Name: Isolamento de células endoteliais da retina murinas para sequenciamento de próxima geração (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 59 s
Description: Aprenda a isolar células endoteliais da retina murinas com alta viabilidade e pureza para sequenciamento de próxima geração. Este protocolo otimizado revela mecanismos do desenvolvimento vascular.

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Obrigado ao Yale Flow Cytometry Facility, ao University of Virginia Flow Cytometry Core Facility, ao Yale Center for Genomic Analysis e ao University of Virginia Genome Analysis and Technology Core por seu esforço, experiência e aconselhamento em contribuir para os experimentos apresentados. Este estudo foi financiado por subsídios do NIH para N.W.C. (T32 HL007224, T32 HL007284), S.C. (T32 HL007284), K.W. (R01 HL142650) e K.K.H. (R01 HL146056, R01 DK118728, UH3 EB025765).

Os Comitês Institucionais de Cuidado e Uso de Animais da Universidade de Yale e da Universidade da Virgínia aprovaram todos os experimentos em animais listados neste protocolo.
1. Obter olhos de rato para isolamento da retina
<ol><li>Prepare 1x PBS gelado e adicione 500 μL a cada poço de uma placa de 48 poços.</li>
	<li>Eutanasiar camundongos neonatais no sexto dia pós-natal (P6) de acordo com as diretrizes institucionais aprovadas. Para este experimento, ninhadas de aproximadamente 4-8 camundongos neonatais são eutanasiadas em P6 via inalação de isoflurano por pelo menos três minutos após a parada respiratória, seguida de decapitação.</li>
	<li>Remova os olhos de cada um dos ratos. Corte a pele e a membrana sobre o olho, cortando perpendicularmente à pálpebra usando uma tesoura de dissecação. Em seguida, use fórceps para pressionar suavemente acima e abaixo do olho para que o olho se mova para fora da órbita.<ol><li>Aperte cuidadosamente sob o olho com a pinça e corte o nervo óptico que está mantendo o olho ligado. Em seguida, coloque cada olho na placa de 48 poços no PBS 1x gelado preparado até terminar a colheita. NOTA: Use um poço por mouse, com os dois olhos de um único mouse no mesmo poço.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Isole o tecido da retina do rato
<ol><li>Encha uma placa de Petri, forrada com uma almofada de dissecação na parte inferior, com 500 μL de 1x PBS gelado para submergir os olhos e colocá-lo sob um microscópio de dissecação ajustado para ampliação de 4,0x.<ol><li>Suspenda os olhos na almofada de dissecação usando uma pipeta de transferência com uma ponta larga para não danificar os olhos. NOTA: Certifique-se de que os olhos estão completamente cobertos com PBS.</li>
	</ol></li>
	<li>Usando duas pinças de dissecção finas, segure o nervo óptico com uma das pinças para estabilização e, com a segunda pinça, perfure um orifício através da câmara anterior onde a córnea e a esclera se conectam (Figura 1B). Rasgue o buraco em um círculo de cerca de 75% do caminho ao redor da córnea.<ol><li>Enquanto ainda segura o nervo óptico com uma das pinças, use a segunda pinça para rasgar suavemente a esclera do tecido da retina.</li>
		<li>Como acima, use a segunda pinça para arrancar suavemente o corpo vítreo do tecido da retina.</li>
		<li>Novamente, usando a segunda pinça, remova suavemente a lente e os vasos do plexo hialoide que não saíram quando o corpo vítreo foi removido. Para fazer isso, alcance a retina com pinça aberta até quase tocar a retina, feche a pinça para agarrar a lente e os vasos do plexo hialoide e puxe a pinça para fora da retina. Isso pode ser repetido até que todos os vasos sejam removidos. NOTA: O plexo hialoide assemelha-se a uma estrutura clara, semelhante a uma teia.</li>
	</ol></li>
	<li>Encha 2 mL de tubos de microcentrífuga com 500 μL de 1x PBS gelado e coloque as retinas nos tubos. Isole todas as retinas dos olhos e coloque-as em PBS gelado antes de seguir em frente. NOTA: Use um tubo por mouse, com duas retinas do mesmo mouse compartilhando um tubo. Se o tecido da retina estiver rasgado, transfira-o em vários pedaços. O tempo total de dissecção do tecido da retina para uma ninhada de camundongos deve levar de 15 a 60 minutos, começando com a eutanásia e terminando com o isolamento final do tecido da retina.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63133/63133fig01.jpg"> Figura 1: Visão geral do protocolo de isolamento. (A) Esquema da linha do tempo de isolamento com um tempo estimado para cada etapa: Isolamento do Tecido da Retina, Digest, Coloração de Anticorpos, FACS e Janela de Viabilidade Celular. (B) Guia passo-a-passo para isolamento do tecido da retina do olho, com etapas de dissecção numeradas: 1) perfurar a córnea, 2) lágrima da córnea, 3) esclera lacrimal, 4) remover a esclera da retina, 5) remover ainda mais a esclera e o tecido de conexão da retina, 6) remover o corpo vítreo e os vasos vítreos da retina. (C) Imagens representativas do tecido da retina durante várias etapas da digestão: Pré-digestão, Pós-digestão, Pellet (setas pretas destacam o tecido da retina ou pellet celular). Republicado com permissão de Chavkin et al. publicado em S. Karger AG, Basel17. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63133/63133fig01large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
