A extração de moléculas de glicogênio hepático para determinação da estrutura do glicogênio

Este protocolo permite a extração das moléculas de glicogênio hepático de forma a preservar sua estrutura e limitar a quantidade de pequenas partículas de glicogênio perdidas. Com pesquisas anteriores mostrando que o diabetes altera a estrutura do glicogênio, este método poderia fornecer no estudo para o diabetes e as várias doenças de armazenamento de glicogênio. Para extrair glicogênio do fígado, comece transferindo um grama de tecido hepático congelado para um tubo de 15 mililitros contendo seis mililitros de tampão de isolamento de glicogênio.

Mantendo o gelo, homogeneize o tecido hepático usando um homogeneizador de tecido. Quando terminar, transfira metade ou três mililitros da suspensão celular para um novo tubo, seguido de fervura por 10 minutos. Mantenha a outra metade da suspensão no gelo para extrair proteínas associadas contendo glicogênio que não são desnaturadas.

Para a determinação do teor de glicogênio, remova uma alíquota de oito microlitros de cada tubo e mantenha o tubo sobre gelo. Depois de girar a suspensão restante a 6.000 G por 10 minutos a quatro graus Celsius, transfira o sobrenadante para tubos de ultracentrífuga para centrá-los a 3,6 vezes 10 até o quinto G e quatro graus Celsius por 90 minutos. Após descartar os sobrenadantes restantes, ressuspender os pellets em 1,5 mililitros de tampão de isolamento de glicogênio.

Em seguida, cobrir as amostras sobre 1,5 mililitros de solução de sacarose a 30% em tubos de ultracentrífuga de quatro mililitros, seguido de centrifugação como descrito anteriormente por duas horas. Após o descarte dos sobrenadantes, ressuspenda os pellets em 200 microlitros de água deionizada. Para precipitar o glicogênio da suspensão celular, adicione 800 microlitros de etanol absoluto às suspensões celulares e misture bem.

Em seguida, armazene as misturas a menos 20 graus Celsius por pelo menos uma hora para permitir a precipitação. Uma vez que a precipitação ocorra, centrifugar as amostras a 6.000 G por 10 minutos a quatro graus Celsius e ressuspender o pellet de glicogênio em 200 microlitros de água deionizada para repetir o processo de precipitação de etanol três vezes. Da suspensão celular final, remova uma alíquota de oito microlitros de cada tubo para determinação do conteúdo de glicogênio.

Em seguida, congele os sobrenadantes restantes em nitrogênio líquido e liofilize durante a noite. No dia seguinte, armazene as amostras de glicogênio seco no freezer a menos 20 graus Celsius. O estudo analisou a pureza, o rendimento bruto e o rendimento de glicogênio da amostra de glicogênio seco extraída por diferentes condições.

Não houve diferenças significativas no rendimento bruto e no rendimento de glicogênio entre os grupos extraídos com as diversas condições. Em contraste, a pureza do glicogênio foi significativamente influenciada pelas concentrações de sacarose e pela adição de uma etapa de ebulição. O glicogênio de maior pureza foi extraído usando a concentração de 30% de sacarose e uma etapa de ebulição de 10 minutos.

O glicogênio foi extraído do homogeneizado hepático por 30%50% ou 72,5% de sacarose, fervido ou não fervido, para avaliar os efeitos das várias condições sobre o tamanho das moléculas no extrato final. A análise do comprimento de cadeia foi realizada em seis fígados, tanto fervidos quanto não fervidos, utilizando concentrações de 30%50% e 72,5% de sacarose. O conteúdo das moléculas de glicogênio ou partículas beta com raio hidrodinâmico, RH, menor que 30 nanômetros foi calculado.

As amostras fervidas apresentaram menores valores médios de UR e maior teor de partículas do que as amostras não fervidas. Além disso, menores concentrações de sacarose resultaram em menores valores de UR e maiores teores de partículas beta. A introdução de uma etapa de ebulição também levou a menores valores de RH máx ou máxima, enquanto a concentração de sacarose não teve efeito significativo.

Certifique-se de que o tecido está totalmente homogeneizado e não há pedaços do tecido restantes. Então, essa técnica abre caminho para explorarmos quais caminhos ligam as partículas beta menores para formar as partículas alfa maiores.