Name: Medindo a dinâmica de saliência da borda celular durante a disseminação usando microscopia de células vivas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 50 s
Description: Aprenda a medir a dinâmica de saliência da borda celular durante a disseminação usando microscopia de células vivas. Este método simples e econômico avalia protrusões, retrações e ondulações sem necessidade de marcação fluorescente.

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Este trabalho foi apoiado pelas bolsas NIH MH115939, NS112121, NS105640 e R56MH122449-01A1 (a Anthony J. Koleske) e pela Fundação Israel Science (bolsas nº 1462/17 e 2142/21) (para Hava Gil-Henn).

Todos os métodos descritos neste protocolo foram aprovados pelo Comitê institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade bar-ilan.
NOTA: Uma representação gráfica passo a passo do procedimento descrito nesta seção aparece na Figura 1.
1. Cultura celular
NOTA: As células utilizadas no protocolo são fibroblastos embrionários de camundongos (MEFs) que foram gerados a partir de embriões E11.5-13.5 de camundongos tipo selvagem C57BL/6. Os MEFs primários foram gerados de acordo com o protocolo do laboratório Jacks13. Células de cinco embriões diferentes foram agrupadas e imortalizadas por infecção com um vetor retroviral expressando antígeno T grande SV40 seguido de seleção com Histidinol de 4 mM por 3 semanas.
<ol><li>Células de cultura em placas de cultura tecidual contendo o Meio Águia Modificada (DMEM) de Dulbecco contendo 1 g/L de glicose, 1% glutamina, 1% penicilina-estreptomicina e 10% de soro bovino fetal (FBS) (ver Tabela de Materiais), em uma incubadora umidificada com 5% de CO2 a 37 °C.</li>
	<li>Cultume as células até 90%-95% de confluência e divida a uma proporção de 1:5 a cada 2-3 dias.</li>
</ol>2. Revestimento de prato de fundo de vidro
NOTA: O revestimento do prato de fundo de vidro deve ser realizado na capa da cultura tecidual em condições estéreis.
<ol><li>Adicione 2 mL de solução de 1N HCl no centro de um prato de fundo de vidro (Tabela de Materiais) e incubar por 20 min a temperatura ambiente (RT). NOTA: Este estágio destina-se a remover resíduos do vidro que podem interromper a imagem mais tarde.</li>
	<li>Lave o prato de fundo de vidro três vezes com 2 mL de 1x PBS (Tabela de Materiais) cada.</li>
	<li>Fibronectina diluída (ver Tabela de Materiais) a 10 μg/mL em 1x PBS. Adicione 200 μL da solução de fibronectina diluída ao centro de vidro do prato. Incubar a 37 °C (incubadora de cultura tecidual) por 1h. NOTA: Alternativamente, o prato de fundo de vidro pode ser incubado durante a noite a 4 °C em uma superfície plana.</li>
	<li>Durante o tempo de incubação do revestimento da fibronectina, prepare 1% de solução BSA (Tabela de Materiais) em 1x PBS, filtre até 0,2 μm e desnaturar incubando a 70 °C por 30 min em um banho de água pré-aquecido.</li>
	<li>Lave o prato revestido de fundo de vidro três vezes com 2 mL de 1x PBS cada.</li>
	<li>Adicione 2 mL de solução BSA desnaturada ao centro de vidro e incubar por 1h a 37 °C (incubadora de cultura tecidual). NOTA: Alternativamente, o prato de fundo de vidro pode ser incubado durante a noite a 4 °C em uma superfície plana.</li>
	<li>Lave o prato de fundo de vidro 3 vezes com 2 mL de 1x PBS cada. NOTA: A incubação de pratos de fundo de vidro com fibronectina deve ser realizada por pelo menos 1h a 37 °C para revestir a superfície corretamente. O menor tempo de incubação pode não produzir revestimento adequado e, como resultado, o fenótipo celular pode não estar relacionado à ativação do integrino. A camada BSA é inerte e não afetará a dinâmica de saliência e destina-se a bloquear locais potenciais livres para adesão celular independente da integrin. O BSA deve ser desnaturado antes do revestimento para evitar que induza a apoptose celular, que pode influenciar a dinâmica da borda celular.</li>