3. Digerir o tecido da retina em uma única suspensão celular
<ol><li>Preparar uma solução de digestão de 500 μL para cada duas retinas isoladas. Adicionar FBS e colagenase tipo II ao DMEM a uma concentração final de 10% de FBS e 1 mg/mL de colagenase tipo II. Misture e aqueça a solução a 37 °C com banho-maria.</li>
	<li>Remova o excesso de PBS dos tubos de microcentrífuga de 2 mL por pipetagem cuidadosa. Deixe PBS suficiente para cobrir completamente o tecido da retina, cerca de 100 μL em cada tubo.</li>
	<li>Adicionar 500 μL da solução de digestão a cada tubo com tecido retiniano (Figura 1C).<ol><li>Use um pipetador P1000 e uma ponta de pipeta para pipetar para cima e para baixo o tecido da retina na solução de digestão cinco vezes.</li>
	</ol></li>
	<li>Incubar a mistura de digestão em banho-maria de 37 °C durante 20 min.<ol><li>Use um pipetador P1000 e uma ponta de pipeta para pipetar a mistura de digestão para cima e para baixo a cada 5 minutos. Após a incubação, o tecido da retina se dissolveu em uma única suspensão celular, de modo que a mistura de digestão deve estar turva (Figura 1C).</li>
	</ol></li>
</ol>4. Conte células
<ol><li>Coloque uma centrífuga de mesa a 4 °C e coloque os tubos de mistura de digestão no interior. Pellet a mistura de digestão por centrifugação a 375 x g durante 5 min.</li>
	<li>Remova cuidadosamente a solução de digestão sobrenadante por pipetagem. Não perturbe o pellet celular (Figura 1C). Ressuspeite o pellet em 500 μL de PBS 1x gelado misturando suavemente para cima e para baixo com a pipeta.</li>
	<li>Conte as células com um hemocitômetro sob um microscópio. NOTA: A contagem de células é de aproximadamente 1 x 106 células por duas retinas.</li>
	<li>Certifique-se de que as células sejam ressuspensas adequadamente por mistura suave e, em seguida, alíquota de 20 μL de suspensão celular em três tubos para coloração de controle (tubo 1: controle IgG, tubo 2: controle CD31 e tubo 3: controle CD45), conforme descrito e usado anteriormente17,18.</li>
	<li>Coloque uma centrífuga de mesa a 4 °C e coloque tubos contendo células no interior. Pellet as células por centrifugação a 375 x g durante 5 min.</li>
</ol>5. Imunomanchar as células com anticorpos
<ol><li>Prepare 100 μL de tampão de coloração por duas retinas coradas mais quatro tubos de controle. Adicione FBS, HEPES e D-Glucose ao tampão HBSS a uma concentração final de 10% FBS, 10 mM HEPES e 1 mg/mL de D-Glicose.</li>
	<li>Obter anticorpos conjugados fluorescentemente contra CD31 e CD45. Adicione os anticorpos a uma diluição de 1:100 no tampão de coloração (tubo 1: apenas anticorpo IgG, tubo 2: apenas anticorpo CD31 e tubo 3: apenas anticorpo CD45). Adicionar 1 μL de anticorpo por 100 μL do tampão corante para uma concentração final de anticorpos de 2 μg/mL.</li>
	<li>Remova cuidadosamente o PBS do pellet da célula lavada por pipeta.</li>
	<li>Ressuscite o pellet em 100 μL de solução de coloração de anticorpos por 0,5 x 106 células.<ol><li>Incubar a suspensão unicelular com a solução de coloração de anticorpos por 30 minutos no gelo no escuro. Bata nos tubos a cada 10 minutos para misturar suavemente as células.</li>
	</ol></li>
</ol>6. Prepare-se para a classificação de células ativadas por fluorescência
<ol><li>Coloque uma centrífuga de mesa a 4 °C e coloque os tubos contendo células no interior. Células de pellets por centrifugação a 375 x g durante 5 min.<ol><li>Remova o sobrenadante e ressuspenda essas células em 500 μL de 1x PBS para lavar.</li>
	</ol></li>
	<li>Coloque uma centrífuga de mesa a 4 °C e coloque os tubos contendo células no interior. Células de pellets por centrifugação a 375 x g durante 5 min</li>
	<li>Prepare 1,5 mL de tampão FACS (1% FBS em 1x PBS).<ol><li>Remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular em 300 μL de tampão FACS misturando suavemente com um pipettor.</li>
	</ol></li>
