Name: Gerando organoides cardíacos humanos auto-montados derivados de células-tronco pluripotentes (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: Aprenda a gerar organoides cardíacos humanos auto-montados a partir de células-tronco pluripotentes. Este protocolo reprodutível cria tecidos cardíacos complexos em 3D para modelar doenças cardiovasculares e triagem farmacológica.

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Este trabalho foi apoiado pelo National Heart, Lung, and Blood Institute dos Institutos Nacionais de Saúde sob os números de premiação K01HL135464 e R01HL15151505 e pela American Heart Association sob o prêmio número 19IPLOI34660342. Agradecemos ao Núcleo avançado de Microscopia da MSU e ao Dr. William Jackson do Departamento de Farmacologia e Toxicologia da MSU pelo acesso aos microscópios confocal, ao Núcleo de Microscopia de QI e ao Núcleo de Genômica da MSU para serviços de sequenciamento. Também queremos agradecer a todos os membros do Laboratório Aguirre por seus valiosos comentários e conselhos.

1. cultura e manutenção hPSC
NOTA: Os PSCs induzidos por humanos (hiPSCs) ou células-tronco embrionárias humanas (hESCs) precisam ser cultivados por pelo menos 2 passagens consecutivas após o descongelamento antes de serem usados para gerar EBs para diferenciação ou criopreservação. hPSCs são cultivados em meio PSC (ver a Tabela de Materiais) em placas de cultura de 6 poços revestidos de membrana de porão (BM-ECM) revestidos de 6 poços. Ao realizar alterações médias em hPSCs em placas de 6 poços, adicione o meio diretamente ao lado interno do poço, em vez de diretamente em cima das células para evitar o descolamento ou estresse celular indesejado. Os usuários devem ter cuidado com a mídia PSC pré-aquecimento que não deve ser aquecida a 37 °C; todos os meios de PSC usados neste protocolo eram termoestáveis.
<ol><li>Para revestir as placas de bem com o BM-ECM, descongele uma alíquota do BM-ECM (armazenado a -20 °C de acordo com as instruções do fabricante) no gelo e misture 0,5 mg do BM-ECM com 12 mL de meio de Águia modificada de Dulbecco (DMEM)/F12 (armazenado a 4 °C). Distribua 2 mL da mistura DMEM/F12-BM-ECM em cada poço de uma placa de 6 poços e incubar a 37 °C por pelo menos 2 h.</li>
	<li>Para descongelar as células, primeiro, descongelar o criovial hPSC em uma pérola de 37 °C ou banho de água por 1-2 min até que apenas uma pequena quantidade de gelo seja visível. Transfira as células descongeladas para um tubo de centrífuga e adicione lentamente 8-9 mL do meio PSC suplementado com 2 μM do inibidor de ROCHA, thiazovivin (Thiaz), e centrífuga a 300 × g por 5 min. Remova o supernatante e resuspense a pelota celular no meio PSC complementado com 2 μM de Thiaz. Distribua as células no meio de cultura em 1-2 poços dependendo da concentração e cultura das células criviais a 37 °C, 5% de CO2 por 24 h antes de mudar o meio PSC.</li>
	<li>Altere o meio nas células em intervalos de 48h. Realizar lavagens e alterações médias utilizando DMEM/F12 (1 mL/bem) e o meio PSC (2 mL/well), respectivamente. NOTA: As lavagens ajudam a remover resíduos e detritos celulares, enquanto as alterações frescas da mídia fornecem às células uma fonte renovada de nutrientes.</li>
	<li>Passar as células sobre a subconfluência (60-80% confluente) aspirando o meio, depois lavando cada poço com 1 mL de solução tamponada de fosfato de 1x Dulbecco (sem cálcio, sem magnésio; DPBS). Aspire o DPBS e adicione 1 mL do reagente de dissociação para hPSCs (ver a Tabela de Materiais), seguido pela aspiração de todos, exceto uma película fina do reagente após os 10 s.</li>
	<li>Incubar por 2-5 min com o filme fino do reagente de dissociação para hPSCs até que as lacunas se formem entre as células. NOTA: A hora de parar a dissociação é dependente da linha celular.</li>
	<li>Adicione 1 mL do meio PSC suplementado com 2 μM de Thiaz (meio PSC+Thiaz) ao poço e toque suavemente na placa para induzir o descolamento celular. Pipetizar as células separadas no meio 1-2 vezes para quebrar quaisquer grandes colônias, e resuspende as células em psc médio+Thiaz em uma proporção de poço de 1:6 (células de 1 poço resuspended em 12 mL de meio de cultura). Replate as células em poços revestidos de BM-ECM.</li>
</ol>2. Geração de organoides cardíacos humanos auto-montados em 3D
<ol><li>Formação do corpo embrionário (EB): NOTA: É imprescindível limitar as células diferenciadas observáveis antes da formação do corpo embrionário. Dois a três poços de uma placa de 6 poços a uma confluência de 60-80% produzirão células suficientes para uma única placa de 96 poços de organoides. Todas as mídias devem ser aliquoadas e aquecidas em um banho de 37 °C ou água antes de qualquer alteração média para minimizar o choque de temperatura para os EBs ou organoides (isso não inclui reagentes de dissociação celular). Veja a Figura 1A,B.<ol>
<li>Dia -2<ol>
<li>Para criar EBs, no dia -2, lave hPSCs subconfluentes (60-80% confluentes) com DPBS por pelo menos 10 s para lavar quaisquer detritos celulares e aspirar o DPBS.</li>
			<li>Para desprender as células e liberá-las em um estado de célula única, adicione 1 mL de reagente de dissociação celular de temperatura ambiente (veja a Tabela de Materiais) a cada poço por 3-6 min. Toque suavemente na placa ~5 vezes por minuto para induzir o desprendimento enquanto verifica sob o microscópio. Adicione 1 mL de PSC médio+Thiaz para parar a reação.</li>
			<li>Para coletar as células e quebrar quaisquer agregados restantes, pipete a mídia para cima e para baixo no poço 2-3 vezes para gerar uma suspensão unicelular. Transfira a suspensão unicelular para um tubo de centrífuga e gire por 5 min a 300 × g.</li>
			<li>Para obter a concentração celular desejada, descarte o sobrenadante e resuspenque as células em 1 mL de PSC médio+Thiaz. Conte as células usando um contador celular ou hemótmetro e dilua as células em PSC médio+Thiaz a uma concentração de 100.000 células/mL.</li>