</ol>3. Preparação de células para imagem
<ol><li>Dezesseis a dezoito horas antes do experimento, as células atingem 70%-80% de confluência no dia seguinte. Para MEFs, placa 0,7 x 106 células por placa de cultura tecidual de 10 cm de diâmetro um dia antes de realizar o experimento. NOTA: Para um experimento de saliência bem-sucedido, é importante que as células sejam usadas durante sua fase de crescimento logarítmico. Para isso, as células devem atingir 70%-80% de confluência no dia do experimento. Uma maior densidade de células resultará em um tempo de propagação mais longo e/ou impedimento no apego durante o experimento.</li>
	<li>No dia do experimento, adicione 2 mL de solução de trippsina (Tabela de Materiais) por placa de cultura tecidual de 10 cm de diâmetro e incubar por 2-3 min em uma incubadora de cultura tecidual até que as células se desprendem. Inativar trippsina adicionando 5 mL do meio completo.</li>
	<li>Conte as células usando um hemótmetro e uma placa de 20.000 células em 2 mL do meio completo em um prato de fundo de vidro revestido como acima (seção 2). NOTA: O número de células para chapeamento depende do tamanho e tipo de células. Para células maiores ou mais espalhadas, a placa de apenas 10.000 células tem células suficientes para a imagem. É importante escolher células únicas que não tocam como contato célula-celular pode alterar comportamentos de disseminação celular-intrínseco.</li>
	<li>Incubar os pratos de fundo de vidro com células banhadas na incubadora de cultura tecidual por 15 minutos. NOTA: Durante esta fase, as células aderem ao substrato de fibronectina e se espalham sobre ele. Ao medir saliências durante a disseminação celular, as células devem ser permitidas a se espalhar por 15 minutos após o revestimento e antes da imagem. A imagem pode ser realizada dentro de uma janela de tempo entre 15 min e ~1 h após o revestimento, e em qualquer caso, antes que as células comecem a migrar.</li>
</ol>4. Configuração e imagem do microscópio
NOTA: Vários sistemas de microscopia de células vivas estão disponíveis. O sistema utilizado aqui é um microscópio invertido Leica AF6000 equipado com CO2 e unidades de aquecimento e está conectado a uma câmera CMOS digital ORCA-Flash 4.0 V2.
<ol><li>Ligue a unidade de aquecimento pelo menos 1h antes da imagem e coloque-a a 37 °C.</li>
	<li>Ligue a unidade de CO2 pelo menos 10 minutos antes da imagem e coloque-a em 5% de CO2.</li>
	<li>Ligue o microscópio, a câmera e o computador.</li>
	<li>Abra o software de aquisição de microscópio (ver Tabela de Materiais). Escolha a pasta para salvar imagens capturadas e digite um nome de arquivo. Salve cada filme como um novo arquivo.</li>
	<li>Coloque a ampliação em uma lente seca de 40x, contraste de fase. Defina o intervalo de tempo em 5 s, duração total do filme 10 min.</li>
	<li>Após a incubação de 15 minutos das células banhadas, coloque o prato de fundo de vidro com células aderidas no adaptador e fixe-o. Insira o adaptador com o prato em seu slot no estágio do microscópio.</li>
	<li>Tire a tampa do prato e coloque a tampa de CO2 em vez disso. Abra a válvula de CO2 . NOTA: Certifique-se de que a tampa de CO2 está limpa antes de colocá-la em cima do prato de fundo de vidro. Uma capa suja reduzirá a qualidade dos filmes. Limpe a parte inferior da tampa de CO2 com um lenço sem fiapos encharcado com 70% de etanol para remover poeira e sujeira. Limpe uma segunda vez com um lenço seco sem fiapos.</li>
	<li>Veja as células e encontre uma célula apropriada para imagens. Certifique-se de que a célula está em foco e comece a aquisição de filmes.</li>
</ol>5. Análise de imagem
NOTA: A análise da imagem é realizada utilizando-se ImageJ (Tabela de Materiais) como seguinte:
<ol><li>Abra o filme adquirido em ImageJ.</li>