	<li>Adicionar iodeto de propídio (PI) aos tubos de amostra que contêm o tampão FACS até uma concentração final de 0,5 μg/mL. O IP é usado como um marcador de viabilidade.</li>
	<li>Transfira e combine as suspensões celulares em tubos de ensaio de 5 mL através de uma tampa de encaixe de filtro celular. A tampa de encaixe do filtro celular deve conter um filtro de 35 μm, e as suspensões celulares podem ser pipetadas diretamente no filtro.<ol><li>Mantenha os tubos FACS no gelo no escuro e transfira-os para o classificador de células.</li>
	</ol></li>
</ol>7. Configurar o instrumento FACS
<ol><li>Instale um bocal de 100 μm em um instrumento FACS. NOTA: Este bocal de tamanho minimiza o volume de coleta e maximiza a densidade de células isoladas.</li>
	<li>Prepare 250 μL de 1x PBS em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL como um tubo de coleta a ser instalado no instrumento FACS.</li>
</ol>8. Isolar células endoteliais viáveis via FACS
<ol><li>Ligue o instrumento FACS e o computador. Clique no ícone do software FACS para abrir o software FACS no computador para executar e operar o instrumento FACS. Realizar testes de controle de qualidade de rotina.</li>
	<li>Carregue as amostras coradas pelo controle no instrumento FACS para ajustar os eixos. Comece com células apenas de anticorpos IgG para gerar e ajustar FSC e SSC, depois com anticorpos CD31 apenas para gerar e ajustar CD31 e, em seguida, com anticorpos CD45 apenas para gerar e ajustar CD45. Registre dados de amostras de controle.</li>
	<li>Carregar células de amostra coradas no instrumento FACS e executar a amostra.</li>
	<li>Porta das células com base nos parâmetros de dispersão frontal e dispersão lateral (FSC-A e SSC-A, respectivamente) (Figura 2A). NOTA: Os parâmetros FSC-A e SSC-A são usados para selecionar células com base no tamanho, densidade, granularidade, propriedades da superfície e índice de refração.</li>
	<li>Células gate por FSC-A e FSC-H para identificar duplicatas celulares e coletar apenas células simples (Figura 2A). NOTA: Os parâmetros FSC-A e FSC-H são usados para selecionar células individuais com base no princípio de que, durante o espalhamento para a frente, os duplicados de células serão gotículas contendo uma maior relação área-altura.</li>
	<li>Células gate por PI e SSC-A para identificar células viáveis (Figura 2A). NOTA: As células viáveis serão PI-negativas.</li>
	<li>Faça uma porta CD31+/CD45- com controles e células de porta por CD31 e CD45 (Figura 2A,B).<ol><li>Insira um tubo de coleta com 250 μL de tampão FACS.</li>
		<li>Comece a classificar as células que são CD31-positivo/CD45-negativo no tubo de coleta instalado.</li>
		<li>Mantenha os tubos de coleta no gelo para uma análise mais aprofundada. As amostras podem ser processadas para aplicativos de sequenciamento de próxima geração nesta etapa1.</li>
	</ol></li>
</ol>9. Realizar ensaio de viabilidade
<ol><li>Misture 10 μL de células com 10 μL de solução azul de tripano a 0,4% para avaliar a viabilidade celular.</li>
	<li>Conte as células viáveis pipetando a mistura corada em uma lâmina de hemocitômetro. Coloque a lâmina sob um microscópio para contagens precisas de viabilidade. Conte as células azuis como inviáveis e conte as células claras como viáveis.<ol><li>Divida a contagem de células viáveis pela contagem total de células para calcular a viabilidade percentual.</li>
	</ol></li>
</ol>10. Realizar ensaio de expressão gênica
<ol><li>Obter 10.000-20.000 células por amostra e realizar isolamento de RNA para analisar a expressão gênica das células endoteliais da retina murina. O isolamento de RNA é realizado usando um kit comercialmente disponível que usa precipitação de RNA à base de etanol e, em seguida, centrífuga e colunas de membrana para lavar e eluir o RNA purificado do lisado celular. As amostras podem ser processadas para alguns aplicativos de sequenciamento de próxima geração nesta etapa1.</li>
	<li>Converter o RNA em cDNA utilizando a enzima transcriptase reversa e reagentes de suporte19.</li>
	<li>Quantificar usando um corante de ligação ao DNA e uma máquina quantitativa de PCR (qPCR)20. Carregue amostras de cDNA em uma placa qPCR de 384 poços com primers para amplificar genes de interesse. O volume de reação deve totalizar 10 μL, incluindo o corante de ligação ao DNA, que será usado para quantificar a amplificação gênica.<ol><li>Use CD31, VE-Caderrin, CD45 e β-actina para frente e para trás para medir a expressão gênica.</li>
	</ol></li>
	<li>Use o exemplo para aplicativos de sequenciamento de próxima geração1.</li>
</ol>

