Name: Isolamento de células endoteliais do lúmen de artérias carótidas de camundongos para experimentos multi-ômicos unicelulares (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 12 s
Description: Aprenda a isolar células endoteliais de artérias carótidas de camundongos para análises multi-ômicas unicelulares. Este método permite estudar respostas ao fluxo sanguíneo perturbado e identificar alvos terapêuticos para aterosclerose.

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Este trabalho foi apoiado pelo financiamento dos subsídios dos Institutos Nacionais de Saúde HL119798, HL095070 e HL139757 para HJ. HJ também é apoiado pelo Wallace H. Coulter Distinguished Faculty Chair Professorship. Os serviços prestados pelo Emory Integrated Genomics Core (EIGC) foram subsidiados pela Escola de Medicina da Universidade de Emory e também foram parcialmente apoiados pela Georgia Clinical and Translational Science Alliance dos Institutos Nacionais de Saúde sob o número de prêmio. UL1TR002378. O conteúdo fornecido acima é de responsabilidade exclusiva dos autores e não reflete as opiniões oficiais dos Institutos Nacionais de Saúde.

Todos os procedimentos animais descritos abaixo foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Emory. Camundongos C57BL/6 não hipercolesterolêmicos, pareados por idade e sexo foram usados para mitigar a variação dependente do sexo e compensar qualquer complicação de condições hipercolesterolêmicas.
1. Cirurgia de ligadura parcial da carótida (LCP)
NOTA: A ligadura parcial da artéria carótida da ACL foi realizada conforme descrito e demonstrado anteriormente3.
<ol><li>Anestesiar o camundongo por inalação de isoflurano (5% de isofluorano em oxigênio para indução e 1,5% depois para manutenção) durante todo o procedimento utilizando um vaporizador anestésico. Coloque o rato em decúbito dorsal numa almofada isotérmica Deltaphase para evitar a perda de calor corporal durante a cirurgia.</li>
	<li>Aplique uma pomada ocular para evitar a ceratite de exposição e confirme a profundidade da anestesia pela ausência de resposta de beliscão do dedo do pé.</li>
	<li>Injete buprenorfina 0,05 mg/kg por via subcutânea para controlar a dor preventivamente. Desinfetar a área depilada aplicando e limpando com betadina e solução de isopropanol três vezes. Certifique-se de que a betadina é o último passo para esterilizar a área da cirurgia, começando pelo centro e terminando nas laterais.</li>
	<li>Usando técnicas assépticas, faça uma incisão ventral na linha média (~ 1 cm) na região do pescoço e exponha o ponto de ramificação da ACV por dissecção contundente.</li>
	<li>Lige as artérias carótida interna esquerda, carótida externa e occipital com sutura de seda 6-0; deixar a artéria tireoidiana superior intocada.</li>
	<li>Aproxime a pele e feche a incisão com cola de tecido e/ou suturas.</li>
	<li>Transfira o rato para uma gaiola de recuperação pré-aquecida (mantida a 37 °C) e coloque-o numa toalha limpa até 1 h para evitar hipotermia pós-cirúrgica. NOTA: Em nossa experiência, uma dose única preventiva de buprenorfina (0,05 mg/kg) geralmente é suficiente para o controle da dor pós-cirúrgica. Uma dose repetida de buprenorfina pode ser administrada se o animal estiver em perigo após as primeiras 24 horas. Se realizado corretamente, não há mortalidade associada a este procedimento, e o estresse pós-operatório para o camundongo é mínimo. Os ratos são devolvidos às suas respectivas gaiolas e monitorados diariamente após a cirurgia.</li>
	<li>Prepare a configuração de perfusão.<ol><li>Use NaCl a 0,9% (solução salina normal) contendo 10 U/mL de heparina em um saco intravenoso. Gancho o saco IV 244-274 cm (8-9 pés) do chão ou aproximadamente 122-152 cm (4-5 pés) mais alto do que a placa de dissecção. Anexe a agulha da borboleta ao final da linha salina e libere todas as bolhas de ar para fora da linha IV.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Isolamento das artérias carótidas após o sacrifício
<ol><li>Sacrificar os camundongos por inalação de CO2 seguindo o protocolo institucional da IACUC.</li>
	<li>Pulverize etanol a 70% na pele do rato e coloque-o na posição supina sobre a placa de dissecação contendo toalhas de papel adsorventes. Prenda as patas do rato às toalhas adsorventes na placa de dissecação usando fita adesiva ou uma agulha 21 G.</li>
	<li>Usando um par de tesouras estéreis, remova a pele do rato a partir do abdômen e até o topo do tórax.</li>
	<li>Use um par de tesouras para abrir a parede abdominal abaixo da caixa torácica por dissecção contundente.</li>
	<li>Usando a tesoura, faça cuidadosamente uma incisão ao longo do comprimento do diafragma e continue através das costelas em ambos os lados do tórax até que o esterno possa ser levantado. Levante suavemente o esterno com um par de pinças; depois disso, remova a caixa torácica para expor o coração.</li>
	<li>Remova cuidadosamente o timo e qualquer tecido conjuntivo sobre o coração para visualizar os principais vasos.</li>
	<li>Separe a veia cava com uma tesoura para permitir que o sangue saia da circulação fechada.</li>
	<li>Insira uma agulha de borboleta 21 G conectada à linha IV através do ápice do coração no ventrículo esquerdo e permita a perfusão retrógrada por 2-3 min com solução salina normal à temperatura ambiente. Certifique-se de que uma taxa de fluxo constante de solução salina normal seja mantida, mantendo o saco salino na altura de 8-9 pés do solo. NOTA: Os pulmões e o fígado ficam pálidos, indicando perfusão ideal. Aproximadamente 20 mL de tampão de perfusão são usados para cada rato.</li>
	<li>Remova a pele da região do pescoço e remova toda a gordura, músculos e tecidos conjuntivos para expor as artérias carótidas (Figura 1A). NOTA: O resto do procedimento é realizado sob o microscópio de dissecação.</li>
	<li>Ajuste o campo de visão para localizar os locais de ligadura. Usando a tesoura de microdissecção de 10 mm, faça uma pequena incisão abaixo do local da ligadura na ACV para permitir a perfusão.</li>
	<li>Perfunda novamente por mais 1 min através do ventrículo esquerdo e certifique-se de que a ACV está bem perfundida e livre de quaisquer vestígios visíveis de sangue.</li>