			<li>Para distribuir as células para formação de EB, use uma pipeta multicanal para adicionar 100 μL (10.000 células) a cada poço de uma placa ultra-baixa de fundo redondo de 96 poços. Centrifugar a placa a 100 × g por 3 min e incubar por 24 h a 37 °C, 5% de CO2.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Dia -1<ol>
<li>Remova cuidadosamente 50 μL de meio de cada poço e adicione 200 μL de médio PSC fresco aquecido a 37 °C para alcançar um volume final de 250 μL por poço. Incubar as células por 24 h a 37 °C, 5% de CO2. NOTA: Remova e adicione o meio cuidadosamente na lateral do poço para evitar perturbar os EBs na parte inferior do poço. Devido à natureza delicada dos EBs e à cultura de suspensão, é necessário deixar um pequeno volume de líquido em cada poço ao trocar o meio para evitar perturbar os EBs.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Diferenciação do Coração Humano (hHO): NOTA: Todos os meios de comunicação devem ser aquecidos em uma conta de 37 °C ou banho de água antes de qualquer alteração de mídia. Remova e adicione o meio cuidadosamente na lateral do poço para evitar perturbar os organoides em desenvolvimento na parte inferior do poço. As lavagens não são necessárias entre as mudanças de mídia para minimizar a agitação e permitir a remoção gradual de inibidores e fatores de crescimento. O RPMI com 2% de suplemento B-27 (Tabela de Materiais) foi utilizado em todo o protocolo de diferenciação. O suplemento B-27 contém insulina a menos que especificado (sem insulina nos dias 0-5). Veja a Figura 1C.<ol>
<li>Dia 0<ol>
<li>Para iniciar a diferenciação em relação a uma linhagem de mesoderm, remova 166 μL de meio de cada poço (~2/3º do volume total do poço) e adicione 166 μL de RPMI 1640 contendo suplemento B-27 sem insulina, 6 μM CHIR99021, 1.875 ng/mL proteína morfogenética óssea 4 (BMP4), e 1,5 ng/mL Activin A para uma concentração final de poço de 4 μM CHIR99021, 1,25 ng/mL BMP4 e 1 ng/mL Activin A. Incubar por 24 h a 37 °C, 5% de CO2.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Dia 1º<ol>
<li>Remova 166 μL de médio de cada poço e adicione 166 μL de RPMI fresco 1640 com suplemento B-27 sem insulina. Incubar por 24 h a 37 °C, 5% de CO2.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Dia 2.<ol>
<li>Para induzir a especificação do mesoderme cardíaco, remova 166 μL de médio de cada poço e adicione 166 μL de RPMI 1640 contendo suplemento B-27 sem insulina e 3 μM Wnt-C59 para uma concentração final de 2 μM Wnt-C59. Incubar por 48 h a 37 °C, 5% de CO2.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Dia 4.<ol>
<li>Remova 166 μL de médio de cada poço e adicione 166 μL de RPMI fresco 1640 com suplemento B-27 sem insulina. Incubar por 48 h a 37 °C, 5% de CO2.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Dia 6.<ol>
<li>Remova 166 μL de meio de cada poço e adicione 166 μL de RPMI 1640 com suplemento B-27. Incubar por 24 h a 37 °C, 5% de CO2.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Dia 7.<ol>
<li>Para induzir a diferenciação proepicardial, remova 166 μL de meio de cada poço e adicione 166 μL de RPMI fresco 1640 contendo suplemento B-27 e 3 μM CHIR99021 para uma concentração final de poço de 2 μM CHIR99021. Incubar por 1h a 37 °C, 5% de CO2.</li>
			<li>Remova 166 μL de meio de cada poço e adicione 166 μL de RPMI fresco 1640 contendo suplemento B-27. Incubar por 48 h a 37 °C, 5% de CO2. NOTA: A cautela extra é aconselhada nesta segunda mudança média no dia 7, pois os organoides são mais propensos ao movimento devido às mudanças na mídia.</li>
			<li>A partir do dia 7 até a coleta ou transferência para análises ou experimentações, realize alterações médias a cada 48 h removendo 166 μL de meio de cada poço e adicione 166 μL de RPMI fresco 1640 contendo suplemento B-27. NOTA: Os organoides estão prontos para análises e experimentações no dia 15, a menos que estágios de desenvolvimento anteriores sejam de interesse. Eles podem ser cultivados no último dia 15 para experimentos de cultura ou maturação de longo prazo.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>3. Análise organoide
<ol><li>Transferência de organoides inteiros (vivos ou fixos) NOTA: Para transferência de organoides vivos, certifique-se de que as pontas de pipeta utilizadas são estéreis.<ol>
<li>Corte a ponta de uma ponta de pipeta P200 de 5-10 mm da abertura da ponta, resultando em uma ampla abertura de ~2-3 mm de diâmetro.</li>
		<li>Insira a ponta diretamente no poço de fundo redondo contendo o organoide para que a pipeta seja completamente vertical (perpendicular à placa). Certifique-se de que o êmbolo da pipeta já está pressionado até o fim antes de inserir a ponta no meio.</li>
		<li>Solte lentamente o êmbolo da pipeta, ocupando o suficiente médio (100-200 μL) para coletar o organoide.</li>
		<li>Transfisi o organoide em médio para o destino alvo (por exemplo, para fixação, imagem ao vivo, gravação de eletrofisiologia, nova cultura de placa).</li>
	</ol></li>
	<li>Fixação de organoides NOTA: Os organoides de fixação e coloração podem ser feitos tanto na placa de cultura de 96 poços quanto nos tubos de microcentrifuuge. Paraformaldeído (PFA) deve ser manuseado apenas em um capô de fumaça.<ol>
<li>Para fixação em tubos de microcentrifuge, transfira organoides vivos para tubos separados com 1-8 organoides por tubo. NOTA: Não exceda 8 organoides por tubo.</li>
		<li>Remova e descarte cuidadosamente o máximo possível do tubo sem tocar nos organoides.</li>
		<li>Adicione 4% de PFA a cada tubo ou bem (300-400 μL por tubo de microcentrifus de microcentragem e 100-200 μL por poço de uma placa de 96 poços). Incubar em temperatura ambiente por 30-45 min. NOTA: Os tempos de incubação acima de 1h podem exigir etapas de recuperação de antígenos e não são recomendados.</li>