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</ol>

Os autores não têm divulgações relevantes.

Este protocolo descreve um método para o isolamento de células endoteliais do tecido retiniano murino pós-natal que foi otimizado para alto número de células, pureza e viabilidade. A pureza celular é obtida pelo isolamento FACS de populações de células endoteliais da suspensão unicelular digerida por imunocoloração CD31+/CD45-. A qualidade do isolamento é quantificada em ensaios de viabilidade pela coloração azul de tripano e expressão gênica por qPCR para CD31, CD45 e VE-Caderina (embora a VE-Caderrina não tenha sido us...

A capacidade de alto rendimento do sequenciamento de ácidos nucleicos por meio de abordagens de sequenciamento de próxima geração avançou muito o conhecimento dos pesquisadores sobre biologia molecular e celular. Essas técnicas avançadas incluem sequenciamento de RNA de transcriptoma inteiro, sequenciamento de DNA de regiões-alvo para identificar polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs), sequenciamento de DNA de fatores de transcrição ligados no sequenciamento de imunoprecipitação de cromatina (ChIP) ou regiões de cromatina abertas em ensaio para sequenciamento de cromatina acessível à transposase (ATAC) e sequenciamento de RNA de célula única1 . Na biologia vascular, esses avanços permitiram aos pesquisadores elucidar mecanismos complicados de desenvolvimento e doença, além de distinguir padrões de expressão gênica ao longo de um continuum de fenótipos variados 2,3. Experimentos futuros podem definir ainda mais mecanismos complexos, combinando o sequenciamento de próxima geração com modelos avaliados de desenvolvimento vascular, mas os métodos de preparação de amostras precisam ser compatíveis com as técnicas avançadas de sequenciamento.
A qualidade, precisão e reprodutibilidade das abordagens de sequenciamento de próxima geração dependem do método de preparação da amostra. Ao isolar um subconjunto de células ou gerar suspensões unicelulares a partir de tecidos, métodos ideais de digestão e purificação são essenciais para maximizar o número celular, a viabilidade e a pureza da população celular 4,5. Isso requer um equilíbrio no método de digestão: uma digestão forte é necessária para liberar células do tecido e obter células suficientes para abordagens a jusante, mas a viabilidade celular será afetada negativamente se a digestão for muito forte 6,7. Além disso, a pureza da população celular é necessária para resultados robustos e análise precisa dos dados, o que pode ser realizado através do FACS. Isso destaca a importância de otimizar os métodos de isolamento celular para aplicar o sequenciamento de próxima geração a modelos estabelecidos de desenvolvimento vascular.
Um modelo bem caracterizado para investigar o desenvolvimento vascular é o modelo de desenvolvimento vascular da retina murina. A vasculatura retiniana murina desenvolve-se no pós-natal em um plexo superficial bidimensional, com brotação angiogênica inicial do nervo óptico visível no dia pós-natal (P)3, frente angiogênica com células do caule e da ponta e maturação inicial dos vasos visível em P6, e maturação do plexo vascular visível após P9 8,9. Durante o remodelamento do plexo vascular inicial, as células endoteliais passam por especificação para fenótipos arteriais, capilares e venosos em diferentes vasos para gerar uma rede circulatória10,11. Portanto, esse método permite aos pesquisadores visualizar a formação do plexo vascular angiogênico e a especificação e maturação arterial-venosa endotelial em vários momentos durante o desenvolvimento9. Além disso, esse modelo fornece um método para investigar os efeitos da manipulação transgênica sobre a angiogênese e o desenvolvimento do plexo vascular, que tem sido aplicado para a investigação do desenvolvimento vascular, malformações arteriais-venosas e neovascularização induzida por oxigênio 12,13,14,15,16 . A fim de combinar abordagens de sequenciamento de próxima geração com o modelo de desenvolvimento vascular da retina murina, é necessário um protocolo otimizado para o isolamento de células endoteliais do tecido da retina.
Este protocolo descreve um método otimizado para digerir o tecido da retina de camundongos em P6 para maximizar o rendimento celular, a pureza e a viabilidade. O tecido da retina é isolado de camundongos P6, digerido por 20 min, imunocorado para CD31 e CD45 e purificado através de FACS para isolar uma única suspensão celular de células endoteliais em cerca de 2,5 h (Figura 1A). Verificou-se que essas células endoteliais mantêm alta viabilidade por 60 minutos após o isolamento17, permitindo preparações de biblioteca para métodos de sequenciamento de próxima geração. Além disso, resultados representativos são fornecidos para o controle de qualidade e os resultados do controle de qualidade do FACS de dois métodos separados de sequenciamento de próxima geração usando esse protocolo de isolamento: sequenciamento de RNA de transcriptoma inteiro e sequenciamento de RNA de célula única. Este método permite que abordagens de sequenciamento de próxima geração sejam usadas em conjunto com o modelo de vascularização da retina para elucidar novos mecanismos de desenvolvimento vascular.

