Classificação do estado de ativação de células-tronco neurais in vitro usando autofluorescência
12 de abril de 2024
Este protocolo descreve estratégias para identificar e enriquecer o estado celular em culturas primárias de células-tronco neurais de camundongos adultos por imagem de autofluorescência usando i) um microscópio confocal, ii) um classificador de células ativadas fluorescentes para realizar imagens de intensidade ou iii) um microscópio multifotônico para realizar imagens de fluorescência ao longo da vida.
Este protocolo fornece uma nova abordagem para classificar o estado de ativação de células-tronco neurais com uma coorte de vantagens técnicas. Usando este protocolo, podemos obter uma análise de resolução de célula única sem marcação de células vivas do estado de ativação de células-tronco neurais. Este protocolo pode ser usado para lançar luz sobre os mecanismos que regulam a neurogênese adulta.
A autofluorescência é muito mais fraca do que muitos pesquisadores de fluoróforos estão acostumados a trabalhar. Tenha certeza de usar potências de laser mais altas para coletar seus dados. Demonstrando o procedimento estará Chris Morrow, um ex-aluno de pós-graduação do meu laboratório.
Comece configurando o microscópio confocal para imagens de autofluorescência. Clique em 405 Laser e digite na janela de emissão no menu 405 laser. Prossiga para clicar em TD para coletar uma imagem de luz transmitida e defina o valor HV para visualizar a amostra.
Ajuste a potência do laser para 3.5% e defina o ganho para 75. Defina o zoom para dois. Para os parâmetros de varredura confocal, defina a permanência de pixel para 0,5 e a resolução para 2048 por 2048 pixels.
Usando lente objetiva de imersão em óleo 60X sob campo claro, coloque as células em foco. Clique em Eye Port para alternar para o modo de varredura confocal. Certifique-se de que o caminho da luz esteja direcionado para o cabeçote de varredura e confirme se nenhum cubo de filtro está obstruindo o caminho da luz.
Clique em Digitalizar, concentre-se na imagem e clique em Capturar para adquirir imagens de autofluorescência em células-tronco neurais quiescentes e células-tronco neurais ativas. Certifique-se de coletar imagens de plano único com o citoplasma das células em foco para uma seção transversal representativa de cada célula. Inicie a geração de imagens com baixa potência do laser e aumente gradualmente a potência até que o sinal de autofluorescência seja detectável sem causar saturação.
Analise células-tronco neurais quiescentes e células-tronco neurais ativas com um citômetro de fluxo usando um bico de 130 micrômetros. Aplique condições ópticas de acordo com as capacidades do instrumento e detecte a autofluorescência pontilhada. Colete pelo menos 10.000 qNSCs e aNSCs singlete em um arquivo de dados.
Utilize esses dados para projetar portas para coletar uma população enriquecida de qNSCs ou aNSCs. Em seguida, classifique as células singlete em poços revestidos de laminina PLO preenchidos com meio aNSC. Após o FACS, permita que as células-tronco neurais incubem por três horas.
Para fixar as células, adicione 4% de paraformaldeído, garantindo que seja suficiente para cobrir o fundo do prato e incubar. Após 15 minutos, permeabilize as células com 0,25% de Triton em PBS por 15 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, trate as células com uma solução de coloração EdU em temperatura ambiente por 30 minutos.
Em seguida, lave as amostras três vezes por 10 minutos cada com PBS. Comece usando as oculares para localizar um campo de visão adequado e ajuste o caminho da luz para a amostra no microscópio para permitir a imagem no escuro com o multifóton. Configure para a coleta de imagens do canal um.
Navegue até a guia de ganho de potência e ajuste o ganho no PMT para 800. Clique na guia Laser 2P e selecione 750 nanômetros para o comprimento de onda do laser e certifique-se de que o cubo de filtro correto seja usado. Para coletar a imagem do canal um, clique na guia Ganho de potência e defina os Pockels como 30.
Em seguida, prossiga para a seção de digitalização da tela e clique em Live Scan para iniciar o modo de visualização. Aumente gradualmente os Pockels para obter um campo de visão adequado com baixa potência do laser. Uma vez identificado um campo de visão adequado, ajuste a potência do laser para 3.6 miliwatts.
Em seguida, prossiga para a seção de digitalização e clique em varredura única para capturar uma imagem do canal um em 60 segundos. Para coletar uma imagem do canal dois, clique na guia Laser 2P e selecione 890 nanômetros para o laser. Substitua o cubo do filtro pelo cubo de emissão do canal dois.
Inicie o modo de visualização. Aumente os Pockels até que o medidor de potência mostre aproximadamente sete miliwatts e as contagens de CFD estejam entre 10.000 e 100.000. Clique em varredura única e capture uma imagem do canal dois durante 60 segundos.
