Name: A extração de moléculas de glicogênio hepático para determinação da estrutura do glicogênio (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-08T14:30:00.000+00:00
Duration: 4 min 50 s
Description: Aprenda a extrair glicogênio hepático preservando sua estrutura e minimizando a perda de partículas pequenas. Este método utiliza ebulição para inibir enzimas degradantes, auxiliando pesquisas sobre diabetes e doenças de armazenamento de glicogênio.

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Os autores são gratos ao Sr. Gaosheng Wu e à Sra. Yunwen Zhu pela assistência técnica com a FACE e ao Sr. Zhenxia Hu e ao Sr. Dengbin pela assistência técnica com a SEC. Este trabalho foi apoiado pelo Programa Acadêmico Prioritário das Instituições de Ensino Superior de Jiangsu, uma C1304013151101138 de bolsas da Fundação de Ciências Naturais da China e pelo programa de talentos de Inovação e Empreendedorismo de Jiangsu de 2017. As figuras 1 a 5 foram criadas usando o BioRender.

Fígados de camundongos usados para otimizar este procedimento21 eram de 12 camundongos machos BKS-DB/Nju (7,2 semanas de idade, ver Tabela de Materiais). O uso de animais foi aprovado pelo Renmin Hospital da Universidade de Wuhan Animal Care and Ethics Committee, IACUC Issue No. WDRM 20181113.
1 Tecidos animais
<ol><li>Pesar fígado de camundongo (1-1,8 g de fígado inteiro de cada camundongo).</li>
	<li>Congelar rapidamente o fígado do rato em azoto líquido e armazená-lo a -80 °C.</li>
</ol>2. Preparação do tampão e dos reagentes
<ol><li>Preparar tampão de isolamento de glicogênio contendo 5 mM Tris, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM NaF e 5 mM pirofosfato de sódio com água deionizada e ajustar o pH para 8.</li>
	<li>Preparar solução de sacarose a 30% (p/p) (considerada a mais ideal para o glicogénio hepático21).</li>
	<li>Preparar tampão acetato de sódio (1 M, pH 4,5), tampão ácido acético (0,1 M, pH 3,5), solução de hidróxido de sódio (0,1 M) e cianoborohidreto de sódio (1 M).</li>
	<li>Preparar a solução de 8-aminopireno-1,3,6-trissulfonato (APTS) adicionando 5 mg de APTS a 50 μL de ácido acético glacial a 15%.</li>
	<li>Preparar solução de nitrato de amónio contendo 50 mM de nitrato de amónio com azida sódica a 0,02%.</li>
</ol>3. Extração de glicogênio (Figura 2)
<ol><li>Transferir o tecido hepático congelado (~1 g) para um tubo de 15 mL contendo 6 mL de tampão de isolamento de glicogênio.</li>
	<li>Mantendo no gelo, homogeneizar o tecido hepático usando um homogeneizador de tecido.</li>
	<li>Transferir metade da suspensão (3 mL) para um novo tubo e ferver por 10 min (mostrando-se ideal para estudos estruturais de glicogênio21). Manter a outra metade da suspensão (3 mL) em gelo para extrair glicogênio contendo proteínas associadas que não estejam desnaturadas. NOTA: As amostras não fervidas devem ser sempre mantidas em gelo durante as etapas de extração de glicogênio. Se as proteínas de glicogênio não forem importantes para o estudo, toda a amostra pode passar pela etapa de ebulição de 10 min.</li>