	<li>Use pinças de ponta fina e pequenas tesouras de mola para remover cuidadosamente os tecidos peri-adventícios ao redor das carótidas enquanto a carótida está ligada ao corpo. NOTA: Tenha muito cuidado para não espremer ou esticar as artérias carótidas durante esta etapa de limpeza, pois isso pode aumentar o número de células inviáveis. Se realizada corretamente, a viabilidade celular na suspensão celular final é geralmente de >93%.</li>
</ol>3. Isolamento unicelular enriquecido com células endoteliais de carótidas de camundongos
NOTA: Os reagentes a seguir descritos podem ser preparados com antecedência e armazenados a 4 °C até a utilização: tamponadores de lise de núcleos únicos de 1x e 0,1x com os reagentes listados na Tabela 1; tampão de lavagem de núcleos únicos com os reagentes listados na Tabela 1; receita de tampão de núcleos únicos com os reagentes listados na Tabela 1. As existências de trabalho destes reservatórios devem ser preparadas de acordo com o protocolo do fabricante. Composição do tampão de digestão: Colgenase Tipo II 600 U/mL e DNase I 60 U/mL em soro fetal bovino (FBS) contendo solução salina tamponada com fosfato (PBS) a 0,5%.
<ol><li>Enquanto as carótidas ainda estão ligadas, lave o exterior das artérias carótidas com solução salina normal para eliminar quaisquer vestígios de sangue.</li>
	<li>Usando uma seringa de insulina equipada com uma agulha de 29 G, injete ~ 50 μL do tampão de digestão no lúmen da extremidade distal da artéria carótida esquerda. À medida que o tampão de digestão começa a preencher a artéria carótida, prenda a extremidade proximal da carótida com um microclipe (Figura 1B). Introduza um adicional de 15-20 μL de tampão de digestão no lúmen e prenda a extremidade distal para evitar a liberação do tampão de digestão.</li>
	<li>Explantar cuidadosamente as artérias carótidas do rato (Figura 1B,C) e colocá-las em placas de 35 mm contendo solução salina quente (a 37 °C) tamponada com hepes. NOTA: Certifique-se de que ambas as braçadeiras estão colocadas de forma segura. Se o grampo se soltar, a solução de digestão pode vazar para fora do lúmen e afetar a contagem de células obtida. Se isso acontecer, adicione solução enzimática adicional usando uma seringa de insulina equipada com uma agulha de 29 G da extremidade aberta da carótida e prenda a braçadeira novamente (Figura 1D). Se a solução tampão enzimática vazar novamente, é provável que a carótida seja cortada durante o processo de explante. Neste caso, descarte a carótida e exclua a amostra do estudo. O manuseio áspero repetido da carótida diminuirá a viabilidade celular e a qualidade da preparação de uma única célula. Tome cuidado para identificar e rotular corretamente as artérias carótidas esquerda e direita.</li>
	<li>Incubar as carótidas explantadas durante 45 min a 37 °C com balanço intermitente.</li>
</ol>4. Rubor das artérias carótidas
<ol><li>Depois de completar a digestão enzimática luminal, remova a artéria carótida juntamente com os grampos do prato de 35 mm. Remova cuidadosamente cada braçadeira, tomando cuidado para que o tampão de digestão não vaze.</li>
	<li>Segure suavemente uma extremidade da artéria carótida com pinça fina em cima de um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Inserir uma agulha de 29 G equipada com uma seringa de insulina contendo 100 μL de tampão de digestão quente (37 °C) no lúmen com a outra mão (figura 1D).</li>
	<li>Lave rapidamente o lúmen da carótida no tubo de microcentrífuga. Bloquear a reação enzimática adicionando 0,3 mL de FBS no tubo de 1,5 mL. Coloque o tubo no gelo. NOTA: A lavagem contém as células da digestão enzimática luminal. A adição de FBS e a redução da temperatura interrompem o processo de digestão enzimática. Se o número de células na preparação for alto e contiver detritos ou tecido adiposo, o uso de um filtro celular de 50 ou 70 μm é altamente recomendado para filtrar detritos de tecidos indesejados. Para aumentar a contagem de células únicas, recomenda-se a lavagem de várias carótidas. Aqui, para obter pelo menos 5.000 células, 10-12 carótidas foram lavadas e agrupadas como uma amostra.</li>
	<li>Centrifugar as células a 500 × g durante 5 min a 4 °C utilizando uma centrífuga equipada com um rotor de ângulo fixo (ver Tabela de Materiais).</li>
	<li>Rejeitar o sobrenadante e ressuspender o pellet celular em tampão de digestão contendo reagente de dissociação celular (ver Tabela de Materiais) durante 5 min a 37 °C para separar todas as células em células únicas. NOTA: Se o número de células na preparação for baixo, aumente a velocidade da centrífuga até 2.000-3.000 × g para girar as células. Além disso, o uso de tubos de centrífuga de 0,5 mL facilita uma melhor visualização da pastilha celular na parte inferior do tubo.</li>
	<li>Bloqueie a reação enzimática adicionando 0,15 mL de FBS ao tubo de 0,5 mL.</li>
	<li>Centrifugar a suspensão de célula única a 500 × g durante 5 minutos a 4 °C utilizando uma centrífuga equipada com um rotor de ângulo fixo, como na etapa 4.4.</li>
	<li>Rejeitar o sobrenadante e ressuspender as células em 100 μL de solução gelada de albumina sérica bovina a 1% (BSA) em PBS em um tubo de microcentrífuga de 0,2 mL. NOTA: O uso de tubos de centrífuga de 0,2 mL melhora a visualização do pellet de célula única na parte inferior do tubo.</li>
</ol>5. Análises unicelulares e unicelulares
<ol><li>Ressuspeite e submeta a preparação de célula única para scRNAseq.<ol><li>Ressuspender o pellet unicelular com 100 μL de BSA gelado a 1% em PBS em um tubo de 0,2 mL.</li>
		<li>Depois de ressuspender as células para encapsulamento de célula única, prossiga imediatamente para encapsulamento de célula única e codificação de barras usando um sistema de particionamento e código de barras de célula única baseado em microfluídica (consulte a Tabela de Materiais).</li>
		<li>Antes de submeter as amostras ao Núcleo Genómico, contar e inspeccionar as preparações unicelulares; assegurar a ausência de agregados celulares. NOTA: A agregação de células individuais pode ser ainda mais minimizada aumentando a quantidade de BSA em até 2%.</li>
	</ol></li>
	<li>Suspenda novamente e envie a preparação de célula única para scATACseq.<ol><li>Ressuspender o pellet celular em 100 μL de BSA a 0,04% em PBS gelado a 1x e centrifugar a suspensão de célula única a 500 × g a 4 °C.</li>
		<li>Lisar a suspensão unicelular com tampão de lise gelado 0,1x (Tabela 1) e incubar por 5 min no gelo.</li>
		<li>Misture o lisado 10 vezes com uma pipeta P-20 e incube por mais 10 minutos.</li>