		<li>Descarte com segurança o PFA sem perturbar os organoides. Realizar 3 lavagens com DPBS suplementada com 1,5 g/L de glycina (DPBS/Gly), utilizando o mesmo volume utilizado para o PFA de 4%, esperando 5 min entre as lavagens. Remova o DPBS/Gly e prossiga para imunossuagem ou outras análises ou adicione DPBS e armazene a 4 °C para uso futuro por até 2 semanas. NOTA: Armazenar organoides fixos por mais de 2 semanas pode resultar em degradação e contaminação do tecido e não é recomendado.</li>
	</ol></li>
	<li>Coloração imunofluorescente de montagem inteira<ol>
<li>Adicione 100 μL de solução de bloqueio/permeabilização (10% de soro normal de burro + 0,5% de albumina de soro bovino (BSA) + 0,5% Triton X-100 em 1x DPBS) em cada poço ou tubo contendo os organoides fixos. Incubar à temperatura ambiente durante a noite em um shaker. NOTA: Não exceda 8 organoides por tubo.</li>
		<li>Remova e descarte cuidadosamente o máximo possível da solução de bloqueio sem tocar nos organoides. Realizar 3 lavagens com DPBS, esperando 5 min entre as lavagens.</li>
		<li>Prepare a solução de anticorpos primários (1% soro normal de burro + 0,5% BSA + 0,5% Triton X-100 em 1x DPBS) com os anticorpos primários desejados nas concentrações recomendadas. Incubar a 4 °C por 24 h em um shaker.</li>
		<li>Remova e descarte cuidadosamente o máximo possível da solução de anticorpos sem tocar nos organoides. Realizar 3 lavagens com DPBS, esperando 5 min entre as lavagens.</li>
		<li>Prepare a solução secundária de anticorpos (1% soro normal de burro + 0,5% BSA + 0,5% Triton X-100 em 1x DPBS) com os anticorpos secundários desejados nas concentrações recomendadas. Se os anticorpos forem rotulados fluorescentemente, incubar a 4 °C no escuro (por exemplo, coberto de papel alumínio) por 24 h em um agitador.</li>
		<li>Remova e descarte cuidadosamente o máximo possível da solução de anticorpos sem tocar nos organoides. Realizar 3 lavagens com DPBS, esperando 5 min entre as lavagens.</li>
		<li>Prepare slides com contas (90-300 μm de diâmetro) montadas em um meio de montagem (ver a Tabela de Materiais) perto das bordas do slide onde o deslizamento de cobertura com os organoides será colocado. NOTA: Recomenda-se permitir que o meio de montagem ao redor das contas seque antes de prosseguir; isso evitará que as contas se movam. Veja a Figura 2.</li>
		<li>Transfira os organoides manchados usando uma ponta de pipeta cortada para o slide, entre as contas, garantindo o espaçamento para evitar o contato entre os organoides uma vez na lâmina. Use o canto de uma limpeza de laboratório enrolada para remover cuidadosamente o excesso de líquido ao redor do organoide.</li>
		<li>Cubra os organoides com meio de compensação de montagem (solução de compensação de frutose-glicerol é 60% (vol/vol) glicerol e 2,5 M de frutose)37 utilizando 120-150 μL do meio de montagem por slide. NOTA: Recomenda-se usar uma ponta de pipeta cortada ao trabalhar com o meio de limpeza de montagem, pois é muito viscoso.</li>
		<li>Passe o deslizamento sobre o slide com os organoides cobertos com solução de limpeza de montagem e pressione lentamente o deslizamento sobre o slide, garantindo que os organoides estejam entre as contas montadas.</li>
		<li>Sele o perímetro da mancha de cobertura no slide usando verniz de unha de casaco superior. Deixe o slide secar no escuro à temperatura ambiente por 1h. Armazene a 4 °C no escuro para armazenamento a longo prazo.</li>
	</ol></li>
	<li>Imagem transitória de cálcio em organoides cardíacos vivos NOTA: De acordo com as instruções do fabricante, o Fluo4-AM foi reconstituído em sulfóxido de dimetila (DMSO) para uma concentração final de solução de estoque de 0,5 mM. Fluo4-AM foi adicionado diretamente ao poço organoide na placa de 96 poços.<ol>
<li>Realize 2 lavagens nos organoides utilizando meio RPMI 1640.<ol>
<li>Remova 166 μL do meio gasto do poço.</li>
			<li>Adicione 166 μL de meio RPMI 1640 aquecido, remova 166 μL de meio e adicione 166 μL de meio RPMI 1640 fresco. NOTA: As lavagens são feitas para remover o material residuais e os detritos celulares. Dois terços do meio são removidos dos poços durante as lavagens para evitar perturbar os organoides na parte inferior do poço antes do ensaio funcional.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Adicione fluo4-AM médio aos organoides.<ol>
<li>Adicione Fluo4-AM reconstituído em DMSO ao RPMI 1640 contendo suplemento B-27 para preparar uma solução de 1,5 μM.</li>
			<li>Remova 166 μL de meio do poço.</li>
			<li>Adicione 166 μL de 1,5 μM Fluo4-AM em RPMI 1640 contendo suplemento B-27 para uma concentração final de poço de 1 μM. Incubar a 37 °C, 5% de CO2 por 30 min.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Realize 2 lavagens como na etapa 3.4.1.</li>
		<li>Adicione 166 μL de RPMI 1640 contendo suplemento B-27 ao poço.</li>
		<li>Usando uma ponta de corte de uma ponta de pipeta P200, transfira o organoide para uma placa de Petri de fundo de vidro (por exemplo, vidro de cobertura de 8 poços com vidro de cobertura de alto desempenho) com 100-200 μL de meio. NOTA: Consulte a seção 3.1 sobre a transferência de organoides inteiros.</li>
		<li>Imagem os organoides vivem sob um microscópio com uma câmara controlada por temperatura e CO2 a 37 °C, 5% de CO2.</li>
		<li>Grave vários vídeos de 10 a 20 em vários locais em todo o organoide, mostrando o aumento e a diminuição dos níveis de intensidade de fluorescência à medida que o cálcio entra e sai das células. NOTA: Para gravações de alta resolução, recomenda-se gravar a uma velocidade de 10 fps ou mais rápida; Recomenda-se 50 fps.</li>
		<li>Analise os vídeos usando software de análise de imagem (por exemplo, ImageJ) selecionando regiões de interesse e medindo níveis de intensidade ao longo do tempo.</li>
		<li>Normalize as gravações de intensidade usando ΔF/F0 vs. tempo em milissegundos e enredo.</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