	<li>Retire uma alíquota de 8 μL de cada tubo, mantenha as alíquotas no gelo e utilize-as para a determinação do teor de glicogénio (ver secção 4).</li>
	<li>Centrifugar a suspensão restante a 6.000 × g durante 10 min a 4 °C.</li>
	<li>Transfira os sobrenadantes para tubos de ultracentrífuga e centrifugue-os a 3,6 × 105 g por 90 min a 4 °C.</li>
	<li>Eliminar os sobrenadantes restantes e ressuspender os pellets em 1,5 mL de tampão de isolamento de glicogênio.</li>
	<li>Colocar as amostras sobre 1,5 ml de solução de sacarose a 30% em tubos de ultracentrífuga de 4 ml e centrifugar a 3,6 × 105 g durante 2 h a 4 °C.</li>
	<li>Descarte os sobrenadantes restantes e ressuspenda os pellets em 200 μL de água deionizada.</li>
	<li>Adicionar 800 μL de etanol absoluto às suspensões e misturar bem para precipitar glicogênio23,24. Conservar as misturas a -20 °C durante, pelo menos, 1 h para permitir a precipitação.</li>
	<li>Centrifugar as amostras a 6.000 × g durante 10 min a 4 °C. Descarte os sobrenadantes e ressuspenda os pellets em 200 μL de água deionizada.</li>
	<li>Repetir este processo de precipitação de etanol 3x e ressuspender a pelota final de glicogênio em 200 μL de água deionizada.</li>
	<li>Remova uma alíquota de 8 μL de cada tubo para determinação do teor de glicogénio (ver secção 4).</li>
	<li>Congelar os sobrenadantes restantes em nitrogênio líquido e liofilizar (liofilizar) durante a noite. Conservar as amostras de glicogénio seco no congelador a -20 °C. NOTA: As amostras de glicogénio seco devem ser estáveis a -20 °C; no entanto, não há dados que indiquem quanto tempo duram sem mudanças estruturais.</li>
</ol>4. Determinação do teor de glicogênio (Figura 3)
<ol><li>Adicionar 8 μL dos sobrenadantes de glicogénio (ver secções 3.13 e 3.4), 5 μL de amiloglucosidase (3269 U/ml) e 100 μL de tampão acetato de sódio (1 M, pH 4,5) a um tubo de microcentrífuga e encher o tubo até à marca de 500 μL com água deionizada.</li>
	<li>Preparar controles que usem água deionizada em vez de amiloglucosidase.</li>
	<li>Incubar as amostras a 50 °C durante 30 minutos, mantendo os controlos no gelo.</li>
	<li>Centrifugar a 6.000 × g a 4 °C por 10 min e misturar 300 μL de cada sobrenadante resultante com 1 mL de reagente glucosidase oxidase/peroxidase (GOPOD).</li>
	<li>Construa uma curva de calibração misturando 300 μL de água denionizada contendo 0, 10, 20, 30, 40 e 50 μg de D-glicose com 1 mL de reagente GOPOD.</li>
	<li>Incubar as misturas a 50 °C durante mais 30 minutos.</li>
	<li>Leia a absorbância (510 nm) de cada amostra usando placas de 96 poços (150 μL por poço) usando um espectrofotômetro UV-vis.</li>
	<li>Subtrair as absorbâncias das amostras controle (sem amiloglucosidase) das absorbâncias das amostras experimentais e, em seguida, calcular o conteúdo de glicogênio com base na curva padrão D-glicose.</li>
</ol>5. Rendimento bruto, rendimento de glicogênio e determinação da pureza
<ol><li>Para o rendimento bruto, pesar a amostra de glicogénio liofilizado e calcular o rendimento em percentagem do tecido hepático húmido. NOTA: Este rendimento deve ser ajustado para corrigir as alíquotas tomadas em cada etapa do teor de glicogénio.</li>