		<li>Adicionar 500 μL de tampão de lavagem refrigerado (Tabela 1) às células lisadas e misturar 5 vezes utilizando uma pipeta. NOTA: Use um filtro de células de 70 μm para filtrar quaisquer detritos da suspensão celular e transferi-los para um tubo de 2 mL.</li>
		<li>Centrifugar o lisado a 500 × g durante 5 min a 4 °C. Rejeitar o sobrenadante e ressuspender o pellet de núcleos no tampão de núcleos diluídos (150 μL) (ver Tabela de Materiais e Tabela 1). Contar e inspecionar as preparações de núcleos únicos utilizando um hemocitômetro11.</li>
		<li>Envie a amostra de núcleos únicos para o Núcleo Genômico para transposição de núcleos únicos, particionamento de núcleos, preparação de biblioteca e sequenciamento. NOTA: Se o número inicial de células for baixo, é comum observar detritos ao longo dos núcleos. Portanto, recomenda-se começar com um número de células alto.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Kumar, S., Kang, D. W., Rezvan, A., Jo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+atherosclerosis+development+in+C57Bl6+mice+by+overexpressing+AAV-mediated+PCSK9+and+partial+carotid+ligation%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Investigation%22%5BJournal%5D)">Accelerated atherosclerosis development in C57Bl6 mice by overexpressing AAV-mediated PCSK9 and partial carotid ligation.</a> Laboratory Investigation. 97 (8), 935-945 (2017).</li>
<li>Nam, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partial+carotid+ligation+is+a+model+of+acutely+induced+disturbed+flow%2C+leading+to+rapid+endothelial+dysfunction+and+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+Heart+and+Circulation+Physiology%22%5BJournal%5D)">Partial carotid ligation is a model of acutely induced disturbed flow, leading to rapid endothelial dysfunction and atherosclerosis.</a> American Journal of Physiology Heart and Circulation Physiology. 297 (4), 1535-1543 (2009).</li>
<li>Nam, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+model+of+disturbed+flow-induced+atherosclerosis+in+mouse+carotid+artery+by+partial+ligation+and+a+simple+method+of+RNA+isolation+from+carotid+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">A model of disturbed flow-induced atherosclerosis in mouse carotid artery by partial ligation and a simple method of RNA isolation from carotid endothelium.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (40), e1861(2010).</li>
<li>Dunn, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow-dependent+epigenetic+DNA+methylation+regulates+endothelial+gene+expression+and+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Flow-dependent epigenetic DNA methylation regulates endothelial gene expression and atherosclerosis.</a> Journal of Clinical Investigation. 124 (7), 3187-3199 (2014).</li>
<li>Kumar, S., Kim, C. W., Son, D. J., Ni, C. W., Jo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow-dependent+regulation+of+genome-wide+mRNA+and+microRNA+expression+in+endothelial+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Data%22%5BJournal%5D)">Flow-dependent regulation of genome-wide mRNA and microRNA expression in endothelial cells in vivo.</a> Scientific Data. 1 (1), 140039(2014).</li>
<li>Ni, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+novel+mechanosensitive+genes+in+vivo+using+mouse+carotid+artery+endothelium+exposed+to+disturbed+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Discovery of novel mechanosensitive genes in vivo using mouse carotid artery endothelium exposed to disturbed flow.</a> Blood. 116 (15), 66-73 (2010).</li>
<li>Son, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+atypical+mechanosensitive+microRNA-712+derived+from+pre-ribosomal+RNA+induces+endothelial+inflammation+and+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">The atypical mechanosensitive microRNA-712 derived from pre-ribosomal RNA induces endothelial inflammation and atherosclerosis.</a> Nature Communications. 4, 3000(2013).</li>
<li>Andueza, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+reprogramming+by+disturbed+flow+revealed+by+single-cell+RNA+and+chromatin+accessibility+study%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Endothelial reprogramming by disturbed flow revealed by single-cell RNA and chromatin accessibility study.</a> Cell Reports. 33 (11), 108491(2020).</li>
<li>Stuart, T., Srivastava, A., Lareau, C., Satija, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multimodal+single-cell+chromatin+analysis+with+Signac%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Multimodal single-cell chromatin analysis with Signac.</a> bioRxiv. , (2020).</li>
<li>Stuart, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+integration+of+single-cell+data%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Comprehensive integration of single-cell data.</a> Cell. 177 (7), 1888-1902 (2019).</li>
<li>Crowley, L. C., Marfell, B. J., Christensen, M. E., Waterhouse, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+cell+death+by+trypan+blue+uptake+and+light+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Measuring cell death by trypan blue uptake and light microscopy.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2016 (7), (2016).</li>
<li>Li, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+RNA-seq+reveals+cellular+heterogeneity+of+mouse+carotid+artery+under+disturbed+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Discovery%22%5BJournal%5D)">Single-cell RNA-seq reveals cellular heterogeneity of mouse carotid artery under disturbed flow.</a> Cell Death and Discovery. 7 (1), 180(2021).</li>
<li>Wu, Y. E., Pan, L., Zuo, Y., Li, X., Hong, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+activated+cell+populations+using+single-cell+RNA-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Detecting activated cell populations using single-cell RNA-seq.</a> Neuron. 96 (2), 313-329 (2017).</li>
<li>O'Flanagan, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissociation+of+solid+tumor+tissues+with+cold+active+protease+for+single-cell+RNA-seq+minimizes+conserved+collagenase-associated+stress+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Dissociation of solid tumor tissues with cold active protease for single-cell RNA-seq minimizes conserved collagenase-associated stress responses.</a> Genome Biology. 20 (1), 210(2019).</li>
</ol>