	<li>Utilizando a ferramenta Reta na barra de ferramentas principal, faça oito linhas de 20 unidades arbitrárias cada perpendicular às saliências, incluindo a lamella e a borda da célula, em um arranjo radial a cada 45°, como mostrado na Figura 2A.</li>
	<li>Na barra de ferramentas principal, vá para Image > Stacks > Reslice. Isso produzirá uma imagem de kymógrafo, que descreve o movimento de pontos únicos dentro da membrana celular (Figura 2B). Esta ação deve ser realizada para cada linha fora das oito linhas separadamente.</li>
	<li>Extrair e contar manualmente a partir das respectivas imagens de kymógrafo o número de saliências, retrações e babados em cada uma das oito regiões da célula, marcadas pelas linhas de grade. Esses números representam a frequência de saliências, retrações e babados por 10 minutos (Figura 2C, D). NOTA: Os babados podem ser distinguidos de outras estruturas baseadas em sua aparência escura na microscopia de contraste de fase e seu movimento centrípeto, que começa na borda celular e termina na borda do corpo celular, o que pode ser observado nos filmes adquiridos. Note-se que, ao quantificar a saliência, a retração e a frequência do babado, os filmes devem ser observados como um controle para quantificação e especialmente para a definição de babados.</li>
	<li>Determine a persistência de saliência, distância e velocidade por meio da análise da kymografia. Para cada um dos kymógrafos gerados, o eixo X representa a distância, e o eixo Y representa o tempo.</li>
	<li>Para medir a distância de saliência, siga os passos 5.6.1-5.6.2.<ol>
<li>Desenhe uma linha perpendicular da base da saliência até o pico mais alto da saliência. Pressione M em ImageJ para medir o comprimento da linha em pixels.</li>
		<li>Para converter o comprimento dos pixels em μm, certifique-se de que a relação pixel para μm seja conhecida. NOTA: A relação μm/pixel é o comprimento físico de um pixel na câmera CCD / ampliação total. O tamanho do pixel é característico de cada tipo de câmera. Por exemplo, para a câmera usada neste estudo, o tamanho do pixel é de 6,5 μm x 6,5 μm, o comprimento físico é de 6,5 μm e a ampliação que usamos é de 40x. Portanto, a proporção μm para pixel da nossa câmera é de 0,1625 μm/pixel. Na análise, para uma linha no comprimento de 30 pixels, a distância de saliência seria de 30 pixels x 0,1625 μm/pixel = 4.875 μm (Figura 3).</li>
	</ol></li>
	<li>Para medir o tempo de saliência (persistência; a quantidade de tempo que uma saliência passa se projetando antes de se retrair), siga os passos 5.7.1-5.7.2.<ol>
<li>Desenhe uma linha horizontal desde o início da saliência (da esquerda para a direita) até a região do pico mais alto. Pressione M em ImageJ para medir o comprimento da linha em pixels.</li>
		<li>Para converter o comprimento de pixels em minutos, calcule a relação pixel a min. Esse valor depende do intervalo entre as imagens. NOTA: Neste exemplo, o intervalo entre as imagens é de 5 s, a relação min/pixel é de 0,0833, e o comprimento da linha horizontal é de 8 pixels. Portanto, o tempo de saliência é de 8 pixels x 0,0833 min/pixel = 0,6664 min.</li>
	</ol></li>
	<li>Meça e calcule o tempo de retração de forma semelhante ao tempo de saliência para uma linha desenhada horizontalmente na base da saliência de onde o pico da saliência é a sua base à direita (linha X2 na Figura 3).</li>
	<li>Calcule a velocidade de saliência dividindo a distância de saliência por tempo de saliência. Calcule a velocidade de retração dividindo a distância de saliência por tempo de retração. Neste exemplo, a velocidade de saliência é calculada como 4,875 μm/0,6664 min = 7,315 μm/min., e a velocidade de retração é idêntica porque a linha que representa o tempo é do mesmo comprimento. NOTA: Ao comparar diferentes tipos celulares, ou seja, células expressas tipo selvagem e construções mutantes da mesma proteína, é imperativo realizar uma análise cega, de modo que nenhum viés é introduzido.</li>
</ol>

