Dissecção crio-seção da zona subependímal adulta para análise proteome quantitativa precisa e profunda

Nosso método de dissecção permite o isolamento preciso do nicho neurogênico ventricular e, portanto, é adequado para estudar o microambiente molecular desse nicho. A principal vantagem deste método de dissecção é que ele é preciso, eficiente e causa perturbação mínima do tecido enquanto ainda é compatível com espectrometria de massa para análise de proteome. Neste protocolo, extraímos o nicho neurogênico do ventrículo de um cérebro de camundongo, mas esse método também pode ser aplicado a outras espécies e em vários estados de saúde e doença.

A técnica pode exigir algum treinamento. especialmente com os cortes de bisturi ao expor e extrair o nicho neurogênico ventricular. Depois de eutanásia um rato macho c57 preto/6 de 8 a 10 semanas, extraia o cérebro por dissecção manual e coloque-o em um prato de cultura contendo meio de dissecção gelada.

Usando um bisturi, remova a lâmpada olfativa ao fazer um corte coronal reto entre a lâmpada olfativa e o polo interior do córtex. Em seguida, remova o polo anterior do córtex fazendo um corte coronal, garantindo que os ventrículos laterais sejam visíveis no plano coronal. Em seguida, usando uma tesoura, abra os ventrículos laterais do topo, começando com a seção sagital da superfície cortical até o lúmen ventricular.

Alongue este corte de forma C após a flexão ventricular. Em seguida, conecte as extremidades caudal da incisão sagital esquerda e direita, empregando um corte coronal adicional. Em seguida, remova o córtex e o caloso corpus cobrindo as paredes ventriculares medial.

Se o tecido estiver preso às paredes ventriculares medial, faça cortes adicionais ou levante o córtex e o caloso corpus com uma tesoura para desalojar o tecido. Em seguida, usando fórceps, remova o córtex e o corpo caloso cobrindo os ventrículos laterais. Usando fórceps, espalhe cuidadosamente as paredes ventriculares e remova o plexo coroide.

Em seguida, coloque o cérebro em um slide de vidro e coloque o slide em cima de gelo seco para congelar o cérebro com as paredes ventriculares na configuração aberta. Antes de separar, certifique-se de que o cérebro está preso à placa de apego criostat no cérebro traseiro com um meio de incorporação para tecidos congelados. Além disso, certifique-se de que nenhum meio de incorporação entre em contato com o cérebro da fore, especialmente nos ventrículos.

Em seguida, corte seções coronais de 50 a 100 micrômetros de espessura do cérebro até o final do ventrículo lateral, e monte as seções nas lâminas de vidro. Coloque os slides de vidro em gelo seco sob um microscópio de dissecção. Levante as fatias do gelo seco por 15 a 30 segundos para obter um breve e incompleto descongelamento, tornando a mielina compacta do estriatum observável como pontos brancos densos.

Em seguida, usando um bisturi pré-resfriado, separe a zona subependímal do estriado adjacente, e transfira-a como uma peça inteira ou seccionada em duas a quatro partes em um tubo de microcentrifuge usando a borda cega do bisturi resfriado. Então faça o mesmo para a zona ventricular medial. Cápsulas internas glicoproteínas-positivas associadas à mielina do estriato foram identificadas em amostras de toda a quantidade, mas raramente nas amostras de dissecção crio-seção via imunohistoquímica.

A contaminação estriatal em amostras de todo o montante foi confirmada pelo enriquecimento de proteínas de mielina na zona subependira, em comparação com as amostras de córtex somato-sensorial. Em contraste, as comparações dessas proteínas marcadoras de mielina nas amostras de dissecção crio-seção não mostraram diferenças significativas na zona subependira e nas amostras de córtex somato-sensorial. Ao comparar os resultados da espectrometria de massa entre a dissecção crio-seção e a microdissecção de captura a laser, a microdisseção de captura de laser produziu aproximadamente metade do número de proteínas quantificadas, embora o tempo de coleta de tecidos tenha sido aproximadamente o dobro do tempo.

A análise dos componentes de princípio revela que há maior variabilidade entre as amostras coletadas com microdisseção de captura a laser, retratadas como quadrados, do que entre aquelas coletadas com dissecção crio-seção, retratadas como círculos. Um teste de enriquecimento de anotação 2D entre a dissecção crio-seção e a microdisseção de captura a laser para as zonas ependimal subependmal e medial revelou enriquecimento semelhante em ambos os métodos e regiões para proteínas associadas ao espaço extracelular. A dissecção da crio-seção fornece uma identificação e quantificação mais robusta da neurogênese em proteínas de matriz extracelular subependímica associadas à zona.

No caso da tenascin-C, apenas a dissecção crio-seção exibiu enriquecimento na zona subependímal em comparação com a zona ependímal medial. Certifique-se de que as seções cerebrais nos slides não fiquem completamente descongeladas. No geral, é bom praticar as etapas do procedimento de dissecção para um resultado consistente.

O método de dissecção também pode ser usado com outros métodos de análise de proteínas que podem facilmente detectar proteínas muito baixas e abundantes, como fatores de crescimento e citocinas. Este método de microdisseção nos permitiu identificar um novo regulador de neurogênese, e acreditamos que permitirá que outros identifiquem outros reguladores da neurogênese em vários contextos.