Coleta, Expansão e Diferenciação de Modelos Primários de Células Epiteliais Nasais Humanas para Quantificação da Frequência de Batimento de Cílios

Descrevemos a coleção de células-tronco das vias aéreas da mucosa nasal. Essas células são expandidas e diferenciadas em um epitélio pseudoestratificado no laboratório. Trata-se de expansão e diferenciação in vitro, que é semelhante às nossas vias aéreas in vivo, o que significa que existem células especializadas, como as células ciliadas, presentes que podem ser usadas para quantificar a frequência de batimentos dos cílios.

Para permitir a quantificação consistente e reprodutível da frequência de batimentos ciliares entre diferentes indivíduos e em resposta a diferentes medicamentos, padronizamos as condições de cultura e aquisição de imagens. As medições da frequência de batimentos de cílios são usadas como ferramentas clínicas em doenças como discinesia ciliar primária. Esperamos estabelecer isso como um marcador clínico para a fibrose cística.

Demonstrando o procedimento estão Katelin Allan e Laura Fawcett, estudantes de doutorado do meu laboratório, e a Dra. Sharon Wong, uma pós-doutoranda do meu laboratório. Comece pedindo ao participante que respire pela boca. Em seguida, pegue uma escova de citologia na mão dominante e descanse o quinto dígito no queixo do participante para ancorar a mão, insira a escova de citologia na passagem nasal do participante em um ângulo de 45 graus em relação ao rosto do participante e passe-a através do meato nasal.

Depois de girar a escova na vertical, de modo que fique perpendicular à face do participante, avance a escova suavemente, mas com firmeza, contra a parede lateral do nariz sob o corneto inferior até que esteja na parte média a posterior do corneto inferior. Gire a escova 360 graus até três vezes. Em seguida, retire-o suavemente, invertendo a manobra de inserção, para que as células não sejam desalojadas da escova.

Coloque a escova no tubo de coleta preparado com meio de coleta de células nasais e coloque o tubo de coleta no gelo. Após um vórtice suave para desalojar as células da escova, transfira o tubo de coleta no gelo de volta para o gabinete de biossegurança. Usando uma pipeta sorológica, transfira o meio do tubo de coleta para um novo tubo, deixando para trás as escovas de citologia.

Em seguida, centrifugar a amostra. Após a centrifugação, ressuspenda o pellet celular em um mililitro de meio celular de reprogramação condicional. Em seguida, usando uma pipeta sorológica de cinco mililitros, passe as células através de uma peneira celular colocada em cima de um tubo de 50 mililitros em um movimento circular.

Para obter uma suspensão de célula única, colete a suspensão do fundo do tubo e passe-a pela peneira várias vezes. Em seguida, descarte a peneira de células. Para semear as células epiteliais das vias aéreas nas inserções de suporte permeáveis preparadas, misture bem as células sem criar bolhas, garantindo que elas sejam homogêneas e em suspensão.

Em seguida, adicione 150 microlitros da suspensão celular ao lado apical das inserções de suporte permeáveis preparadas. Para diferenciar as células epiteliais das vias aéreas na interface ar-líquido, cultura-as em diferenciação, ou meio LPA por dois dias. Em seguida, aspirar a mídia e adicionar 750 microlitros de mídia ALI apenas ao compartimento basal para criar uma interface ar-líquido.

Para semear as células epiteliais das vias aéreas em cúpulas de MEC, ressuspender células epiteliais dissociadas das vias aéreas com o volume apropriado de 90% ECM. Em seguida, segurando a pipeta verticalmente em um ângulo de 90 graus o mais próximo possível do fundo do poço, dispense 50 microlitros da suspensão da célula ECM para o centro do poço. Incubar a placa a 37 graus Celsius durante 20 minutos até que a MEC se solidifique.

Enquanto o ECM está se solidificando, aqueça o Meios de Semeadura Organoides das Vias Aéreas, ou AOSM, à temperatura ambiente para evitar que ele cause reliquificação e desintegração da cúpula do ECM após a adição. Após a incubação, adicione 500 microlitros de AOSM aquecido a cada poço, distribuindo a parede do poço. Não pipete a mídia diretamente para a cúpula ECM.