<ol><li>Kurosaka, S., Kashina, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+biology+of+embryonic+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Birth+Defects+Research+Part+C+-+Embryo+Today%3A+Reviews%22%5BJournal%5D)">Cell biology of embryonic migration.</a> Birth Defects Research Part C - Embryo Today: Reviews. 84 (2), 102-122 (2008).</li>
<li>Pollard, T. D., Borisy, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+motility+driven+by+assembly+and+disassembly+of+actin+filaments%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cellular motility driven by assembly and disassembly of actin filaments.</a> Cell. 112 (4), 453-465 (2003).</li>
<li>Ponti, A., Machacek, M., Gupton, S. L., Waterman-Storer, C. M., Danuser, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+distinct+actin+networks+drive+the+protrusion+of+migrating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Two distinct actin networks drive the protrusion of migrating cells.</a> Science. 305 (5691), 1782-1786 (2004).</li>
<li>Chesarone, M. A., DuPage, A. G., Goode, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unleashing+formins+to+remodel+the+actin+and+microtubule+cytoskeletons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Unleashing formins to remodel the actin and microtubule cytoskeletons.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11 (1), 62-74 (2010).</li>
<li>Chesarone, M. A., Goode, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+nucleation+and+elongation+factors%3A+mechanisms+and+interplay%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Actin nucleation and elongation factors: mechanisms and interplay.</a> Current Opinion in Cell Biology. 21 (1), 28-37 (2009).</li>
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<li>Giannone, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lamellipodial+actin+mechanically+links+myosin+activity+with+adhesion-site+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Lamellipodial actin mechanically links myosin activity with adhesion-site formation.</a> Cell. 128 (3), 561-575 (2007).</li>
<li>Tojkander, S., Gateva, G., Lappalainen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+stress+fibers--assembly%2C+dynamics+and+biological+roles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Actin stress fibers--assembly, dynamics and biological roles.</a> Journal of Cell Science. 125, Pt 8 1855-1864 (2012).</li>
<li>Wilson, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin+II+contributes+to+cell-scale+actin+network+treadmilling+through+network+disassembly%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Myosin II contributes to cell-scale actin network treadmilling through network disassembly.</a> Nature. 465 (7296), 373-377 (2010).</li>
<li>Chhabra, E. S., Higgs, H. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+many+faces+of+actin%3A+matching+assembly+factors+with+cellular+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The many faces of actin: matching assembly factors with cellular structures.</a> Nature Cell Biology. 9 (10), 1110-1121 (2007).</li>
<li>Hinz, B., Alt, W., Johnen, C., Herzog, V., Kaiser, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+lamella+dynamics+of+cultured+cells+by+SACED%2C+a+new+computer-assisted+motion+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Quantifying lamella dynamics of cultured cells by SACED, a new computer-assisted motion analysis.</a> Experimental Cell Research. 251 (1), 234-243 (1999).</li>
<li>Bear, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antagonism+between+Ena%2FVASP+proteins+and+actin+filament+capping+regulates+fibroblast+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Antagonism between Ena/VASP proteins and actin filament capping regulates fibroblast motility.</a> Cell. 109 (4), 509-521 (2002).</li>
<li>Jacks laboratory protocol. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://jacks-lab.mit.edu/protocols/making_mefs">http://jacks-lab.mit.edu/protocols/making_mefs</a> (2021).</li>
<li>Doggett, T. M., Breslin, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Study+of+the+actin+cytoskeleton+in+live+endothelial+cells+expressing+GFP-actin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Study of the actin cytoskeleton in live endothelial cells expressing GFP-actin.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (57), e3187(2011).</li>
<li>Miller, A. L., Wang, Y., Mooseker, M. S., Koleske, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Abl-related+gene+%28Arg%29+requires+its+F-actin-microtubule+cross-linking+activity+to+regulate+lamellipodial+dynamics+during+fibroblast+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The Abl-related gene (Arg) requires its F-actin-microtubule cross-linking activity to regulate lamellipodial dynamics during fibroblast adhesion.</a> Journal of Cell Biology. 165 (3), 407-419 (2004).</li>
<li>Bryce, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortactin+promotes+cell+motility+by+enhancing+lamellipodial+persistence%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Cortactin promotes cell motility by enhancing lamellipodial persistence.</a> Current Biology. 15 (14), 1276-1285 (2005).</li>
<li>Lapetina, S., Mader, C. C., Machida, K., Mayer, B. J., Koleske, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arg+interacts+with+cortactin+to+promote+adhesion-dependent+cell+edge+protrusion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Arg interacts with cortactin to promote adhesion-dependent cell edge protrusion.</a> Journal of Cell Biology. 185 (3), 503-519 (2009).</li>
<li>Miller, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+actin+polymerization+and+adhesion-dependent+cell+edge+protrusion+by+the+Abl-related+gene+%28Arg%29+tyrosine+kinase+and+N-WASp%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Regulation of actin polymerization and adhesion-dependent cell edge protrusion by the Abl-related gene (Arg) tyrosine kinase and N-WASp.</a> Biochemistry. 49 (10), 2227-2234 (2010).</li>
<li>Lukic, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyk2+regulates+cell-edge+protrusion+dynamics+by+interacting+with+Crk%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Pyk2 regulates cell-edge protrusion dynamics by interacting with Crk.</a> Molecular Biology of the Cell. , (2021).</li>
</ol>