	<li>Para a pureza do glicogénio, determinar o teor de glicogénio nos pellets finais, tal como descrito na secção 4. Calcular a pureza em percentagem do teor de glicogénio determinado em relação ao rendimento bruto (ver passo 5.1).</li>
	<li>Para o rendimento de glicogénio, determinar o teor de glicogénio das amostras homogeneizadas sem fervura e antes de qualquer centrifugação, tal como descrito no ponto 4. Calcular o rendimento de glicogénio em percentagem do teor de glicogénio nos pellets finais (ver passo 5.2) em relação ao teor de glicogénio determinado no homogeneizado inicial.</li>
</ol>6. Análise das distribuições de comprimento de cadeia (Figura 4)
<ol><li>Pesar 0,5 mg de glicogénio liofilizado em tubos de 1,5 ml.</li>
	<li>Adicionar 90 μL de água deionizada e 1,5 μL de azida sódica (0,04 g/mL) aos tubos.</li>
	<li>Adicionar 5 μL de tampão ácido acético (0,1 M, pH 3,5) e 2 μL de solução de isoamilase (180 U/mg) aos tubos para desramificar o glicogênio.</li>
	<li>Incubar as amostras a 37 °C durante 3 h.</li>
	<li>Adicionar 5 μL de solução de hidróxido de sódio (0,1 M) às amostras para aumentar o pH para 7,0.</li>
	<li>Congelar as amostras em nitrogênio líquido e liofilizar (liofilizar) durante a noite.</li>
	<li>Adicionar 2 μL de solução de APTS (5 mg de APTS em 50 μL de ácido acético glacial a 15%) e 2 μL de cianoborohidreto de sódio (1 M) ao glicogénio desramificado liofilizado.</li>
	<li>Centrifugar as amostras a 4.000 × g por 2 min.</li>
	<li>Incubar as amostras a 60 °C durante 3 h no escuro. NOTA: O tubo pode ser coberto com papel alumínio para proteger o conteúdo da luz.</li>
	<li>Adicionar 200 μL de água deionizada às amostras e agitá-las até que todo o precipitado esteja dissolvido.</li>
	<li>Centrifugar as amostras a 4.000 × g por 2 min.</li>
	<li>Alíquotas de transferência de 50 μL para microfrascos de eletroforese de carboidratos assistidos por fluoróforo (FACE) para análise. NOTA: Os dados são mostrados como a abundância relativa de cadeias (desramificadas) (Nde(X)) para cada grau de polimerização (DP, símbolo X).</li>
</ol>7. Análise das distribuições moleculares de tamanho (Figura 5)
<ol><li>Dissolver 0,5 mg de glicogênio liofilizado em nitrato de amônio 50 mM e azida sódica a 0,02% a 1 mg/mL.</li>
	<li>Incubar as amostras num termomisturador a 80 °C durante 3 h a 300 rpm.</li>
	<li>Injectar as amostras num sistema SEC utilizando uma pré-coluna e colunas de 1000 Å e 10.000 Å a 80 °C com um caudal de 0,3 ml/min (ver Tabela de Materiais). Use um detector de índice de refração para determinar o peso relativo das moléculas em cada volume de eluição.</li>
	<li>Usando padrões pullulan (PSS) com massas molares variando de 342 a 1,22 × 106, plote uma curva de calibração universal SEC para converter o tempo de eluição em Rh (raio hidrodinâmico). Expresse os dados do detector de índice de refração diferencial (DRI) como uma distribuição de peso de SEC w (log Rh) em função de Rh.</li>
</ol>