Os autores não têm conflitos de interesse para declarar.

Avanços recentes em cardiomiócitos derivados de células-tronco humanas e outras células de origem cardíaca têm sido usados para modelar o desenvolvimento do coração humano22,24,25 e doenças26,27,28 e como ferramentas para triagem de terapêutica29,30 e agentes ...

Os defeitos cardíacos congênitos (CHDs) são o tipo mais comum de defeito congênito em humanos e afetam aproximadamente 1% de todos os nascidos vivos1,2,3. Na maioria das circunstâncias, as razões para os CHDs permanecem desconhecidas. A capacidade de criar modelos de coração humano no laboratório que se assemelham muito ao coração humano em desenvolvimento constitui um passo significativo para estudar diretamente as causas subjacentes dos CHDs em humanos e não em modelos animais substitutos.
O epítome de modelos de tecido cultivados em laboratório são organoides, construções de células 3D que se assemelham a um órgão de interesse na composição celular e função fisiológica. Organoides são frequentemente derivados de células-tronco ou células progenitoras e têm sido usados com sucesso para modelar muitos órgãos como o cérebro4,5, rim6,7, intestino8,9, pulmão10,11, fígado12,13 e pâncreas14,15 , só para citar alguns. Estudos recentes surgiram demonstrando a viabilidade de criar organoides cardíacos auto-montados para estudar o desenvolvimento cardíaco in vitro. Esses modelos incluem o uso de células-tronco embrionárias de camundongos (mESCs) para modelar o desenvolvimento cardíaco precoce16,17 até especificações atrioventriculares18 e células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs) para gerar organoides de endoderme de camada plamífica de camada plamícidos 19 e cardiodos de câmara20 com composição celular altamente complexa.
Este artigo apresenta um novo protocolo de modulação WNT de 3 passos para gerar hHOs altamente complexos de forma eficiente e econômica. Organoides são gerados em placas de 96 poços, resultando em um sistema escalável e de alta produtividade que pode ser facilmente automatizado. Este método se baseia na criação de agregados de hPSC e no desencadeamento de etapas de desenvolvimento da cardiogênese, incluindo mesodermia e formação de mesoderm cardíaco, especificação de primeiro e segundo campo cardíaco, formação de órgãos proepicardial e especificação atrioventricular. Após 15 dias de diferenciação, os HHOs contêm todas as principais linhagens celulares encontradas no coração, câmaras internas bem definidas, câmaras atrial e ventricular, e uma rede vascular em todo o organoide. Este sistema organoide cardíaco altamente sofisticado e reprodutível é favorável à investigação de análises estruturais, funcionais, moleculares e transcriômicas no estudo do desenvolvimento cardíaco e doenças e rastreamento farmacológico.