HJ é o fundador da FloKines Pharma. Outros autores não têm conflitos de interesse a declarar.

Este artigo fornece um protocolo detalhado para isolar preparações unicelulares das artérias carótidas de camundongos. A influência do fluxo d nas células endoteliais pode ser estudada com precisão se a cirurgia de LCP for realizada corretamente. É crucial identificar corretamente os ramos da carótida comum, como a carótida externa, a carótida interna, a artéria occipital e a artéria tireoidiana superior. A validação dos padrões de fluxo por ultrassonografia valida ainda mais o início bem-sucedido das condiç...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/63128">Isolation of Endothelial Cells from the Lumen of Mouse Carotid Arteries for Single-cell Multi-omics Experiments</a>. The Authors section was&#160;updated.
The Authors section was updated from:
Sandeep Kumar*1 
Aitor Andueza*1 
Juyoung Kim1 
Dong-Won Kang1 
Hanjoong Jo1,2 
1Wallace H. Coulter Department of Biomedical Engineering, Georgia Institute of Technology and Emory University, 2Division of Cardiology, Georgia Institute of Technology and Emory University 
* These authors contributed equally
to:
Sandeep Kumar*1 
Aitor Andueza*1 
Nicolas Villa-Roel1 
Juyoung Kim1 
Dong-Won Kang1 
Hanjoong Jo1,2 
1Wallace H. Coulter Department of Biomedical Engineering, Georgia Institute of Technology and Emory University, 2Division of Cardiology, Georgia Institute of Technology and Emory University 
* These authors contributed equally

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/63128">Isolation of Endothelial Cells from the Lumen of Mouse Carotid Arteries for Single-cell Multi-omics Experiments</a>. The Authors section was&#160;updated.

Erratum: Isolation of Endothelial Cells from the Lumen of Mouse Carotid Arteries for Single-cell Multi-omics Experiments