Os autores não têm conflito de interesses para divulgar.

A dinâmica de saliência de borda celular, composta por saliências, retrações e babados, é um pré-requisito e um evento potencial limitante de taxas na motilidade celular. Aqui descrevemos um método rápido e simples para medir a dinâmica das saliências de borda celular durante a disseminação. Este método permite imagens de curto prazo, gera uma quantidade significativa de dados, não requer rotulagem fluorescente de células ou equipamentos de microscopia fluorescente caros, e poderia ser usado como um método preliminar par...

A migração celular é um processo crítico que controla o desenvolvimento e a função de todos os organismos vivos. A migração celular ocorre em ambas as condições fisiológicas, como embriogênese, cicatrização de feridas e resposta imune, e em condições patológicas, como metástase do câncer e doença autoimune. Apesar das diferenças nos tipos celulares que participam de diferentes eventos migratórios, todos os eventos de motilidade celular compartilham mecanismos moleculares semelhantes, que foram conservados na evolução do protozoário aos mamíferos, e envolvem mecanismos comuns de controle citoesquelético que podem sentir o ambiente, responder a sinais e modular o comportamento celular em resposta1.
Um estágio inicial na migração celular pode ser a formação de saliências altamente dinâmicas na borda principal da célula. Por trás do lamellipodium pode-se encontrar a lamella, que casais atuam na contratelidade mediada por Myosin II e media a adesão ao substrato subjacente. Lamellipodia são induzidas por estímulos extracelulares, como fatores de crescimento, citocinas e receptores de adesão celular e são impulsionadas pela polimerização de actina, que fornece a força física que empurra a membrana plasmática para frente2,3. Muitas sinalizações e proteínas estruturais foram implicadas nisso; entre eles estão rho GTPases, que atuam coordenadamente com outros sinais para ativar proteínas reguladoras de actina, como o complexo Arp 2/3, proteínas familiares WASP e membros das famílias Formin e Spire em lamellipodia2,4,5.
Além da polimerização de actina, a atividade de miose II é necessária para a geração de forças contratuais no lamellipodium e na lamella anterior. Essas contrações, também definidas como retrações de borda celular, também podem resultar da despolimerização da actina dendrítica na periferia celular e são fundamentais para o desenvolvimento da borda principal lamellipodial e permitindo que a protrusão sinta a flexibilidade da matriz extracelular e outras células e determine a direção da migração6,7,8 . As saliências de borda celular que não podem ser anexadas ao substrato formarão babados de membrana periférica, estruturas semelhantes a folhas que aparecem na superfície ventral de lamellipodia e lamella e se movem para trás em relação à direção da migração. Como o lamellipodium não se prende ao substrato, um lamellipodium posterior se forma por baixo dele e empurra mecanicamente o primeiro lamellipodium em direção à superfície ventral superior. Os filamentos de actin no babado que antes eram paralelos ao substrato agora se tornam perpendiculares a ele, e o babado está agora posicionado acima do lamellipodium avançando. O babado que se move para trás cai de volta no citosol e representa um mecanismo celular para reciclagem de atolopodial em 9,10.
Aqui, descrevemos um ensaio para a medição da dinâmica de saliência de borda celular. O ensaio de saliência usa microscopia de vídeo de lapso de tempo para medir a dinâmica de saliência de borda única por 10 minutos durante a fase de disseminação da célula. A dinâmica da saliência é analisada gerando kymogramas a partir desses filmes. Em princípio, um kymograph transmite dados quantitativos detalhados de partículas móveis em uma trama esposteterna para produzir uma compreensão qualitativa da dinâmica das bordas celulares. A intensidade da partícula móvel é traçada para todas as pilhas de imagens em uma trama tempo versus espaço, onde o eixo X e o eixo Y representam tempo e distância, respectivamente11. Este método usa uma análise manual de kymógrafo com ImageJ para obter dados quantitativos detalhados, permitindo a recuperação de informações de filmes e imagens em caso de baixa relação sinal-ruído e/ou alta densidade de recursos, e a análise de imagens adquiridas em microscopia de luz de contraste de fase ou má qualidade da imagem.
O ensaio de saliência de borda celular descrito aqui é um método rápido, simples e econômico. Como tal, e porque tem sido mostrado correlacionar diretamente com a migração celular11,12, pode ser usado como um método preliminar para testar dinâmicas citoesqueletal envolvidas na motilidade celular antes de decidir realizar métodos mais exigentes de recursos. Além disso, também permite a medição quantitativa de como as manipulações genéticas (knockout, knockdown ou construtos de resgate) de proteínas citoesqueletal impactam a dinâmica citoesqueletal usando uma plataforma simples. O ensaio é um modelo instrutivo para explorar a dinâmica citoesquelético no contexto da migração celular e poderia ser usado para elucidação dos mecanismos e moléculas subjacentes à motilidade celular.