<table><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td></td>Anticorpos</tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Burro anti-rato</td><td>Invitrogen</td><td>A-21202</td><td>1:200</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Burro anti-coelho</td><td>Invitrogen</td><td>A-21206</td><td>1:200</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 Burro anti-rato</td><td>Invitrogen</td><td>A-21203</td><td>1:200</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 Burro anti-coelho</td><td>Invitrogen</td><td>A-21207</td><td>1:200</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 Burro anti- cabra</td><td>Invitrogen</td><td>A32849</td><td>1:200</td></tr><tr><td>HAND1</td><td>Abcam</td><td>ab196622</td><td>Coelho; 1:200</td></tr><tr><td>HAND2</td><td>Abcam</td><td>ab200040</td><td>Coelho; 1:200</td></tr><tr><td>NFAT2</td><td>Abcam</td><td>ab25916</td><td>Coelho; 1:100</td></tr><tr><td>PECAM1</td><td>DSHB</td><td>P2B1</td><td>Coelho; 1:50</td></tr><tr><td>TNNT2</td><td>Abcam</td><td>ab8295</td><td>Mouse; 1:200</td></tr><tr><td>THY1</td><td>Abcam</td><td>ab133350</td><td>Coelho; 1:200</td></tr><tr><td>TJP1</td><td>Invitrogen</td><td>PA5-19090</td><td>Cabra; 1:250</td></tr><tr><td>VIM</td><td>Abcam</td><td>ab11256</td><td>Cabra; 1:250</td></tr><tr><td>WT1</td><td>Abcam</td><td>ab89901</td><td>Coelho; 1:200</td></tr><tr><td>Meios e Reagentes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Tecnologias Celulares Inovadoras</td><td>NC9464543</td><td>reagente de dissociação celular</td></tr><tr><td>Activin A</td><td>R& D Systems</td><td>338AC010</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Suplemento (Menos Insulina)</td><td>Suplemento</td><td>de cultura de células sem insulina Gibco A1895601</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Suplemento</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td>Suplemento de cultura de células</td></tr><tr><td>BMP-4</td><td>Gibco</td><td>PHC9534</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino</td><td>Bioworld</td><td>50253966</td><td></td></tr><tr><td>CHIR-99021</td><td>Selleck</td><td>442310</td><td></td></tr><tr><td>D-(-)-Frutose</td><td>Millipore Sigma</td><td>F0127</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermo Scientific</td><td>62248</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>Dimetil Sulfóxido</td><td>Millipore Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>10566016</td><td></td></tr><tr><td>Essential 8 Flex Medium Kit</td><td>Gibco</td><td>A2858501</td><td>meio de células-tronco pluripotentes (PSC) contendo 1% penicilina-estreptomicina</td></tr><tr><td>Fluo4-AM</td><td>Invitrogen</td><td>F14201</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Millipore Sigma</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Glicina</td><td>Millipore Sigma</td><td>410225</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel GFR</td><td>Corning</td><td>CB40230</td><td>Matriz extracelular da membrana basal (BM-ECM)</td></tr><tr><td>Soro de burro normal</td><td>Millipore Sigma</td><td>S30-100mL</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeído</td><td>MP Biomedicals</td><td>IC15014601</td><td>Pó dissolvido em tampão PBS - use a 4%</td></tr> de <tr><td>penicilina-estreptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>solução tampão de fosfato</td><td>Gibco</td><td>10010049</td><td></td></tr><tr><td>solução tampão de fosfato (10x)</td> <td>Gibco</td><td>70011044</td><td></td></tr><tr><td>Polybead Microspheres</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>73155</td><td>90 &micro; m</td></tr><tr><td>ReLeSR</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>NC0729236</td><td>reagente de dissociação para hPSCs</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>11875093</td><td></td></tr><tr><td>Tiazovivina</td><td>Millipore Sigma</td><td>SML1045</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Millipore Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Solution</td><td>Gibco</td><td>1525006</td><td></td></tr><tr><td>VECTASHIELD Vibrance Antifade Montagem Média</td><td>Vector Laboratories</td><td>H170010</td><td></td></tr><tr><td>WNT-C59</td><td>Selleck</td><td>NC0710557</td><td></td></tr><tr><td>Outros</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubos de Microcentrífuga de 1,5 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>02682002</td><td></td></tr><tr><td>Tubos Falcon de 15 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>1495970C</td><td></td></tr><tr><td>Frascos Criogênicos de 2 mL</td><td>Corning</td><td>13-700-500</td><td></td></tr><tr><td>Reservatórios de Reagentes de 50 mL</td><td>Fisherbrand</td><td>13681502</td><td></td></tr><tr><td>Placas de Cultura de Células de Fundo Plano de 6 Poços</td><td>Corning</td><td>0720083</td><td></td></tr><tr><td>8 Vidro de cobertura com vidro de cobertura de alto desempenho #1.5</td><td>Cellvis</td><td>C8-1.5H-N</td><td></td></tr><tr><td>Microplacas de Fixação Ultra Baixa Transparente de 96 poços</td><td>Costar</td><td>07201680</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td>Image software de processamento</td></tr><tr><td></td><td>Kimwipes Kimberly-Clark Professional</td><td>06-666</td><td>toalhetes de laboratório</td></tr><tr><td>Micro Cover Glass</td><td>VWR</td><td>48393-241</td><td>24 x 50 mm No. 1.5</td></tr><tr><td>Lâminas de Microscópio</td><td>Fisherbrand</td><td>1255015</td><td></td></tr><tr><td>Moxi Cell Counter</td><td>Orflo Technologies</td><td>&nbsp; MXZ001</td><td></td></tr><tr><td>de contagem de células Moxi Z - Tipo M</td><td>Orflo&nbsp; Tecnologias</td><td>MXC001</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas Multicanal</td><td>Fisherbrand FBE1200300</td><td></td><td>30-300 &micro; L</td></tr><tr><td>Olympus cellVivo</td><td>Olympus</td><td></td><td>Para Caclium Imaging, análise com Imagej</td></tr><tr><td>Sorvall Legend X1 Centrífuga</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>75004261</td><td></td></tr><tr><td>Misturador Térmico</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>13-687-717</td><td></td></tr><tr><td>Top Coat Nail Varish</td><td>Seche Vite</td><td></td><td>Pode comprar em qualquer supermercado</td></tr></tbody></table>