Mude a mídia a cada dois dias por quatro a sete dias. Para aspirar o meio, incline a placa em um ângulo de 45 graus e aspirar da borda inferior do poço para longe da cúpula ECM. Após quatro a sete dias, inicie a diferenciação organoide adicionando 500 microlitros de Meios de Diferenciação Organoides das Vias Aéreas aquecidos, ou AODM, a cada poço e troque o meio a cada dois dias durante sete dias.

Coloque a placa de cultura contendo os modelos de células epiteliais das vias aéreas na inserção da placa do microscópio e feche a câmara ambiental do microscópio. Deixe a amostra se equilibrar na câmara de microscópio pré-aquecida, a 37 graus Celsius, cheia de dióxido de carbono a 5% por 30 minutos. Na ocular do microscópio, concentre-se no modelo celular.

Em seguida, usando o software de aquisição, clique em L100 para alternar o caminho da luz para a porta onde a câmera está montada. Clique no botão verde Reproduzir para visualizar o campo de visão do microscópio através do software. Verifique se os cílios estão em foco e ajuste, se necessário.

Para adquirir imagens de lapso de tempo no menu, clique em Adquirir e, em seguida, em Lapso de tempo rápido. Na janela pop-up, selecione um local de salvamento e o nome do arquivo, adquira 1.000 quadros. Para visualizar os cílios no campo de visão do microscópio, clique em Aplicar, seguido pelo botão verde Reproduzir.

Ajuste o foco Z, se necessário. Em seguida, clique em Executar agora para capturar o TimeLapse Rápido. Depois de instalar o software e as caixas de ferramentas necessários, copie os scripts de análise personalizados apropriados e a pasta de scripts de suporte para a unidade local do computador.

Em seguida, no software de computação, clique na guia Página Inicial, seguida de Definir Caminho. Na janela pop-up, clique em Adicionar com subpastas. No caminho de pesquisa do MATLAB, selecione a pasta mostrada.

Em seguida, clique em Salvar e Fechar. Confirme se os scripts de análise estão vinculados ao software de computação, verificando se eles aparecem no painel esquerdo. Em seguida, transfira os arquivos de imagem raw de exemplo adquiridos para a unidade local do computador.

Em seguida, clique no BeatingCiliaBatchOMEfiles_jove. m arquivo de script de análise no software de computação. Para executar o script, clique na guia Editor, seguida pelo botão verde Reproduzir.

Na janela de prompt exibida, selecione os arquivos de imagem raw a serem analisados. Insira o tempo de exposição para o tempo de aquisição por período. Em seguida, clique em OK. Execute o GetFirstAmplitude.

m script na pasta que contém os arquivos AveSpectrum. Aguarde até que o script produza o FirstAmplitudeStacked. xlsx file, que contém a maior frequência de amplitude, e está dentro da faixa fisiológica de batimento dos cílios epiteliais das vias aéreas.

Copie os valores de frequência do FirstAmplitudeStacked. xlsx e plotá-los usando software de análise científica. São apresentados os resultados da frequência de batimentos cílios medidos em modelos de LPA de células epiteliais das vias aéreas derivados de três participantes com fibrose cística e três participantes controle saudáveis.

No dia 14 de diferenciação cultural, os cílios batedores estavam presentes. A partir do dia 14, dia 21 de diferenciação da cultura, não foi observado um aumento estatisticamente significativo na frequência de batimentos cílios entre as coortes. No 21º dia de diferenciação cultural, a frequência média de batimentos de cílios para participantes controle saudáveis foi significativamente maior do que a dos participantes com fibrose cística.

Além disso, quando a frequência de batimento de cílios foi fotografada nos mesmos modelos celulares após a remoção de muco, houve um aumento estatisticamente significativo na frequência de batimentos de cílios quando o muco foi removido em modelos de LPA de indivíduos saudáveis e com fibrose cística. O ambiente de imagem deve ser estritamente regulado, uma vez que a função dos cílios é extremamente suscetível a mudanças nos fatores ambientais. Esta plataforma tem o potencial de ser estabelecida para a triagem de medicamentos específicos do paciente para ser capaz de identificar drogas que modulam a função CFTR.