A imagem de autofluorescência confocal foi empregada para diferenciar entre células-tronco neurais quiescentes e células-tronco neurais ativadas. Verificou-se que os qNSCs exibem um número maior de PAF do que os aNSCs, demonstrando o uso da autofluorescência como marcador para identificação do estado celular. Usando FACS, os estados das células NSC foram enriquecidos com base na autofluorescência.
As células classificadas a partir da porta de alta autofluorescência apresentaram uma taxa de proliferação menor em comparação com a amostra mista, enquanto as da porta de baixa autofluorescência foram mais proliferativas, confirmando o enriquecimento dos estados de ativação do NSC. Além disso, o FLIM foi utilizado para avaliar a autofluorescência do NSC e discernir o estado de ativação dos NSCs. Notavelmente, os qNSCs mostraram um tempo médio de vida mais alto de fluorescência no canal um, mas uma proporção menor do componente de fluorescência alfa um em comparação com os aNSCs.
Um modelo de regressão logística incorporando dados de ambos os canais produziu uma capacidade preditiva quase perfeita para os estados de ativação do NSC, conforme indicado por uma curva característica do operador receptor ressaltando o potencial do FLIM na classificação dos estados do NSC. Seguindo este procedimento, seria bom validar os resultados usando outras abordagens para medir o estado de ativação das células-tronco neurais.
Visão Geral
Este protocolo apresenta técnicas para identificar e enriquecer estados celulares em culturas primárias de células-tronco neurais de camundongos adultos utilizando imagem de autofluorescência. O estudo emprega microscopia confocal, citometria de fluxo ativada por fluorescência (FACS) e microscopia multiphotônica para analisar os estados de ativação de células-tronco neurais, aprimorando a compreensão da neurogênese adulta.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia Celular
- Tecnologia de Imagem
Contexto
- As células-tronco neurais (NSCs) desempenham um papel crucial na neurogênese e na reparação cerebral.
- Compreender os estados de ativação das NSCs pode fornecer insights sobre seus papéis na função cerebral.
- Os métodos atuais careciam de técnicas precisas para avaliar os estados das NSCs com resolução em nível de célula única.
- A imagem de autofluorescência oferece uma abordagem inovadora para analisar células vivas sem marcação.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um protocolo para análise, sem marcação, de células vivas nos estados de ativação de células-tronco neurais.
- Enriquecer células-tronco neurais quiescentes e ativadas utilizando a autofluorescência como marcador.
- Explorar os mecanismos que regulam a neurogênese adulta por meio de técnicas de imagem aprimoradas.
Métodos Utilizados
- A imagem foi obtida utilizando um microscópio confocal e um microscópio multiphotônico.
- Culturas primárias de células-tronco neurais adultas de camundongo foram utilizadas como modelo biológico.
- Nenhuma análise multiômica ou metabólica foi realizada neste estudo.
- O protocolo envolveu etapas para configuração do confocal, FACS para separação celular e análise de autofluorescência.
- As etapas críticas incluíram a otimização dos parâmetros de potência do laser e a separação de populações celulares com base na intensidade de autofluorescência.
Resultados Principais
- A imagem de autofluorescência diferenciou com sucesso células-tronco neurais quiescentes e ativadas com base na intensidade do sinal.
- A citometria de fluxo permitiu o enriquecimento de células-tronco neurais, demonstrando diferenças nas taxas de proliferação entre as populações separadas.
- A imagem de tempo de vida de fluorescência (FLIM) revelou diferenças significativas nos tempos de vida e componentes de fluorescência entre cTNQs e cTNAcs.
- Um modelo de regressão logística indicou alta capacidade preditiva para identificar os estados de ativação das células-tronco neurais.
Conclusões
- Este estudo permite a identificação e análise avançadas dos estados de ativação de células-tronco neurais, o que é fundamental para compreender a neurogênese.
- O uso da autofluorescência e da citometria de fluxo com classificação celular (FACS) apresenta potencial para pesquisas futuras em plasticidade neural e biologia de células-tronco.
- Os conhecimentos obtidos podem orientar estratégias terapêuticas em condições neurodegenerativas.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este protocolo fornece um método sem marcadores e com resolução em nível de única célula para classificar estados de ativação de células-tronco neurais utilizando autofluorescência, permitindo a desmistificação mecanicista na validação de alvos em vias relacionadas à neurogênese. Ao distinguir estados quiescentes e ativados sem marcadores exógenos, o método reforça a confiança preditiva no estágio inicial de descoberta e reduz ambiguidades biológicas em estratégias terapêuticas baseadas em células-tronco. A abordagem aprimora a continuidade translacional, desde a descoberta até a pesquisa pré-clínica, ao oferecer uma ferramenta reutilizável e escalonável para avaliar a dinâmica de estados celulares em sistemas relevantes para doenças.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvos
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas mediante a classificação de estados de ativação de CENs com base em marcadores de autofluorescência endógenos.