gerando organoides cardíacos humanos auto-montados derivados de células-tronco pluripotentes

Generating Self-Assembling Human Heart Organoids Derived from Pluripotent Stem Cells

A capacidade de estudar o desenvolvimento cardíaco humano em saúde e doença é altamente limitada pela capacidade de modelar a complexidade do coração humano in vitro. O desenvolvimento de plataformas mais eficientes semelhantes a órgãos que podem modelar fenótipos complexos in vivo , como organoides e órgãos em um chip, aumentará a capacidade de estudar o desenvolvimento cardíaco humano e doenças. Este artigo descreve um protocolo para gerar organoides cardíacos humanos altamente complexos (hHOs) por auto-organização usando células-tronco pluripotentes humanas e ativação de caminhos de desenvolvimento stepwise usando inibidores de pequenas moléculas. Os corpos embrionários (EBs) são gerados em uma placa de 96 poços com fundo redondo, poços de fixação ultra-baixo, facilitando a cultura de suspensão de construções individualizadas.
Os EBs sofrem diferenciação em hHOs por uma estratégia de modulação de sinalização WNT de três etapas, que envolve uma ativação inicial da via WNT para induzir o destino do mesoderm cardíaco, um segundo passo da inibição de Wnt para criar linhagens cardíacas definitivas, e um terceiro passo de ativação wnt para induzir tecidos proepicardiais de órgãos. Essas etapas, realizadas em formato de 96 poços, são altamente eficientes, reprodutíveis e produzem grandes quantidades de organoides por execução. A análise por imagens de imunofluorescência do dia 3 ao dia 11 de diferenciação revela especificações de campo cardíaco de primeiro e segundo e tecidos de alta complexidade dentro dos HHOs no dia 15, incluindo tecido miocárdio com regiões de cardiomiócitos atrial e ventricular, bem como câmaras internas forradas com tecido endocardial. Os organoides também exibem uma intrincada rede vascular em toda a estrutura e um revestimento externo de tecido epicártico. Do ponto de vista funcional, os HHOs batem robustamente e apresentam atividade normal de cálcio, conforme determinado pela imagem ao vivo fluo-4. No geral, este protocolo constitui uma plataforma sólida para estudos in vitro em tecidos cardíacos semelhantes a órgãos humanos.

Para alcançar a auto-organização hHO in vitro, modificamos e combinamos protocolos de diferenciação previamente descritos para diferenciação de monocamadas 2D de células cardiomiocós-ástica21 e epicárida22 usando moduladores de via Wnt e para organoides pré-cardiaco 3D16 usando os fatores de crescimento BMP4 e Activin A. Utilizando a placa de 96 poços EB e protocolo de diferenciação hHO descritos aqui e mostrados na Figu...

Aqui, descrevemos um protocolo para criar organoides cardíacos humanos relevantes de desenvolvimento (hHOs) usando eficientemente células-tronco pluripotentes humanas por auto-organização. O protocolo conta com a ativação sequencial de pistas de desenvolvimento e produz tecidos cardíacos humanos altamente complexos e funcionalmente relevantes.

Gerando organoides cardíacos humanos auto-montados derivados de células-tronco pluripotentes

The ability to study human cardiac development in health and disease is highly limited by the capacity to model the complexity of the human heart in ...