Este laboratório demonstrou anteriormente que a indução do fluxo d leva ao desenvolvimento rápido e robusto de aterosclerose em camundongos hiperlipidêmicos 1,2. O novo modelo de aterosclerose induzida por fluxo d em camundongos foi possível usando a cirurgia de ligadura parcial da carótida (LCP) 3. A cirurgia de LCP induz a condição de fluxo sanguíneo baixo e oscilatório ou fluxo d na artéria carótida esquerda ligada (ACV). Em contraste, a artéria carótida direita (ACR) contralateral continua a enfrentar fluxo laminar estável (s-flow). Anteriormente, para entender o efeito do fluxo d nas células endoteliais, as artérias carótidas foram dissecadas após a cirurgia de ligadura parcial e lavadas com um agente lisador à base de isotiocianato de fenol e guanidina (método de liberação de RNA/DNA luminal)2,4, que forneceu RNAs ou DNAs "a granel agrupados" enriquecidos com endotélio. Esses RNAs ou DNAs agrupados a granel foram então processados para estudos transcriptômicos ou estudos epigenômicos de metiloma de DNA, respectivamente 4,5,6. Esses estudos ajudaram a descobrir múltiplos genes sensíveis ao fluxo e microRNAs cujos papéis na biologia endotelial e na aterosclerose foram extensivamente investigados 4,6,7.
No entanto, apesar do enriquecimento endotelial, esses estudos de RNA/DNA em massa não conseguiram distinguir o papel específico de cada tipo de célula na parede da artéria na aterosclerose induzida pelo fluxo d. Isolamento unicelular (sc) enriquecido com endotélio e estudos de sequenciamento de scRNA e scATAC foram realizados para superar essa limitação8. Para isso, camundongos C57Bl6 foram submetidos à cirurgia de LCP para induzir o fluxo d na ACV enquanto usavam o RCA exposto ao fluxo s como controle. Dois dias ou duas semanas após a cirurgia de LCP, os ratos foram sacrificados e as carótidas foram dissecadas e limpas. O lúmen de ambos os LCAs e RCAs foi infundido com colagenase, e os digestos de colagenase luminal contendo CEs como fração significativa e outras células arteriais foram coletadas. A suspensão de célula única (scRNAseq) ou a suspensão de núcleos únicos (scATACseq) foram preparadas e codificadas com identificadores únicos para cada célula ou núcleo usando uma configuração de Genômica 10x. Os RNAs foram submetidos à preparação da biblioteca de cDNA e sequenciados.
Os conjuntos de dados scRNAseq e scATACseq foram processados utilizando o Cell Ranger Single-Cell Software e posteriormente analisados pelos pacotes Seurat e Signac R 9,10. A cada célula e núcleo foi atribuído um tipo de célula a partir dessas análises e agrupados no tipo de célula com base nos genes marcadores e padrões únicos de expressão gênica. Os resultados do scRNAseq e scATACseq demonstraram que essas preparações de célula única são enriquecidas com CEs e também contêm células musculares lisas (SMCs), fibroblastos e células imunes.
Uma análise mais aprofundada revelou que a população CE na digestão luminal é altamente divergente e plástica (8 clusters CE diferentes) e responsiva ao fluxo sanguíneo. Mais importante ainda, esses resultados demonstraram que o fluxo d reprograma as CEs de um fenótipo anti-inflamatório protegido por ateróbio para fenótipos pró-aterogênicos, incluindo transição pró-inflamatória, endotelial para mesenquimal, transição de células-tronco endoteliais / progenitoras e, mais surpreendentemente, transição endotelial para célula imune. Além disso, os dados scATACseq revelam novas alterações de acessibilidade à cromatina dependentes do fluxo e locais de ligação ao fator de transcrição de maneira genômica, que formam a base de várias novas hipóteses. A metodologia e o protocolo para a preparação de células endoteliais únicas para estudos multi-ômicos de célula única das artérias carótidas de camundongos são detalhados abaixo.

<table><tbody><tr><td>Chemicals, Peptides, and Recombinant Proteins</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1x PBS (Cell Culture Grade)</td><td>Corning</td><td>21040CMX12</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL Protein LoBind Microcentrifuge Tubes</td><td>Eppendorf</td><td>022-43-108-1</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Centrifuge Tube - Foam Rack, Sterile</td><td>Fablab</td><td>FL4022</td><td></td></tr><tr><td>50 mL SuperClear Centrifuge Tubes</td><td>Labcon</td><td>3191-335-028</td><td></td></tr><tr><td>6-0 Sutura de Seda Estéril</td><td>Covidien</td><td>s-1172 c2</td><td></td></tr><tr><td>70 &micro; m Filtro de células, branco, estéril, embalado individualmente</td><td>Thermo Fisher Scientic</td><td>08-771-2</td><td></td></tr><tr><td>Solução de accutase,</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6964-100ML</td> filtrado <td>estéril ou</td></tr><tr><td>tampão ATAC equivalente (Componente I da mistura de transposição)</td><td>10x Genômica</td><td>2000122</td><td></td></tr><tr><td>Enzima ATAC (Componente II da mistura de transposição)</td><td>10x Genômica</td><td>2000123/ 2000138</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906-500G</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorfina</td><td>Med-Vet International</td><td>RXBUPRENOR5-V</td><td></td></tr><tr><td>Controlador de cromo & Próximo Kit de Acessórios GEM</td><td>10X Genômica</td><td>1000204</td><td></td></tr><tr><td>Cromo Próximo GEM Kits de Reagentes de Célula Única 3' v3.1</td><td>10X Genômica</td><td>1000121</td><td></td></tr><tr><td>Cromo Próximo GEM Kits de Reagentes ATAC de Célula Única v1.1</td><td>10X Genômica</td><td>1000175</td><td></td></tr><tr><td>Colagenase II</td><td>MP Biomedicals</td><td>2100502.5</td><td></td></tr><tr><td>Digitonina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D141-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Pinça de Dissecação</td><td>Roboz Surgical Instruments Co</td><td>RS-5005</td><td></td></tr><tr><td>Dnase1</td><td>New England Biolabs Inc</td><td>M0303S</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge (Benchtop-Model # 5425)</td><td>Eppendorf</td><td>22620444230VR</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum - Premium Select</td><td>R& D systems</td><td>S11550</td><td></td></tr><tr><td>Rotor de ângulo fixo</td><td>Eppendorf</td><td>FA-45-24-11-Kit Rotor</td><td></td></tr><tr><td>HEPES tamponado com solução salina</td><td>Millipore Sigma</td><td>51558</td><td></td></tr><tr><td>Seringa de insulina (seringa de 3/10 mL 29 G)</td> <td>BD</td><td>305932</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Patterson vet</td><td>789 313 89</td><td></td></tr><tr><td>MACs Smart Strainers (30 &micro; m)</td> <td>Miltenyi Biotec</td><td>130-098-458</td><td></td></tr><tr><td>MACS SmartStrainers (100 &micro; m)</td><td>&nbsp; Miltenyi Biotec</td><td>130-098-463</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina normal (cloreto de sódio a 0,9%)</td> <td>Baxter International Inc</td><td>2B1323</td><td></td></tr><tr><td>Tampão de núcleos (20x)</td> <td>10x Genomics</td><td>PN 2000153/2000207</td><td></td></tr><tr><td>PBS (10x), pH 7,4</td><td>Tesoura pequena Thermo Fisher Scientic</td><td>70011-044</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Roboz Surgical Instruments Co</td><td>RS-5675</td><td></td></tr><tr><td>Micro grampo de aço inoxidável que aplica o fórceps com fechamento</td><td>Instrumentos cirúrgicos Co. de Roboz</td><td>RS-5480</td><td>ou similar</td></tr><tr><td>Tissue Mend II</td><td>Webster Veteinanry</td><td>07-856-7946</td><td></td></tr><tr><td>Tipo II Collagenase</td><td>MP biomedicals</td><td>2100502.1</td><td></td></tr><tr><td>Deposited Data</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>scATACseq Arquivos</td><td>FastQ NCBI</td><td>www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject Adesão # PRJNA646233</td><td></td></tr><tr><td>arquivos scRNAseq FastQ</td><td>NCBI</td><td>www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject Access: # PRJNA646233</td><td></td></tr><tr><td>Software e Algoritmos</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cell Ranger 3.1.0</td><td>10X Genomics</td><td>https://support.10xgenomics.com/ exp</td><td></td>de gene de célula única</tr><tr><td>Cicero</td><td>Pliner et al., 2018</td><td>https://cole-trapnell-lab.github.io/cicero-release/</td><td></td></tr> <tr><td>Ggplot2 v3.2.1</td><td>Hadley Wickham</td><td>https://cran.r-project.org</td><td></td></tr><tr><td>Harmony</td><td>Korsunsky et al., 2019</td><td>https://github.com/immunogenomics/harmony</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>Schneider et al., 2012</td><td>https://imagej.nih.gov</td><td></td></tr><tr><td>Monocle 2.8.0</td><td>Qiu et al., 2017</td><td>https://github.com/cole-trapnell-lab/ versão</td><td></td></tr><tr><td>R versão 3.6.2</td><td>R Foundation</td><td></td><td></td>https://www.r-project.org</tr><tr><td>Seurat 3.1.3</td><td>Stuart et al., 2019</td><td>https://github.com/satijalab/seurat</td><td></td></tr><tr><td>Signac 0.2.5</td><td>Stuart et al., 2019</td><td>https://github.com/timoast/signac</td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento de células endoteliais do lúmen de artérias carótidas de camundongos para experimentos multi-ômicos unicelulares