<table><tbody><tr><td>Placas de cultura de células de 10 cm</td><td>Greiner</td><td>P7612-360EA</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s meio de águia modificado (DMEM)</td><td>Biological Industries, Israel</td><td>01-055-1A</td><td>O meio contém glicose alta (4,5 g/L de D-glicose)</td></tr><tr><td>Dulbecco' s solução salina tamponada com fosfato (1xDPBS)</td><td>Biological Industries, Israel</td><td>02-023-1A</td><td></td></tr><tr><td>Soro fetal bovino (FBS)</td><td>Biological Industries, Israel</td><td>04-001-1A</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectina de plasma humano, líquido, 0,1%, adequado para cultura de células</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0895</td><td></td></tr><tr><td>Pratos de fundo de vidro</td><td>Cellvis</td><td>D35-20-1.5-N</td><td>Prato de fundo de vidro de 35 mm, tamanho do prato 35 mm, tamanho do poço 20 mm, vidro de cobertura # 1,5 (0,16-0,19 mm).</td></tr><tr><td>Software ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td>Feely disponível em: https://imagej.nih.gov/ij/download.html</td></tr><tr><td>LAS-AF Leica Application Suite 3.2</td><td></td><td></td><td>Software de aquisição de microscópio equipado com um CMOS digital ORCA-Flash 4.0 V2</td></tr><tr><td>Leica AF6000</td><td>Leica</td><td></td><td>Microscópio de campo claro invertido (40x, NA 1.3 ) equipado com óptica de contraste de fase, uma incubadora e unidade de CO2 com software de aquisição LAS AF equipado com um Câmera digital CMOS ORCA-Flash 4.0 V2.</td></tr><tr><td>Solução de L-glutamina</td><td>Biological Industries, Israel</td><td>03-020-1B</td><td></td></tr><tr><td>ORCA-Flash 4.0 V2 câmera digital CMOS</td><td>Hamamatsu Photonics</td> Solução de penicilina-estreptomicina <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Biological Industries, Israel</td><td>03-031-1B</td><td></td></tr><tr><td>Solução de tripsina-EDTA B (0,25%), EDTA (0,05%)</td><td>Biological Industries, Israel</td><td>03-052-1A</td><td></td></tr></tbody></table>

medindo a dinâmica de saliência da borda celular durante a disseminação usando microscopia de células vivas