Este protocolo nos permite criar uma complexa estrutura 3D que se assemelha muito ao coração humano em desenvolvimento de uma forma simples e econômica, que é reprodutível através das linhas celulares. Consiste em um único protocolo com três passos de diferenciação, o que dá origem a todos os tipos celulares do coração, incluindo câmaras e uma rede vascular. Essa técnica nos permite modelar uma ampla gama de doenças cardiovasculares humanas e testar tratamentos farmacológicos eficazes.Graças à natureza de alto rendimento de seu design. Este método é útil para investigar o coração humano em desenvolvimento, bem como doenças comumente associadas a ele. Um deles é defeito cardíaco congênito.Este protocolo requer habilidades básicas de cultura celular. Recomendamos tubos atentos e delicados, bem como manuseio suave dos organoides. Comece criando corpos embrionários ou EBs dois dias antes da diferenciação.Lave HPSCs subconfluentes com DBPS por pelo menos 10 segundos. Em seguida, aspire o DPBS. Adicione um mililitro de ACUTA de temperatura ambiente e bata suavemente na placa aproximadamente cinco vezes por minuto durante três a cinco minutos para induzir o desprendimento, enquanto estiver verificando sob o microscópio.Em seguida, adicione um mililitro de meio PSC e Thias Avin ou Thias para parar a reação. Pipeta a mídia para cima e para baixo no poço, duas a três vezes para gerar uma única suspensão celular e coletar as células. Em seguida, transfira a suspensão celular única para um tubo de centrífuga e gire por cinco minutos a 300 vezes G.Aspire o supernasce e repasse as células em um mililitro de meio PSC e Thias.Diluir as células em DPBS. Conte as células usando um contador celular ou cistometro hemo e dilua as células em meio PSC com Thias a uma concentração de 100.000 células por mililitro. Adicione 100 microliters de suspensão de células diluídas a cada poço de uma placa de fundo ultra baixa 96.Centrifugar a placa a 100 vezes G por três minutos e incubar por 24 horas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Após 24 horas remova cuidadosamente 50 microliters de médio de cada poço e adicione 200 ninhadas de tamanho baixo de PSC médio fresco, quente a 37 graus Celsius para um volume de 250 microliters por poço. Incubar as células por 24 horas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.Remova 166 microliters ou dois terços do meio de um lado de cada poço, e adicionar 166 microliters de RPMI 1640 contendo suplemento B27 livre de insulina, seis 990211 de animação micromolar, 0,875 nanogramas por mililitro de proteína morfogenética óssea quatro e 1,5 nanogramas por mililitro de Activin A.Incubar por 24 horas a 37 graus Celsius e 5%dióxido de carbono. Após 24 horas remova 166 microliters de meio de um lado de cada poço e adicione 166 microliters de RPMI fresco 1640 com suplemento B27 livre de insulina. Incubar por 24 horas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.Para induzir a especificação do mesoderm cardíaco no segundo dia, remova 166 microliters de médio de cada poço e adicione 166 microliters de RPMI 1640, contendo suplemento B27 livre de insulina e três micromolar Wnt-C59 e continue a incubação por 48 horas. No quarto dia, remova 166 microliters de médio de cada poço e adicione 166 microliters de RPMI fresco 1640 com suplemento B27 livre de insulina, depois incubar mais 48 horas. No sexto dia, remova 166 microliters de médio de cada poço e adicione 166 microliters de RPMI 1640 com suplemento B27.Para isso e todas as alterações posteriores da mídia, use suplemento B27 com insulina, incubar por mais 24 horas. No sétimo dia, a cultura celular está pronta para diferenciação pro epicárardia. Remova 166 microliters de médio de cada poço e adicione 166 microliters de RPMI fresco 1640 contendo suplemento B27 e três micromolar cheer 99021.Em seguida, incubar por uma hora, após uma hora remover a placa da incubadora, remover 166 microliters de meio de um lado de cada poço e adicionar 166 microliters de RPMI fresco 1640 contendo suplemento B27 continuar incubação por mais 48 horas. Repita este processo a cada 48 horas até a coleta. Organoides estão prontos para análises e experimentações no dia 15 Para transferir todos os organoides, corte a ponta de uma pipeta P200, de cinco a 10 milímetros da abertura com um diâmetro de aproximadamente dois a três milímetros.Pressione o êmbolo da pipeta e insira a ponta verticalmente no fundo redondo bem com o organoide. Pegue aproximadamente 100 a 200 microliters de médio o suficiente para coletar os organoides e transferi-los para o destino alvo. Antes da diferenciação, o EBS aparece como massas esféricas dos negros, o processo de diferenciação começa no dia zero com uma ativação de via wnt e adição de fator de crescimento por exatamente 24 horas.Além disso, a edição do WNT C59 no segundo dia resulta em ampliação do organoide de aproximadamente 200 micrômetros para um máximo de um milímetro. Os organoides do coração humano começaram a bater logo no sexto dia e 100% dos organoides mostraram batidas visíveis no dia 10. Imagens de alta ampliação do dia sete organoide revelaram que a maioria das células expressas de mãos eram cardiomiócitos de origem e duas mãos eram células não mísitas do segundo Heartfield, células progenitoras.As transcrições de RNA para mão um e duas mãos foram expressas a partir do terceiro dia em dados de sequenciamento de RNA. Os marcadores FHF foram altamente expressos durante os dias três e 11, enquanto o marcador SF foi mais expresso após o dia 13. A mancha de imunofluorescência revelou a presença de várias linhagens do tipo células cardíacas humanas que compõem o coração humano.Como tecido miocárdio e epicardial, células do endocárdio, células endoteliais e fibroblasto cardíaco. Os marcadores que expressam as linhagens celulares acima também foram observados nos perfis de expressão genética RNA SAC. A imagem viva de cálcio de células individuais em organoides inteiros foi usada para medir a função eletrofisiológica dos organoides.A intensidade da fluorescência fluo-4 variou ao longo do tempo devido à saída de entrada de cálcio da célula revelando potenciais de ação regulares. Mapas de calor mostrando intensidades de cálcio sobre uma região de alta ampliação do organoide, mostram aumento da intensidade devido aos transitórios de cálcio e células individuais. Ao tentar este protocolo, tenha em mente que os EBs e organoides subsequentes não estão ligados à parte inferior da placa, e vamos nos mover com a remoção, além de mídia que exige mudanças atentas na mídia.Organoides podem ser cultura por períodos mais longos de tempo introduzidos em técnicas de maturação, ou mesmo expostos a estímulos externos, como condicionamento mecânico ou elétrico, e até estressores como toxinas. Essa técnica permite, como acesso a estágios do desenvolvimento do coração fetal humano, que de outra forma são inacessíveis na pesquisa, abrindo caminho para novas percepções sobre o desenvolvimento cardíaco e etiologia de doenças.