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</ol>

Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.

Estudos anteriores mostraram que a estrutura do glicogênio é importante por suas propriedades; Por exemplo, o tamanho molecular afeta a taxa de degradação do glicogênio10, e a distribuição do comprimento da cadeia afeta sua solubilidade26. Para entender adequadamente essas relações, é importante extrair glicogênio com um procedimento que isole, tanto quanto possível, uma amostra representativa e intacta. Os métodos tradicionais de extração utilizavam condições alcalinas que...

O glicogênio é um polímero complexo e hiperramificado de glicose encontrado em animais, fungos e bactérias1. Em mamíferos, o glicogênio hepático funciona como um tampão glicêmico, preservando a homeostase, enquanto o glicogênio muscular atua como um reservatório de glicose de curto prazo para fornecer energia diretamente2. A estrutura do glicogênio é frequentemente descrita por três níveis (mostrados na Figura 1): 1. As cadeias lineares são formadas por monômeros de glicose via ligações glicosídicas (1→4)-α, com pontos de ramificação conectados via ligações glicosídicas (1→6)-α; 2. partículas de β altamente ramificadas (~20 nm de diâmetro) que, especialmente em tecidos como o músculo esquelético, atuam como moléculas independentes de glicogênio 3,4; 3. partículas de glicogênio α maiores (até 300 nm de diâmetro) que consistem em unidades menores de β glicogênio, que são encontradas no fígado5, coração6 e em algumas espécies não mamíferos7. As partículas de α hepáticas de camundongos diabéticos são molecularmente frágeis, com propensão a degradar-se em partículas de β quando dissolvidas em dimetilsulfóxido (DMSO), enquanto as partículas de α de controles não-diabéticos geralmente permanecem inalteradas. Uma hipótese é que essa fragilidade possa exacerbar o pobre balanço glicêmico observado no diabetes, sendo que as partículas frágeis de α potencialmente resultam em maiores proporções da partícula β mais rapidamente degradada 8,9,10,11.
Os métodos tradicionais de extração de glicogênio utilizam as condições relativamente adversas de exposição do tecido hepático a solução alcalinaquente12 ou soluções ácidas como o ácido tricloroacético (TCA)13 ou o ácido perclórico (PCA)14. Embora eficazes em separar o glicogênio de outros componentes do tecido hepático, esses métodos inevitavelmente degradam a estrutura do glicogênio até certoponto15,16. Embora esses métodos sejam adequados para a mensuração quantitativa do conteúdo de glicogênio, eles não são ideais para estudos focados na obtenção de informações estruturais sobre o glicogênio devido a esse dano estrutural. Desde o desenvolvimento desses métodos, um procedimento de extração mais suave tem sido desenvolvido que utiliza tampão Tris frio (que inibe a degradação de glucosidase) com ultracentrifugação com gradiente de densidade de sacarose 17,18,19. Com o pH controlado em ~8, este método não submete o glicogênio à hidrólise ácida ou alcalina observada em procedimentos anteriores.
A ultracentrifugação do gradiente de densidade de sacarose do tecido hepático homogeneizado pode separar as partículas de glicogênio da maioria do material celular. Se necessário, purificação adicional pode ser realizada por cromatografia de exclusão de tamanho preparativo, resultando na coleta de glicogênio purificado com proteínas associadas ao glicogênio anexadas20. Embora esse método, com condições mais brandas, tenha maior probabilidade de preservar a estrutura do glicogênio, é difícil evitar que alguma porção do glicogênio seja perdida no sobrenadante, especialmente partículas menores de glicogênio e menos densas15. Outra causa potencial de perda de glicogênio é que as condições mais brandas permitem alguma degradação enzimática, resultando em rendimentos de glicogênio mais baixos em comparação com métodos de extração mais severos. Pesquisas recentes relataram otimização do método de extração de glicogênio hepático para preservar a estrutura do glicogênio21. Aqui, várias concentrações de sacarose (30%, 50%, 72,5%) foram testadas para determinar se concentrações mais baixas de sacarose minimizavam a perda de partículas menores de glicogênio. A justificativa era que a menor densidade permitiria que partículas menores e menos densas penetrassem na camada de sacarose e se agregassem no pellet com o restante do glicogênio.
Neste estudo, os métodos de extração com e sem uma etapa de ebulição de 10 min foram comparados para testar se as enzimas de degradação de glicogênio poderiam ser desnaturadas, resultando na extração de mais glicogênio que também estava livre de degradação parcial. Distribuições de tamanho molecular total e de comprimento da cadeia glicogênica foram usadas para determinar a estrutura do glicogênio extraído, semelhante a uma otimização de extração de amido publicada anteriormente22. Cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) com detecção de índice de refração diferencial (DRI) foi utilizada para obter as distribuições de tamanho do glicogênio, que descrevem o peso molecular total em função do tamanho molecular. A eletroforese de carboidratos assistida por fluoróforos (FACE) foi utilizada para analisar as distribuições de comprimento de cadeia, que descrevem o número relativo de cadeias glicosídicas de cada tamanho (ou grau de polimerização). Este trabalho descreve a metodologia de extração de glicogênio de tecidos hepáticos baseada em estudo prévio deotimização21. Os dados sugerem que o método mais adequado para preservar a estrutura do glicogênio é uma concentração de sacarose de 30% com uma etapa de ebulição de 10 min.