Measuring Cell-Edge Protrusion Dynamics during Spreading using Live-Cell Microscopy

O desenvolvimento e a homeostase dos organismos multicelulares dependem da regulação coordenada da migração celular. A migração celular é um evento essencial na construção e regeneração de tecidos, e é fundamental no desenvolvimento embrionário, respostas imunológicas e cicatrização de feridas. A desregulação da motilidade celular contribui para distúrbios patológicos, como inflamação crônica e metástase do câncer. Migração celular, invasão de tecido, axônio e dendrito superam tudo iniciado com saliências mediadas por células mediadas por actina. Aqui, descrevemos um método simples, eficiente e de economia de tempo para a imagem e análise quantitativa da dinâmica de saliência de borda celular durante a disseminação. Este método mede características discretas da dinâmica da membrana de borda celular, como saliências, retrações e babados, e pode ser usado para avaliar como as manipulações de principais reguladores de actina impactam as saliências de borda celular em diversos contextos.

No experimento descrito na Figura 2, MEFs imortalizados foram banhados em pratos de fundo de vidro pré-revestidos com fibronectina para ativar sinalização mediada por integrin, bloqueada pela BSA desnaturada, para bloquear locais potenciais livres para adesão celular que não depende da ativação do integrin. Para chegar à fase de crescimento logarítmico a 70%-80% de confluência de células no dia do experimento, 0,7 x 106 MEFs foram emplacados em uma placa de cultura tecidual de 10 ...

Este protocolo visa medir os parâmetros dinâmicos (saliências, retrações, babados) de saliências na borda das células disseminar.

Medindo a dinâmica de saliência da borda celular durante a disseminação usando microscopia de células vivas

The development and homeostasis of multicellular organisms rely on coordinated regulation of cell migration. Cell migration is an essential event in the ...