<table><tbody><tr><td>2 mL Eppendorf&nbsp; tubos de trava segura</td><td>USA Scientific</td><td>4036-3352</td><td></td></tr><tr><td>5 ml Tubos de ensaio Falcon com filtro de células Tampa de pressão</td><td>Corning</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>60 mm Prato de cultura não tratado com TC</td><td>Corning</td><td>430589</td><td></td></tr><tr><td>APC Rato Anti-Rato CD31</td><td>BD Biosciences</td><td>551262</td><td></td></tr><tr><td>Rato APC IgG2a &kappa; Controle de isotipo</td><td>BD Biosciences</td><td>553932</td><td></td></tr>BD <tr><td>FACSChorus Software</td><td>BD Biosciences</td><td>FACSCHORUS</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSMelody Cell Sorter</td><td>BD Biosciences</td><td>FACSMELODY</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase Tipo II</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>234115</td><td></td></tr><tr><td>Costar Placas de poços múltiplos tratadas com TC transparente de 48 poços, embaladas individualmente, Corning estéril</td><td></td><td>3548</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Gibco</td><td>A2494001</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas de Transferência Graduada Descartáveis</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-711-9AM</td><td></td></tr><tr><td>Panela de Dissecção Cera</td><td>Carolina</td><td>629100</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura de Dissecção</td><td>Fine Science Tools</td><td>14085-08</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio Estéreo de Dissecção M165 FC</td><td>Leica</td><td>M165FC</td><td></td></tr><tr><td>Meio de Águia Modificado de Dulbecco (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>11965-052</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Phosphate Buffered Saline (PBS)</td><td>Gibco</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf&nbsp; Tubos de Microcentrífuga Flex-Tubes 1,5 mL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>22364120</td><td></td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino (FBS)</td><td>Gemini Bio</td><td>100-106</td><td></td></tr><tr><td>Pinça de dissecção fina</td><td>Ferramentas de Ciência Fina</td><td>11250-00</td><td></td></tr><tr><td>Solução de Sal Tamponada de Hank (HBSS)</td><td>Gibco</td><td>14175095</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1M)</td><td>Gibco</td><td>15630130</td><td></td></tr><tr><td>iScript cDNA Kit</td><td>de Síntese Bio-Rad</td><td>1708890</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano, USP</td><td>Covetrus</td><td>11695067772</td><td></td></tr><tr><td>Isotemp Uso Geral Deluxe Banho-maria</td><td>Fisher Scientific</td><td>FSGPD20</td><td></td></tr><tr><td>Primer: ActB_Forward: 5'- agagggaaatcgtgcgtgac -3'</td><td>Primer Integrado de Tecnologias de DNA</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>: ActB_Reverse: 5'- caatagtgatgacctggccgt -3'</td><td>Tecnologias Integradas de DNA</td><td>N / A</td><td></td></tr><tr><td>Primer: CD31_Forward: 5'- gagcccaatcacgtttcagttt -3'</td><td>Primer Integrado DNA</td> Technologies <td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>: CD31_Reverse: 5'- tccttcctgcttcttgctagct -3'</td><td>Primer Integrado de Tecnologias de DNA</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>: CD45_Forward: 5'- gggttgttctgtgccttgtt -3'</td><td>Primer integrado de DNA Technologies</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>: CD45_Reverse: 5'- ctggacggacacagttagca -3'</td><td>Primer Integrado de Tecnologias de DNA</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>: VE-Cadherin_Forward: 5'- tcctctgcatcctcactatcaca -3'</td><td>Primer integrado de DNA Technologies</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>: VE-Cadherin_Reverse: 5'- gtaagtgaccaactgctcgtgaat -3'</td><td>Tecnologias Integradas de DNA</td><td>N / A</td><td></td></tr><tr><td>Iodeto de Propídio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4864</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Plus Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74134</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall Legend Micro 21R Centrífuga, Refrigerada</td><td>ThermoFisher</td><td>75002477</td><td></td></tr><tr><td>SYBR-Green iTaq Universal SYBR Green Supermix</td><td>Bio-Rad</td><td>172-5120</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Solution</td><td>ThermoFisher</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>V450 Rato Anti-Rato CD45</td><td>BD Biosciences</td><td>560501</td><td></td></tr><tr><td>V450 Rato IgG2b, &kappa; Controle de Isotipo</td><td>BD Biosciences</td><td>560457</td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento de células endoteliais da retina murinas para sequenciamento de próxima geração