<table><tbody><tr><td>8-aminopireno-1,3,6-trissulfonato (APTS)</td><td>SIGMA Aldrich</td><td>9341</td><td>0,1 M solução</td></tr><tr><td>Ácido acético</td><td>SIGMA Aldrich</td><td>695092</td><td>0,1 M, solução de pH 3,5</td></tr><tr><td>Agilent 1260 Infinity SEC sistema</td><td>Agilent, Santa Clara, CA, EUA</td><td></td><td>Cromatografia de exclusão de tamanho (SEC)</td></tr><tr><td>BKS-DB/Nju camundongos de fundo</td><td>Nanjing Biomedical Research Institution da Universidade de Nanjing</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kit de ensaio de D-glicose (formato GOPOD)</td><td>Megazyme</td><td>K-GLUC</td><td></td></tr><tr><td>Ácido etilenoditrilotetracético (EDTA)</td><td>SIGMA Aldrich</td><td>431788</td><td></td></tr><tr><td>Homogeneizador</td><td>IKA</td><td>T 25</td><td></td></tr><tr><td>Ácido clorídrico</td><td>SIGMA Aldrich</td><td>2104</td><td>0,1 M solução</td></tr><tr><td>Ácido clorídrico</td><td>SIGMA Aldrich</td><td>2104</td><td>0,1 M solução</td></tr><tr><td>P/ACE MDQ plus system</td><td>Ab Sciex, US</td><td></td><td>Eletroforese de carboidratos assistida por fluoróforo (FACE)</td></tr><tr><td>Detector de índice de refração</td><td>Optilab UT-rEX, Wyatt, Santa Barbara, CA, EUA)</td><td></td><td>Cromatografia de exclusão por tamanho (SEC)</td></tr><tr><td>Acetato de sódio</td><td>SIGMA Aldrich</td><td>241245</td><td>1 M, solução de pH 4,5</td></tr><tr><td>Azida de sódio</td><td>SIGMA Aldrich</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>SIGMA Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>Cianoborohidreto de sódio</td><td>SIGMA Aldrich</td><td>156159</td><td>solução 1 M</td></tr><tr><td>Fluoreto de sódio</td><td>SIGMA Aldrich</td><td>201154</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de sódio</td><td>SIGMA Aldrich</td><td>43617</td><td>0,1 M solução</td></tr><tr><td>Nitrato de sódio</td><td>SIGMA Aldrich</td><td>NISTRM8569</td><td></td></tr><tr><td>Pirofosfato de sódio</td><td>SIGMA Aldrich</td><td>221368</td><td></td></tr><tr><td>Sacarose</td><td>SIGMA Aldrich</td><td>V90016</td><td></td></tr><tr><td>SUPREMA pré-coluna, 1.000 e 10.000 colunas</td><td>Polymer Standards Services, Mainz, Alemanha</td><td></td><td>Cromatografia de exclusão de tamanho (SEC)</td></tr><tr><td>Trizma</td><td>SIGMA Aldrich</td><td>T 1503</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de ultracentrífuga</td><td>Beckman</td><td></td><td>4 mL, tubo ultratransparente de parede fina de topo aberto, 11 x 60 mm</td></tr></tbody></table>

a extração de moléculas de glicogênio hepático para determinação da estrutura do glicogênio

The Extraction of Liver Glycogen Molecules for Glycogen Structure Determination

O glicogênio hepático é um polímero de glicose hiperramificado que está envolvido na manutenção dos níveis de açúcar no sangue em animais. As propriedades do glicogênio são influenciadas por sua estrutura. Assim, um método de extração adequado que isole amostras representativas de glicogênio é crucial para o estudo dessa macromolécula. Comparado a outros métodos de extração, um método que emprega uma etapa de centrifugação por gradiente de densidade de sacarose pode minimizar o dano molecular. Com base nesse método, uma publicação recente descreve como a densidade da solução de sacarose utilizada durante a centrifugação foi variada (30%, 50%, 72,5%) para encontrar a concentração mais adequada para extrair partículas de glicogênio de uma ampla variedade de tamanhos, limitando a perda de partículas menores. Uma etapa de ebulição de 10 minutos foi introduzida para testar sua capacidade de desnaturar enzimas degradadoras de glicogênio, preservando assim o glicogênio. A menor concentração de sacarose (30%) e a adição da etapa de ebulição foram mostradas para extrair as amostras mais representativas de glicogênio.

Embora o procedimento descrito acima seja o mais ótimo (sacarose a 30% com a adição de uma etapa de ebulição de 10min), aqui são fornecidos dados para o glicogênio extraído através de três concentrações de sacarose (30%, 50%, 72,5%), com e sem uma etapa de ebulição, como descrito anteriormente21. Seguindo o protocolo, a pureza, o rendimento bruto e o rendimento de glicogênio do glicogênio seco extraído por diferentes condições são apresentados na Tabela 1, reproduzida a partir de<...

Uma concentração ótima de sacarose foi determinada para a extração de glicogênio hepático usando centrifugação por gradiente de densidade de sacarose. A adição de uma etapa de ebulição de 10 min para inibir enzimas degradadoras de glicogênio mostrou-se benéfica.