- Valor Operacional: Apoia a desmistificação biológica por meio de análise de células vivas sem marcação, que preserva a função celular nativa durante a discriminação de estados.
- Valor Preditivo: Facilita a triagem de portfólios ao quantificar diferenças na proliferação e no tempo de fluorescência entre CENqs e CENas utilizando FACS e FLIM.
Desenvolvimento de Ensaios e Triagem
- Prontidão do Ensaio: Prepara sistemas biológicos validados para fluxos de trabalho downstream mediante o enriquecimento de populações de qNSC ou aNSC por meio do direcionamento FACS baseado na intensidade da autofluorescência.
- Reprodutibilidade: Padroniza a avaliação do estado de ativação por meio de medições quantitativas da intensidade de autofluorescência e do tempo de vida da fluorescência.
- Escalabilidade: Permite a reutilização da plataforma em diferentes estudos ao estabelecer um método livre de marcadores compatível com imagem confocal, FACS e multiphoton.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Relevância para Doenças: Alinha-se aos mecanismos de neurogênese adulta, oferecendo um sistema compatível com biomarcadores translacionais para estudar a saída da quiescência de CNTs em modelos pré-clínicos.
- Redução Preditiva de Riscos: Apoia decisões de avanço com ajuste de risco ao vincular assinaturas de autofluorescência a desfechos funcionais como taxa de proliferação e reentrada no ciclo celular.
- Continuidade Translacional: Conecta descoberta e validação pré-clínica ao fornecer uma leitura consistente e livre de marcadores em diferentes modalidades de imagem e separação celular.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se integra ao continuum de descoberta, desde a testagem de hipóteses até a identificação de compostos líderes, apoiando o desenvolvimento de ensaios e análises com resultados quantitativos e livres de marcadores que orientam decisões de prosseguir ou não em programas direcionados a células-tronco.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses e a clarificação de vias ao permitir a classificação em tempo real dos estados de ativação de células-tronco neurais sem perturbar a sinalização nativa.
- Triagem: Oferece prontidão para ensaios por meio do enriquecimento baseado em FACS de populações puras de qNSC ou aNSC para aplicações de triagem de compostos.
- Análises: Fornece leituras quantitativas, incluindo intensidade de autofluorescência, tempo de vida de fluorescência e análise de componentes, para comparar estados de ativação em diferentes condições.
- Pesquisa Translacional: Conecta-se à continuidade pré-clínica ao permitir o acompanhamento longitudinal da dinâmica de saída da quiescência utilizando FLIM em modelos relevantes para doenças.
- Reutilização Corporativa: Funciona como uma capacidade reutilizável em diversos projetos devido à sua natureza livre de marcadores e compatibilidade com microscopia padrão e infraestrutura de citometria de fluxo.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na validação de alvos ao reduzir a ambiguidade mecanicista nas transições de estado das CEN.
- Valor Operacional: Aprimora a padronização e reprodutibilidade por meio de métricas de autofluorescência independentes de instrumentos, aplicáveis entre diferentes laboratórios.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de avançar/não avançar ao permitir a detecção precoce de moduladores ineficazes da ativação das CEN, reduzindo riscos biológicos em estágios avançados.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco ao identificar compostos que modulam de forma confiável a transição de CENq para CENa, com assinaturas de fluorescência mensuráveis.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em microscopia confocal, citometria de fluxo e FLIM multiphoton para detecção e interpretação precisas do sinal.
- Depende do ajuste do laser e da sensibilidade do detector devido à baixa intensidade inerente da autofluorescência endógena.
- Necessita padronização entre equipes dos parâmetros de imagem (potência do laser, ganho, comprimento de onda) para garantir classificação reprodutível dos estados de ativação.
- Envolve considerações de adaptação ao aplicar o método a diferentes fontes de CENs ou condições de cultura que afetam o fundo de autofluorescência.
- Limitado pela necessidade de otimização cuidadosa para evitar danos por fototoxicidade, ao mesmo tempo em que se alcança uma relação sinal-ruído suficiente para discriminação de estados.
Perguntas Frequentes sobre Biotecnologia Farmacêutica
Chapters in this video
0:00
Introduction
0:39
Imaging Autofluorescence in Live qNSCs and aNSCs Using Confocal Microscope
2:13
Autofluorescence Based FACS Enrichment for NSC Activation State in Cultured NSCs
3:36
Using Multiphoton Microscope to Perform Fluorescence Lifetime Imaging on NSCs In Vitro
5:20
Results: Deciphering Neural Stem Cell Activation States Through Advanced Fluorescence Imaging Techniques
6:45
Conclusion