Isolation of Endothelial Cells from the Lumen of Mouse Carotid Arteries for Single-Cell Multi-Omics Experiments

A aterosclerose é uma doença inflamatória das regiões arteriais expostas ao fluxo sanguíneo perturbado (fluxo d). O fluxo D regula a expressão de genes no endotélio nos níveis transcriptômico e epigenômico, resultando em respostas proaterogênicas. Recentemente, estudos de sequenciamento de RNA de célula única (scRNAseq) e ensaio de célula única para sequenciamento de cromatina acessível à transposase (scATACseq) foram realizados para determinar as alterações de acessibilidade transcriptômica e cromatina em uma resolução de célula única usando o modelo de ligadura parcial de carótida (PCL) de camundongo. Como as células endoteliais (CE) representam uma fração menor das populações celulares totais na parede da artéria, um método de digestão luminal foi usado para obter preparações unicelulares enriquecidas com CE. Para este estudo, camundongos foram submetidos à cirurgia de LCP para induzir o fluxo d na artéria carótida esquerda (ACV) enquanto usavam a artéria carótida direita (ACR) como controle. As artérias carótidas foram dissecadas dois dias ou duas semanas após a cirurgia de LCP. O lúmen de cada carótida foi submetido à digestão da colagenase, e células únicas enriquecidas com endotelial ou núcleos únicos foram obtidos. Essas preparações de célula única e núcleos únicos foram subsequentemente codificadas usando uma configuração microfluídica de 10x Genomics. As células únicas e os núcleos únicos com código de barras foram então utilizados para preparação de RNA, geração de biblioteca e sequenciamento em um sequenciador de DNA de alto rendimento. Após o processamento bioinformático, os conjuntos de dados scRNAseq e scATACseq identificaram vários tipos de células da digestão luminal, consistindo principalmente de CEs. Células musculares lisas, fibroblastos e células imunes também estavam presentes. Este método de enriquecimento CE ajudou a entender o efeito do fluxo sanguíneo no endotélio, o que poderia ter sido difícil com o método de digestão total da artéria. O método de preparação de célula única enriquecido com CE pode ser usado para realizar estudos de ômica de célula única em camundongos knockouts e transgênicos em que o efeito do fluxo sanguíneo sobre esses genes não foi estudado. É importante ressaltar que essa técnica pode ser adaptada para isolar células únicas enriquecidas com CE de explantes de artérias humanas para realizar estudos mecanicistas semelhantes.

Cirurgias de ligadura parcial da carótida foram realizadas em 44 camundongos, e o início do fluxo d na ACV foi validado pela realização de ultrassonografia um dia após a cirurgia de ligadura parcial. A cirurgia de ligadura parcial bem-sucedida causa redução da velocidade do fluxo sanguíneo e reverte o fluxo sanguíneo (fluxo perturbado) na ACV3. As artérias carótidas foram dissecadas aos dois dias ou duas semanas após a ligadura. O lúmen de cada carótida foi submetido à digestão da colagen...