A extração de moléculas de glicogênio hepático para determinação da estrutura do glicogênio

Liver glycogen is a hyperbranched glucose polymer that is involved in the maintenance of blood sugar levels in animals. The properties of glycogen are ...

Este protocolo permite a extração das moléculas de glicogênio hepático de forma a preservar sua estrutura e limitar a quantidade de pequenas partículas de glicogênio perdidas. Com pesquisas anteriores mostrando que o diabetes altera a estrutura do glicogênio, este método poderia fornecer no estudo para o diabetes e as várias doenças de armazenamento de glicogênio. Para extrair glicogênio do fígado, comece transferindo um grama de tecido hepático congelado para um tubo de 15 mililitros contendo seis mililitros de tampão de isolamento de glicogênio.Mantendo o gelo, homogeneize o tecido hepático usando um homogeneizador de tecido. Quando terminar, transfira metade ou três mililitros da suspensão celular para um novo tubo, seguido de fervura por 10 minutos. Mantenha a outra metade da suspensão no gelo para extrair proteínas associadas contendo glicogênio que não são desnaturadas.Para a determinação do teor de glicogênio, remova uma alíquota de oito microlitros de cada tubo e mantenha o tubo sobre gelo. Depois de girar a suspensão restante a 6.000 G por 10 minutos a quatro graus Celsius, transfira o sobrenadante para tubos de ultracentrífuga para centrá-los a 3,6 vezes 10 até o quinto G e quatro graus Celsius por 90 minutos. Após descartar os sobrenadantes restantes, ressuspender os pellets em 1,5 mililitros de tampão de isolamento de glicogênio.Em seguida, cobrir as amostras sobre 1,5 mililitros de solução de sacarose a 30% em tubos de ultracentrífuga de quatro mililitros, seguido de centrifugação como descrito anteriormente por duas horas. Após o descarte dos sobrenadantes, ressuspenda os pellets em 200 microlitros de água deionizada. Para precipitar o glicogênio da suspensão celular, adicione 800 microlitros de etanol absoluto às suspensões celulares e misture bem.Em seguida, armazene as misturas a menos 20 graus Celsius por pelo menos uma hora para permitir a precipitação. Uma vez que a precipitação ocorra, centrifugar as amostras a 6.000 G por 10 minutos a quatro graus Celsius e ressuspender o pellet de glicogênio em 200 microlitros de água deionizada para repetir o processo de precipitação de etanol três vezes. Da suspensão celular final, remova uma alíquota de oito microlitros de cada tubo para determinação do conteúdo de glicogênio.Em seguida, congele os sobrenadantes restantes em nitrogênio líquido e liofilize durante a noite. No dia seguinte, armazene as amostras de glicogênio seco no freezer a menos 20 graus Celsius. O estudo analisou a pureza, o rendimento bruto e o rendimento de glicogênio da amostra de glicogênio seco extraída por diferentes condições.Não houve diferenças significativas no rendimento bruto e no rendimento de glicogênio entre os grupos extraídos com as diversas condições. Em contraste, a pureza do glicogênio foi significativamente influenciada pelas concentrações de sacarose e pela adição de uma etapa de ebulição. O glicogênio de maior pureza foi extraído usando a concentração de 30% de sacarose e uma etapa de ebulição de 10 minutos.O glicogênio foi extraído do homogeneizado hepático por 30%50% ou 72,5% de sacarose, fervido ou não fervido, para avaliar os efeitos das várias condições sobre o tamanho das moléculas no extrato final. A análise do comprimento de cadeia foi realizada em seis fígados, tanto fervidos quanto não fervidos, utilizando concentrações de 30%50% e 72,5% de sacarose. O conteúdo das moléculas de glicogênio ou partículas beta com raio hidrodinâmico, RH, menor que 30 nanômetros foi calculado.As amostras fervidas apresentaram menores valores médios de UR e maior teor de partículas do que as amostras não fervidas. Além disso, menores concentrações de sacarose resultaram em menores valores de UR e maiores teores de partículas beta. A introdução de uma etapa de ebulição também levou a menores valores de RH máx ou máxima, enquanto a concentração de sacarose não teve efeito significativo.Certifique-se de que o tecido está totalmente homogeneizado e não há pedaços do tecido restantes. Então, essa técnica abre caminho para explorarmos quais caminhos ligam as partículas beta menores para formar as partículas alfa maiores.