Isolation of Murine Retinal Endothelial Cells for Next-Generation Sequencing

Melhorias recentes no sequenciamento de próxima geração avançaram o conhecimento dos pesquisadores sobre biologia molecular e celular, com vários estudos revelando novos paradigmas em biologia vascular. A aplicação desses métodos a modelos de desenvolvimento vascular requer a otimização de técnicas de isolamento celular de tecidos embrionários e pós-natais. O rendimento, a viabilidade e a pureza das células precisam ser máximos para obter resultados precisos e reprodutíveis das abordagens de sequenciamento de próxima geração. O modelo de vascularização da retina de camundongos neonatais é usado por pesquisadores para estudar mecanismos de desenvolvimento vascular. Os pesquisadores usaram esse modelo para investigar mecanismos de angiogênese e especificação do destino arterial-venoso durante a formação e maturação dos vasos sanguíneos. A aplicação de técnicas de sequenciamento de próxima geração para estudar o modelo de desenvolvimento vascular da retina requer a otimização de um método para o isolamento de células endoteliais da retina que maximize o rendimento, a viabilidade e a pureza celular. Este protocolo descreve um método para isolamento, digestão e purificação do tecido retiniano murino usando a classificação celular ativada por fluorescência (FACS). Os resultados indicam que a população de células endoteliais CD31+/CD45- purificadas por CACS é altamente enriquecida para a expressão gênica de células endoteliais e não apresenta alteração na viabilidade por 60 min pós-CASC. Estão incluídos resultados representativos de abordagens de sequenciamento de próxima geração em células endoteliais isoladas usando este método, incluindo sequenciamento de RNA em massa e sequenciamento de RNA de célula única, demonstrando que este método para isolamento de células endoteliais da retina é compatível com aplicações de sequenciamento de próxima geração. Este método de isolamento das células endoteliais da retina permitirá técnicas avançadas de sequenciamento para revelar novos mecanismos de desenvolvimento vascular.

A digestão do tecido retiniano e a imunocoloração para CD31 e CD45 resultam em uma população identificável de células endoteliais CD31+/CD45- após o gating para células, células únicas e viabilidade (Figura 2A). A imunocoloração CD45 é necessária para eliminar as células CD31+/CD45+, que incluem plaquetas e alguns leucócitos21. Controles devem ser realizados para cada experimento para mostrar a especificidade dos anticorpos e orientar a estratégia de bloqueio (<strong...

Este protocolo descreve um método para o isolamento de células endoteliais da retina pós-natais murinas otimizado para o rendimento, pureza e viabilidade celular. Essas células são adequadas para abordagens de sequenciamento de próxima geração.

Isolamento de células endoteliais da retina murinas para sequenciamento de próxima geração

Recent improvements in next-generation sequencing have advanced researchers&#39; knowledge of molecular and cellular biology, with several studies ...

