuro.Regissão de gravação usando um leitor de placas ELISA. Salve os dados em um formato de tabela de dados apropriado contendo todas as leituras e gravações brutas do layout da placa e das drogas utilizadas. Os organoides th107 positivos EGFR-mutantes mostraram sensibilidade ao tratamento osimertinibe com uma concentração inibitória meia maximal de 56 nanomolar, enquanto os organoides TH116 positivos EGFR-mutantes eram resistentes ao tratamento de osimertinibe com uma concentração inibitória meio máxima de maior que um micromolar.A sensibilidade das células cancerígenas de pulmão th107 não-totalmente células-positivas foi acompanhada por alterações transcricionais significativas, incluindo uma redução na expressão de assinaturas genéticas associadas ao ciclo celular e um aumento na expressão da assinatura genética associada à apoptose. A resposta do sensível EGFR-mutante TH330 aos inibidores direcionados é significativamente impactada na mídia de crescimento versus mídia de fator de baixo crescimento. Tratamentos combinatórios em EGFR-mutante positivo TH330 resultaram em aumento da resposta ao tratamento.Essa abordagem melhora estratégias personalizadas para terapia molecular ou regimes de tratamento combinatório. Este último ajuda a direcionar os mecanismos de tolerância e resistência medicamentosos precocemente para aprofundar a resposta clínica e melhorar os resultados dos pacientes.

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

Pesquisa sobre o Câncer

Apresentado aqui é um protocolo para estudar as respostas farmacológicas em organóides epitelia da próstata. Organóides se assemelham à biologia in vivo e recapitulam a genética do paciente, tornando-os sistemas modelo atraentes. Organóides da próstata podem ser estabelecidos a partir de próstatas wildtype, modelos de camundongos geneticamente modificados, tecido humano benigno, e câncer de próstata avançado.

Culturas organóides da próstata como ferramentas para traduzir genótipos e perfis mutacionais para respostas farmacológicas

Um método é descrito para criar organoides usando xenoenxertos derivados do paciente (PDX) para triagem in vitro, resultando em pares combinados de modelos in vivo/in vitro. Os tumores PDX foram colhidos/processados em pequenos pedaços mecanicamente ou enzimáticamente, seguidos pelo método dos Clevers para cultivar organoides tumorais que foram passagem, criopreservados e caracterizados contra o PDX original.

Criando pares de modelos derivados do paciente in vivo/in vitro de PDX e Organoides Derivados de PDX para pesquisa de farmacologia do câncer

Um sistema de ensaio in vitro de alta throughput foi desenvolvido para avaliar drogas anticancerígenas usando organoides tumorais derivados do paciente (PDOs), semelhantes aos tecidos cancerígenos, mas são inadequados para sistemas de ensaio in vitro de alto rendimento com placas de 96 poços e 384 poços.

Ensaio in vitro de alta produtividade usando organoides tumorais derivados do paciente

Este protocolo descreve um método semi-automatizado para rastreios de drogas organoides de médio a alto rendimento e software de análise de imagem automatizado e agnóstico ao microscópio para quantificar e visualizar respostas multiparamétricas de drogas organoides únicas para capturar a heterogeneidade intratumoral.

Triagem de Drogas Organoides Tumorais Multiparamétricas Usando Imagem de Células Vivas de Campo Amplo para Análise a Granel e Organoide Único

Este protocolo descreve os principais passos para gerar e caracterizar organoides 3D oro-esofágicos murinos que representam lesões normais, pré-neoplásicas e de carcinoma espinocelular induzidas por carcinogênese química.

Modelagem do carcinoma epidermóide orco-esofágico em organoides 3D

O aumento de biomarcadores moleculares a serem testados para o manejo do cuidado do câncer de pulmão não pequenas células não escamosas (CPNPC-NS) tem impulsionado o desenvolvimento de métodos de detecção molecular rápidos e confiáveis. Descrevemos um fluxo de trabalho para avaliação de alterações genômicas para pacientes com CPNPC-NS usando uma abordagem de sequenciamento de próxima geração (NGS) ultrarrápida.

Sequenciamento de última geração baseado em amplicon ultrarrápido em câncer de pulmão de células não pequenas não escamosas

Aqui, descrevemos um protocolo abrangente para gerar e utilizar organoides de glioblastoma projetados em laboratório (LEGO) para investigar dependências genótipo-fenótipo e rastrear possíveis medicamentos para tratamento de glioblastoma.

Cultura de organoide de glioblastoma projetada em laboratório e triagem de drogas

Este protocolo descreve um método simplificado para gerar organoides de carcinoma hepatocelular, aplicar tratamento medicamentoso e realizar sequenciamento de RNA unicelular antes e depois do tratamento para caracterizar alterações transcricionais associadas ao tratamento.

Geração e Análise Transcriptômica de Célula Única de Organoides de Carcinoma Hepatocelular após Tratamento Medicamentoso

Utilizando tumores derivados do paciente em um modelo pré-clínico subcutânea é uma excelente maneira de estudar a eficácia de novas terapias, a descoberta de biomarcadores preditivos, e vias resistentes aos medicamentos. Este modelo, no processo de desenvolvimento de medicamentos, é essencial para determinar o destino de muitas terapias anti-cancro novos antes da investigação clínica.

Desenvolvimento e manutenção de um tumor do paciente pré-clínica Derivado Xenoenxerto Modelo de Investigação de Novel Anti-Cancer Therapies

O seguinte protocolo incide sobre o estabelecimento de uma cultura primária de sarcoma de tecidos moles paciente-derivado (STS). Este modelo pode nos ajudar a compreender melhor o fundo molecular e perfil farmacológico destas malignidades raras e poderia representar um ponto de partida para novas pesquisas que visam melhorar a gestão do STS.

Estabelecimento de uma cultura primária de Sarcoma macio do tecido derivado de paciente

Aprenda a avaliar a sensibilidade a fármacos em organoides de câncer de pulmão derivados de pacientes usando ensaios de viabilidade celular. Este protocolo aprimora estratégias de tratamento personalizado em oncologia.

Sensibilidade de perfil a terapias-alvo em organoides derivados do paciente NSCLC EGFR-Mutant

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