Apresentamos um método para isolar células e núcleos endoteliais do lúmen de artérias carótidas de camundongos expostas a condições de fluxo estáveis ou perturbadas para a realização de experimentos ômicos unicelulares.

Isolamento de células endoteliais do lúmen de artérias carótidas de camundongos para experimentos multi-ômicos unicelulares

Atherosclerosis is an inflammatory disease of the arterial regions exposed to disturbed blood flow (d-flow). D-flow regulates the expression of genes in ...

Em um vaso sanguíneo, o número de células endoteliais é muito baixo, o que dificulta o estudo. Nosso protocolo elimina essa limitação e nos permite estudar novas vias moleculares e terapêuticas. Nosso protocolo nos permite obter amostras enriquecidas endoteliais e estudar como o fluxo perturbado agudo e crônico afeta esse tipo de célula.A capacidade de estudar as células endoteliais em mais detalhes torna possível definir genes-alvo e, portanto, potenciais terapêuticas para a aterosclerose visando as células endoteliais. O isolamento da artéria carótida é complicado e requer paciência e experiência. Para começar, prepare o animal injetando 0,05 miligramas por quilograma de buprenorfina por via subcutânea.Esterilizar a área depilada usando Betadine e solução de isopropanol três vezes. Faça uma incisão ventral na linha média de aproximadamente um centímetro na região do pescoço. Em seguida, exponha o ponto de ramificação da LCA por dissecção contundente.Lige as artérias carótida interna esquerda, carótida externa e occipital com suturas 6-0, deixando a artéria tireoidiana superior intocada. Feche a incisão com cola de tecido ou suturas. Transfira o rato para uma gaiola de recuperação pré-aquecida mantida a 37 graus Celsius.Coloque o rato sobre uma toalha limpa por até uma hora para evitar hipotermia pós-cirúrgica. Insira uma agulha de calibre 21 na linha IV conectada através do ápice do coração no ventrículo esquerdo. Permitir a perfusão retrógrada por dois a três minutos usando solução salina normal à temperatura ambiente.Mantenha uma taxa de fluxo constante aplicando pressão constante durante a injeção ou usando uma linha IV e mantendo o saco salino a uma altura de oito a nove pés. Remova a pele da região do pescoço com toda a gordura, músculos e tecidos conjuntivos para expor as artérias carótidas. Em seguida, remova os tecidos periadventícios ao redor das carótidas, deixando a carótida presa ao corpo.Faça uma incisão abaixo do local da ligadura na ACV para permitir a perfusão. Perfundir a ACV através do ventrículo esquerdo por mais um minuto para remover quaisquer vestígios de sangue. Lave o exterior das artérias carótidas com solução salina normal para remover quaisquer vestígios de sangue.Use uma seringa de insulina com uma agulha de calibre 29 para injetar 50 microlitros de tampão de digestão no lúmen da extremidade distal da artéria carótida esquerda. Use um microclipe para prender a extremidade proximal da artéria carótida cheia de tampão de digestão. Adicione 15 a 20 microlitros de tampão de digestão no lúmen e prenda a extremidade distal para evitar qualquer liberação de tampão de digestão.Transfira as artérias carótidas do rato para placas de 35 milímetros contendo solução salina tamponada quente de 37 graus Celsius HEPES. E incube-os por 45 minutos a 37 graus Celsius com balanço intermitente. Remova a artéria carótida com os grampos do prato de 35 milímetros após a digestão enzimática luminal ser concluída.Retire os grampos com cuidado, para que o tampão de digestão não vaze. Segure uma extremidade da artéria carótida em cima de um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro. Adicione 100 microlitros de tampão de digestão quente ao lúmen inserindo uma agulha de calibre 29 equipada com uma seringa de insulina.Lave rapidamente o lúmen da artéria carótida no tubo de microcentrífuga e, em seguida, adicione 0,3 microlitros de FBS no tubo para interromper a reação. Coloque o tubo de microcentrífuga no gelo. Centrifugar as células a 500 G durante cinco minutos a quatro graus Celsius, utilizando uma centrífuga equipada com um rotor de ângulo fixo e eliminar o sobrenadante.Ressuspenda as células em tampão de digestão, contendo reagente de dissociação celular, e incube-as por cinco minutos a 37 graus Celsius para separá-las em células únicas. Bloqueie a reação enzimática adicionando 0,15 mililitro de FBS ao tubo de 0,5 mililitro e repita a centrifugação. Descarte o sobrenadante e ressuspenda as células em 100 microlitros de solução gelada de 1% BSA em PBS em um tubo de microcentrífuga de 0,2 mililitros.Para análise de célula única, ressuspeite o pellet com 100 microlitros de 1%BSA gelado em PBS em um tubo de 0,2 mililitros. Para análise de núcleo único, ressuscite a pastilha de célula em 100 microlitros de 0,04% BSA em PBS gelado e centrifugar a suspensão de célula única a 500G a quatro graus Celsius por cinco minutos. Decomponha a suspensão de célula única com tampão de lise gelado e incube por cinco minutos no gelo.Misture o lisado com uma pipeta P20 e incube por mais 10 minutos. Depois, transfira o lisado em um tubo de 0,5 mililitro. Lave as células com 500 microlitros de tampão e misture-as com uma pipeta.Em seguida, repita a centrifugação. Descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet de núcleos em 150 microlitros do tampão de núcleos diluídos. Conte as preparações de núcleos únicos usando um hemocitômetro.Após o estudo de sequenciamento de núcleos únicos, núcleos únicos e de células únicas foram obtidos e visualizados por microscopia de campo brilhante e contraste de fase. A eficiência da preparação de núcleos únicos a partir da suspensão de célula única também foi demonstrada. Após o estudo de sequenciamento de RNA de célula única, vários parâmetros, como distribuição de genes por célula, identificador molecular único por célula, leituras mitocondriais por célula e dados de saturação de sequenciamento foram obtidos.Para o estudo da sequência ATAC de célula única, observou-se a distribuição do tamanho da inserção, incluindo o padrão de bandas de nucleossomos. O escore normalizado de enriquecimento da SST também foi observado. Além disso, o fragmento percentual lê nos picos.Fragmentos de região de pico, escore de enriquecimento da SST, razão de leituras nos locais genômicos da lista negra e razão de sinal de nucleossomo foram determinados. A digestão enzimática é um estresse para as células, portanto, é crucial manter as amostras no gelo e realizar o procedimento o mais rápido possível. Podemos usar este método para obter células endoteliais de camundongos.Também podemos usar essa técnica para realizar estudos baseados em Omix em massa. Esta técnica abriu caminho para estudar o efeito do fluxo sanguíneo perturbado em células endoteliais in vivo de uma única maneira.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Esta descreve uma cirurgia de ligadura parcial da carótida, o que causa as condições de fluxo perturbado e desenvolvimento da aterosclerose subsequente (em duas semanas) com intraplaca neo-vascularização (em quatro semanas) em ratos artéria carótida comum. Descrevemos também um novo método de isolamento de RNA a íntima carótida, proporcionando RNA de alta pureza endoteliais.