Este método de isolamento das células endoteliais da retina permitirá técnicas avançadas de sequenciamento para revelar novos mecanismos de desenvolvimento vascular. O protocolo descrito é otimizado para altos graus de viabilidade e pureza, que são essenciais para aplicações de sequenciamento de próxima geração. Demonstrando o procedimento estará Shelby Cain, uma estudante de pós-graduação do Laboratório Hershey.Comece a remover os olhos do rato neonatal eutanasiado cortando a pele e a membrana sobre o olho com uma incisão perpendicular à pálpebra usando uma tesoura de dissecação. Em seguida, use a pinça para pressionar acima e abaixo do olho para que o olho se mova para fora da órbita. Aperte cuidadosamente sob o olho com a pinça e corte o nervo óptico que mantém o olho ligado.Em seguida, coloque os dois olhos do rato em um poço da placa de 48 poços no PBS gelado recém-preparado até terminar a colheita. Para isolar o tecido da retina do rato, suspenda os olhos na almofada de dissecação numa placa de Petri preenchida com 500 microlitros de PBS gelado utilizando uma almofada de tubo de transferência com uma ponta larga. Trabalhando sob o microscópio de dissecção, segure o nervo óptico com uma pinça fina e use a segunda pinça para perfurar o orifício através da câmara anterior do olho, onde a córnea e a esclera se conectam.Em seguida, rasgue o buraco em um círculo de cerca de 75% do caminho ao redor da córnea. Ao segurar o nervo óptico com uma pinça, use a segunda pinça para rasgar suavemente a esclera e o corpo vítreo do tecido da retina. Para remover a lente e os vasos do plexo hialoide, alcance a retina com pinça aberta até quase tocá-la e, em seguida, feche a pinça para agarrar e puxar a lente e os vasos do plexo hialoide para fora da retina.Quando todos os vasos forem removidos, coloque as retinas nos tubos microcentrífugos de dois mililitros preenchidos com 500 microlitros de um PBS gelado x gelado. Remova o excesso de PBS do tubo microcentrífugo de dois mililitros com uma pipeta deixando cerca de 100 microlitros de PBS no tubo para cobrir completamente o tecido da retina. Em seguida, adicione 500 microlitros da solução de digestão recém-preparada ao tubo.Use uma pipeta P1000 e uma ponta de pipeta para pipetar para cima e para baixo o tecido da retina na solução de digestão cinco vezes. Quando terminar, incube a mistura de digestão em banho-maria de 37 graus Celsius por 20 minutos com pipetagem da mistura de digestão para cima e para baixo a cada cinco minutos, conforme explicado anteriormente. Após a incubação, o tecido da retina se dissolverá em uma única suspensão celular, tornando a mistura de digestão turva.Em seguida, pellet as células por centrifugação a 375g por cinco minutos a quatro graus Celsius. Após a centrifugação, remova o PBS do pellet de células lavadas por pipetagem e, em seguida, imunomarize as células ressuspendendo o pellet em 100 microlitros de solução de coloração de anticorpos por 0,5 vezes 10 até as sextas células. Incubar a suspensão de célula única com a solução de coloração de anticorpos durante 30 minutos sobre gelo no escuro com batidas no tubo a cada 10 minutos para misturar suavemente as células.Para a classificação de células ativadas por fluorescência, pellet as células por centrifugação a 375g por cinco minutos a quatro graus Celsius. Depois de remover o sobrenadante, lave e coloque as células em 500 microlitros de PBS, conforme descrito anteriormente. E, em seguida, ressuspenda as células em 300 microlitros de classificação celular ativada por fluorescência ou tampão FACS misturando suavemente com a pipetta.Em seguida, adicione iodeto de propídio ou PI como um marcador de viabilidade aos tubos de amostra contendo o tampão FACS para obter uma concentração final de 0,5 microgramas por mililitro. Use uma pipeta para transferir as suspensões celulares através de uma tampa de encaixe de filtro de células contendo um filtro de 35 mícrons em um tubo de ensaio de cinco mililitros. Após a filtração, mantenha o tubo FACS no gelo no escuro e, em seguida, transfira o tubo para o classificador de células.Ligue o instrumento FACS e o computador e abra o software FACS para executar e operar o instrumento FACS. Realizar testes de controle de qualidade de rotina. Carregue as amostras de mancha de controle no instrumento FACS para ajustar os eixos.Comece com células apenas de anticorpos IgG para gerar e ajustar a dispersão para a frente e a dispersão lateral. Em seguida, o anticorpo CD31 apenas para gerar e ajustar o CD31. E, em seguida, o anticorpo CD45 apenas para gerar e ajustar o CD45.Registre os dados das amostras de controle. Em seguida, carregue as células de amostra coradas no instrumento FACS e execute a amostra. Marchar as células com base em parâmetros de dispersão para frente ou FSC e dispersão lateral ou SSC.Células de marcha por FSCA e FSCH para identificar duplicatas celulares e coletar apenas células únicas. Células de marcha por PI e SSCA para identificar células viáveis. Faça uma marcha CD31+CD45 com controles Faça uma marcha CD31+CD45 com controles e marche as células por CD31 e CD45.Insira um tubo de coleta com 250 microlitros de tampão FACS no instrumento. Em seguida, comece a classificar as células que são CD31 + CD45 no tubo de coleta instalado. Mantenha os tubos de coleta no gelo para uma análise mais aprofundada.As amostras podem ser processadas para aplicativos de sequenciamento de próxima geração. No estudo, a variação do tempo de digestão afetou o rendimento celular e a porcentagem de viabilidade. O tempo de digestão de 20 minutos resultou em um rendimento ótimo com uma baixa porcentagem de células endoteliais não viáveis.A coloração subsequente com iodeto de propídio demonstrou que as células endoteliais isoladas permaneceram viáveis por 60 minutos após o isolamento. A pureza da população celular foi avaliada por análise quantitativa de PCR ou qPCRR da expressão de genes de células endoteliais mostrando forte enriquecimento para genes de células endoteliais na população CD31+CD45. Purificação do RNA das células endoteliais isoladas convertendo e amplificando o cDNA através da preparação e sequenciamento da biblioteca A biblioteca de cDNA resultou em mais de 16.000 genes identificados em nove amostras independentes.Uma queda nos transcritos por milhão de leituras ou TPM foi observada em genes abaixo desse limiar. O sequenciamento de RNA de célula única das células endoteliais isoladas da retina através do pipeline 10x Genomics resultou em uma mediana de 1.171 genes por célula, 15.247 genes totais detectados e uma mediana de 2.255 identificadores moleculares únicos ou contagens UMI por célula em 917 células. As etapas críticas neste protocolo são o isolamento tecidual da retina e a digestão tecidual, que devem ser realizados com precisão, conforme descrito, para otimizar o rendimento e a viabilidade celular.As células endoteliais isoladas podem ser usadas em técnicas avançadas de sequenciamento, como sequenciamento de RNA de transcriptoma inteiro, sequenciamento de RNA de célula única, sequenciamento de imunoprecipitação de cromatina e ensaio para sequenciamento de cromatina acessível à transposase. O uso desse método otimizado em combinação com métodos de sequenciamento de próxima geração e por abordagens computacionais pode elucidar ainda mais os mecanismos de vias de sinalização interconectadas que regulam os desenvolvimentos vasculares.

isolation-murine-retinal-endothelial-cells-for-next-generation

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Neste vídeo, vamos demonstrar como isolar células-tronco na retina do epitélio ciliar do olho do rato e cultivá-las em cultura para dar forma clonal esferas da retina. As esferas que estão isolados possuem as propriedades cardeal de células-tronco: a auto-renovação e multipotencialidade.