generating-self-assembling-human-heart-organoids-derived-from

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Este vídeo descreve a criação de organoides do tipo prosencéfalo a partir de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (iPSCs), demonstrando a progressão de agregados de células-tronco para estruturas complexas que imitam o córtex do cérebro e se diferenciam em vários tipos de neurônios.

Geração de organoides cerebrais do tipo prosencéfalo a partir de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos

Aqui nós descrevemos um método dimensionável, usando uma simples combinação de Activin A e mediada por lentivirus Id1-superexpressão, para gerar a primeiras progenitores cardíaca como campo de coração e cardiomyocytes ventricular, como de células estaminais pluripotentes humanas.

Geração do primeiro coração campo-como progenitores cardíaca e Cardiomyocytes Ventricular, como de células-tronco pluripotentes humanas

Esse protocolo foi gerado como um meio de produzir organoides cerebrais de forma simplificada e de baixo custo sem fatores de crescimento exógenos ou matriz de membrana do porão, mantendo a diversidade de tipos de células cerebrais e muitas características da organização celular.

Um método estática auto-direcionado para gerar organoides cerebrais a partir de células-tronco embrionárias humanas

Aqui descrevemos um protocolo para gerar organoides renais a partir de células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs). Este protocolo gera organoides renais dentro de duas semanas. Os organoides renais resultantes podem ser cultivados em frascos rotadores em larga escala ou placas de agitação magnética multi-bem para abordagens paralelas de teste de drogas.

Um método simplificado para gerar organoides renais a partir de células-tronco pluripotentes humanas

O objetivo deste protocolo é explicar e demonstrar o desenvolvimento de um modelo microfluido tridimensional (3D) de tecido cardíaco humano altamente alinhado, composto por cardiomiócitos derivados de células-tronco co-cultivados com fibroblastos cardíacos (CFs) dentro de um hidrogel biomimético, à base de colágeno, para aplicações em engenharia de tecido cardíaco, triagem de medicamentos e modelagem de doenças.

Desenvolvimento de tecido cardíaco humano organizado 3D dentro de uma plataforma microfluida

Apresenta-se aqui um conjunto de protocolos para a geração e criopreservação de esferoides cardíacos (CSs) de cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidos por humanos cultivados em um formato multidimensional de alto rendimento. Esse modelo tridimensional funciona como uma plataforma robusta para modelagem de doenças, rastreios de alto rendimento e mantém sua funcionalidade após a criopreservação.

Geração, Triagem de Alto Rendimento e Biobanco de Esferoides Cardíacos Derivados de Células-Tronco Pluripotentes Induzidos por Humanos.

Este protocolo descreve a geração de vasos sanguíneos auto-organizadores a partir de células-tronco pluripotentes e pluripotentes induzidas humanas. Essas redes vasculares exibem uma extensa e conectada rede endotelial circundada por pericitos, actina de músculo liso e membrana basal contínua.

Geração de Organoides de Vasos Sanguíneos Humanos a partir de Células-Tronco Pluripotentes

Este protocolo apresenta um método para geração de organoides vasculares utilizando células-tronco pluripotentes humanas.

Geração de Organoides Vasculares a partir de Células-Tronco Pluripotentes Induzidas por Humanos

Organoides cardíacos humanos auto-assembláveis (hCOs) são um sistema emergente para modelar o desenvolvimento e as doenças cardíacas humanas. Aqui, são apresentadas uma metodologia para gerar e prejudicar hCOs com reoxigenação por hipóxia-oxigenação e detalhes dos resultados histológicos e funcionais esperados após a lesão.

Um modelo de lesão por hipóxia-reoxigenação em cardióides humanos auto-montantes

Aqui descrevemos protocolos para romper as células de mamíferos por moagem em estado sólido a uma temperatura criogénica, produzem um extracto celular a partir do pó de células resultante, e isolar complexos proteína de interesse por captura de afinidade sobre esferas paramagnéticas escala mícron acoplado com anticorpo.

Proteína de captura por afinidade complexos a partir de células de mamíferos Cryomilled

Aprenda a gerar organoides cardíacos humanos auto-montados a partir de células-tronco pluripotentes. Este protocolo reprodutível cria tecidos cardíacos complexos em 3D para modelar doenças cardiovasculares e triagem farmacológica.

Gerando organoides cardíacos humanos auto-montados derivados de células-tronco pluripotentes

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