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Neste vídeo, descrevemos um ensaio espectrofotométrico qualitativo para determinar a extensão da ramificação em uma amostra de glicogênio com uma estrutura não caracterizada. A comparação dos máximos de absorbância da amostra não caracterizada com os de polissacarídeos com estruturas ramificadas conhecidas indica a presença de ramificação na amostra não caracterizada.

Ensaio de ramificação de glicogênio para medir o grau de ramificação de glicogênio

Neste vídeo, demonstramos a preparação de amostras de tecido muscular esquelético humano e sua coloração para microscopia eletrônica de transmissão para visualizar e quantificar a distribuição de glicogênio subcelular.

Microscopia eletrônica de transmissão para quantificar a distribuição de glicogênio em músculos esqueléticos humanos

Descrevemos aqui um método bioquímico exato, reprodutível e conveniente para a titulação de glicogênio in vitro. Esta técnica utiliza o kit de ensaio Abcam do glicogénio e é baseado na hidrólise sucessiva de glicogênio a glicose e glicose titulação por fluorescência.

Titulação Bioquímica de glicogênio<em&gt; In vitro</em

A coloração com ácido periódico de Schiff é uma técnica que visualiza o conteúdo de polissacarídeos dos tecidos. Este artigo demonstra o protocolo de coloração de Schiff com ácido periódico adaptado para uso em células mononucleares do sangue periférico purificadas de sangue venoso humano. Essas amostras são enriquecidas para linfócitos e outros glóbulos brancos do sistema imunológico.

Detecção de glicogênio no sangue periférico células mononucleares com Periodic Acid Schiff Coloração

Aqui, apresentamos um ensaio confiável e fácil para medir o teor de glicogênio em células cianobacterianas. O procedimento implica a precipitação, despolimerização selecionável e a detecção de resíduos de glicose. Este método é adequado para ambas as variedades de tipo selvagem e geneticamente modificado e pode facilitar a engenharia metabólica de cianobactérias.

Determinação do conteúdo de glicogênio em cianobactérias

Técnicas para medir a atividade de enzimas-chave do metabolismo do glicogênio são apresentadas, usando um espectrofotômetro simples operando na faixa visível.

Métodos espectrofotométricos para o estudo do metabolismo do glicogênio eucariótico

Um procedimento pós-fixação modificado aumenta o contraste das partículas de glicogênio no tecido. Este artigo fornece um protocolo passo-a-passo descrevendo como lidar com o tecido, conduzir a imagem e usar métodos esterológicos para obter dados imparciales e quantitativos sobre a distribuição de glicogênio subcelular específico do tipo de fibra no músculo esquelético.

Quantificação da Distribuição de Glicogênio Subcelular em Fibras Musculares Esqueléticas usando Microscopia eletrônica de transmissão

No presente protocolo, a técnica de Eletroforese de Carboidratos Assistido por Fluorophore (FACE) é usada para determinar a distribuição do comprimento da cadeia (CLD) e o comprimento médio da cadeia (ACL) do glicogênio.

Determinação da distribuição do comprimento da cadeia glucano do glicógeno usando o Método de Eletroforese de Carboidratos Assistido por Fluorophore (FACE)

Este protocolo detalha os passos principais para permitir uma medição rigorosa e reprodutível tanto do glicogênio quanto dos glicanos N-ligados por meio de imagens por espectrometria de massas.

Imagem Molecular Espacial do Glycome Usando Espectrometria de Massa

A prolina-prolina endopeptidase-1 (PPEP-1) é uma metaloprotease secretada e um alvo promissor do patógeno humano Clostridium difficile. Aqui descrevemos todos os métodos necessários para a produção e determinação da estrutura desta proteína.

Produção, cristalização e determinação da estrutura de<em&gt; C. difficile</em&gt; PPEP-1 via microdispersão e Zinco-SAD

Aprenda a extrair glicogênio hepático preservando sua estrutura e minimizando a perda de partículas pequenas. Este método utiliza ebulição para inibir enzimas degradantes, auxiliando pesquisas sobre diabetes e doenças de armazenamento de glicogênio.

A extração de moléculas de glicogênio hepático para determinação da estrutura do glicogênio

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