Isolamento de Células-Tronco da retina do olho do rato

Este vídeo demonstra o procedimento para isolar células ganglionares primárias da retina (RGCs) murinas usando citometria de fluxo. Este método permite o estudo futuro dos RGCs, com o objetivo de entender melhor o grande declínio na acuidade visual que resulta da perda de RGCs funcionais em doenças neurodegenerativas.

Isolando células ganglionares da retina murina usando classificação de células ativadas por fluorescência

A capacidade de isolar células endoteliais da válvula cardíaca (VECs) é fundamental para a compreensão dos mecanismos de desenvolvimento, manutenção e doença da válvula.  Aqui descrevemos o isolamento de VECs de camundongos Tie2-GFP embrionários e adultos usando FACS que permitirá estudos determinando a contribuição de VECs em processos de desenvolvimento e doença.

O isolamento de células endoteliais de Murino Válvula

células-tronco e progenitoras hematopoiéticas (HSPC) derivam de células endoteliais especializadas (hegemônicos) durante o desenvolvimento, mas pouco se sabe sobre o processo pelo qual algumas células endoteliais especificar a tornar-se sangue formando. Nós demonstramos um método baseado citometria de fluxo que permite o isolamento de células endoteliais em simultâneo hegemônicos e HSPC de tecidos embrionários de murídeo.

Isolamento de células embrionárias de murino hegemônicos endoteliais

Aqui, apresentamos uma abordagem combinatória para classificar tipos de células neuronais antes do isolamento e para a caracterização subsequente de transcriptomas de célula única. Este protocolo otimiza a preparação de amostras para o bem sucedido RNA Sequencing (RNA-Seq) e descreve uma metodologia projetada especificamente para a compreensão melhorada da diversidade celular.

Single-cell RNA-Seq de subgrupos definidos de células de gânglio retiniano

Milhões de pessoas sofrem de doenças degenerativas da retina que resultam em cegueira irreversível. Um elemento comum de muitas dessas doenças é a perda de células ganglionares da retina (RGCs). Este protocolo detalhado descreve o isolamento de RGC murinos primários por seleção positiva e negativa com citometria de fluxo.

Isolamento de células de gânglio retiniano murino primário (RGCs) por citometria de fluxo

Apresentamos um método para isolar células e núcleos endoteliais do lúmen de artérias carótidas de camundongos expostas a condições de fluxo estáveis ou perturbadas para a realização de experimentos ômicos unicelulares.

Isolamento de células endoteliais do lúmen de artérias carótidas de camundongos para experimentos multi-ômicos unicelulares

Este manuscrito descreve um protocolo simplificado para o isolamento de células de epitélio pigmentado da retina (RPE) a partir de olhos de rato de forma stepwise. O protocolo inclui a enucleação e dissecação dos olhos do rato, seguido pelo isolamento, semeadura e cultivo de células RPE.

Isolamento das células epitélio pigmentadas do rato primário

Este artigo descreve um método para isolamento baseado em esferas magnéticas de células endoteliais murinas de capilares linfáticos dérmicos. As células endoteliais linfáticas isoladas podem ser usadas para experimentos in vitro a jusante e análise de expressão de proteínas.

Isolamento de células endoteliais linfáticas dérmicas murinas

O epitélio pigmentar da retina (EPR) atua como uma barreira crucial entre a coróide e a retina, promovendo a saúde e a função dos tipos de células da retina, como os fotorreceptores. Aqui, descrevemos um protocolo simples e eficaz para isolar e cultivar EPR murino adulto.

Um método simplificado para isolamento e cultura de células epiteliais pigmentares da retina de camundongos adultos

A retina exibe uma organização espacial complexa em toda a sua estrutura laminar. As técnicas modernas de transcriptômica espacial e sequenciamento requerem seções de tecido &lt; 20 μm de espessura, limitando sua aplicabilidade na pesquisa da retina. Este método de crioseccionamento recém-congelado produz seções finas na face da retina do camundongo, preservando as relações espaciais planares, permitindo um mapeamento molecular abrangente entre as lâminas.

En face Crioseccionamento de retina de camundongo para análise molecular espacial de alta dimensão

Aprenda a isolar células endoteliais da retina murinas com alta viabilidade e pureza para sequenciamento de próxima geração. Este protocolo otimizado revela mecanismos do desenvolvimento vascular.

Isolamento de células endoteliais da retina murinas para sequenciamento de próxima geração

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