Um modelo de Disturbed Aterosclerose Flow-induzido em rato artéria carótida pela ligadura parcial e um método simples de isolamento de RNA a partir do endotélio Carótidas

Nós apresentamos uma preparação para a visualização e manipulação de sinalização do cálcio em nativa, endotélio microvascular intacta. Tubos endoteliais recém isolado das artérias de resistência do mouse fornecendo músculo esquelético manter vivo na morfologia e sinalização dinâmica dentro e entre as células vizinhas. Tubos endoteliais pode ser preparado a partir de microvasos de outros tecidos e órgãos.

Isolamento de tubos endoteliais microvasculares de Artérias Rato Resistência

A capacidade de isolar células endoteliais da válvula cardíaca (VECs) é fundamental para a compreensão dos mecanismos de desenvolvimento, manutenção e doença da válvula.  Aqui descrevemos o isolamento de VECs de camundongos Tie2-GFP embrionários e adultos usando FACS que permitirá estudos determinando a contribuição de VECs em processos de desenvolvimento e doença.

O isolamento de células endoteliais de Murino Válvula

As células endoteliais vasculares desempenham um papel significativo em muitos distúrbios cardiovasculares importantes. Este artigo descreve um método simples para isolar e expandir as células endoteliais da aorta do camundongo sem o uso de nenhum equipamento especial. Nosso protocolo fornece um meio eficaz de identificar mecanismos na fisiopatologia das células endoteliais.

Isolamento e cultura primária de células de camundongo aórtica endoteliais

Este protocolo está preparado para compartilhar nosso método de isolamento de células endoteliais coronárias de camundongos para fins de imagem ou para conduzir experimentos biológicos moleculares.

Isolamento de células de camundongo Coronária endoteliais

Este protocolo descreve um método para o isolamento de células endoteliais da retina pós-natais murinas otimizado para o rendimento, pureza e viabilidade celular. Essas células são adequadas para abordagens de sequenciamento de próxima geração.

Isolamento de células endoteliais da retina murinas para sequenciamento de próxima geração

Neste artigo, células endoteliais primárias do pulmão foram isoladas e cultivadas de camundongos neonatais.

Isolamento de Células Endoteliais Primárias de Pulmão de Camundongo

O protocolo descreve o isolamento, a cultura e o perfil das células endoteliais da artéria mesentérica humana. Além disso, é fornecido um método para preparar a artéria humana para transcrição espacial. Os ensaios proteômicos, transcriptomics e funcionais podem ser realizados em células isoladas. Este protocolo pode ser reaproveitado para qualquer artéria de médio ou grande porte.

Isolamento e Perfil das Células Endoteliais Mesentóricas Primárias Humanas no Nível Transcriptome

Este protocolo detalha um método para a dissecção de depósitos adiposos de camundongos e o isolamento e digestão das respectivas artérias para liberar e, em seguida, identificar a população de células endoteliais. Células recém-isoladas usadas em aplicações a jusante avançarão na compreensão da biologia celular vascular e dos mecanismos de disfunção vascular.

Isolamento e Identificação de Células Endoteliais Vasculares de Depósitos Adiposos Distintos para Aplicações a Jusante

Este artigo descreve um método para isolamento baseado em esferas magnéticas de células endoteliais murinas de capilares linfáticos dérmicos. As células endoteliais linfáticas isoladas podem ser usadas para experimentos in vitro a jusante e análise de expressão de proteínas.

Isolamento de células endoteliais linfáticas dérmicas murinas

Aqui descrevemos um protocolo de digestão celular em duas etapas para o preparo de uma suspensão unicelular de artérias carótidas de camundongos.

Preparação de uma Suspensão Unicelular de Artérias Carótidas de Camundongos para Sequenciamento Unicelular

Aprenda a isolar células endoteliais de artérias carótidas de camundongos para análises multi-ômicas unicelulares. Este método permite estudar respostas ao fluxo sanguíneo perturbado e identificar alvos terapêuticos para aterosclerose.

Isolamento de células endoteliais do lúmen de artérias carótidas de camundongos para experimentos multi-ômicos unicelulares

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