O ensaio de saliência de borda celular mostrou-se diretamente correlacionado com a migração celular. Portanto, pode ser usado como um método preliminar para identificar proteínas críticas e mecanismos de sinalização envolvidos na motilidade celular. O método é rápido, simples, econômico e não requer rotulagem fluorescente ou uso de um microscópio fluorescente caro.Demonstrando o procedimento será Michal Gendler, um estudante do meu laboratório. Adicione dois mililitros de uma solução normal de ácido clorídrico no centro de uma placa de fundo de vidro e incubar por 20 minutos em temperatura ambiente. Lave o prato três vezes com dois mililitros de PBS.Diluir a fibronectina a 10 microgramas por concentração de mililitros na PBS e adicionar 200 microliters da solução diluída ao prato central de vidro. Incubar por uma hora a 37 graus Celsius. Prepare a solução 1%BSA e a PBS e passe-a através de um filtro de 0,2 micrômetros.Desnaturar a solução incubando a 70 graus Celsius por 30 minutos em um banho de água pré-aquecido. Lave o prato de fundo de vidro revestido com dois mililitros de PBS três vezes. Adicione dois mililitros de solução BSA desnaturadas e incubar o prato a 37 graus Celsius por uma hora.Lave o prato de vidro com dois mililitros de PBS três vezes. Antes de 16 a 18 horas de experimento em 0,7 milhões de células por placa de cultura tecidual de 10 centímetros de diâmetro para alcançar 70 a 80% de confluência. No dia seguinte, adicione dois mililitros de solução de trippsina à placa de cultura tecidual e incubar por dois a três minutos até que as células se despeguem.Adicione cinco mililitros do meio para inativar a trippsina. Usando um hemacitómetro, conte as células e a placa 20.000 células em dois mililitros do meio completo em um prato inferior. Em seguida, incubar o prato com células banhadas em uma incubadora por 15 minutos.Ligue a unidade de aquecimento e coloque-a a 37 graus Celsius uma hora antes da imagem. Além disso, ligue a unidade de dióxido de carbono e coloque-a em 5%10 minutos antes da imagem. Ligue o microscópio e a câmera.Ligue o computador e abra o software de aquisição de microscópio. Coloque a ampliação em um contraste de fase de lente seca de 40X. Defina a duração total do filme para 10 minutos com um intervalo de tempo de cinco segundos.Após 15 minutos de incubação, coloque o prato de fundo de vidro com células aderidas em um adaptador e fixe-o. Insira o adaptador com o prato nas ranhuras no estágio do microscópio. Tire a tampa do prato, coloque a tampa de dióxido de carbono e abra a válvula de dióxido de carbono.Localize uma célula apropriada para imagens. Comece a aquisição de filmes depois de se concentrar no celular. Para realizar a análise da imagem, selecione a ferramenta reta no software de análise de imagens e faça oito linhas de 20 unidades arbitrárias perpendiculares às saliências em um arranjo radial a cada 45 graus, incluindo lamella e borda celular.Na barra de ferramentas principal, vá para a imagem, selecione Stacks e clique em Reslice para gerar uma imagem kymografia descrevendo o movimento de pontos únicos dentro da membrana celular. Utilizando as imagens de kymógrafo, extraia e contabiliza manualmente o número de saliências, retrações e babados em cada uma das oito regiões da célula marcada pelas linhas de grade. Esses números representam a frequência de saliências, retrações e babados por 10 minutos.Determine a persistência de saliência, distância e velocidade por meio da análise da kymografia. Para determinar a distância de saliência, retire a linha perpendicular da base da saliência até o pico mais alto da saliência. Pressione M para medir o comprimento da linha em pixels e certifique-se de que a relação pixel/micrômetro é conhecida por converter o comprimento em micrômetros.A quantificação de saliências, reações e babados foi realizada manualmente por 10 minutos e a frequência média obtida para saliências e retrações foi de 5,1 e 2,1 para babados. O kymograph representativo tinha uma distância de saliência de aproximadamente 4,8 micrômetros e um tempo de saliência de aproximadamente 0,6 minutos. Um exemplo de célula que deve ser excluída da análise é representado.A análise da kymografia revelou que a célula não estava presente em sua fase de disseminação e não apresentava nenhuma saliência de membrana clara. O mais importante é escolher células corretas para imagens. Uma célula adequada deve estar em sua fase de disseminação e não deve tocar outras células para evitar a comunicação e sinalização celular-célula.O método pode ser usado como uma ferramenta preliminar para testar a dinâmica citoesquelletal envolvendo motilidade celular antes de decidir realizar mais resultados exigindo ensaios de migração celular.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Imagens microscópicas de vida das células endoteliais expressando GFP-actina permite a caracterização de mudanças dinâmicas em estruturas do citoesqueleto. Ao contrário das técnicas que utilizam amostras fixadas, este método fornece uma avaliação detalhada das mudanças temporais no citoesqueleto de actina nas mesmas celas antes, durante e depois de vários estímulos físicos, farmacológicos, ou inflamatórias.

Estudo do citoesqueleto de actina em Live Células Endoteliais Expressando GFP-Actina

Um novo protocolo de imagem foi desenvolvido usando um atuador mecânico acionado por motor personalizado para permitir a medição de respostas em tempo real à tensão mecânica em células vivas. Relevante para a mecanobiologia, o sistema pode aplicar deformações de até 20%, permitindo imagens quase em tempo real com microscopia de força confocal ou atômica.

Imagens de células vivas durante Mecânica estiramento

Apresentamos uma solução de software para o rastreamento semi-automatizado da concentração relativa de proteína ao longo do comprimento de protrusões celulares dinâmicas.

Uma interface de usuário gráfica para rastreamento assistido por software da concentração de proteínas em protrusões celulares dinâmicas

Aqui, detalhamos as técnicas experimentais utilizadas para avaliar as forças de saliência que podosomes aplicar sobre um filme compatível, desde a preparação do filme para a análise automatizada de imagens topográficas.

Microscopia de força de protrusão: Um método para quantificar as forças desenvolvidas pela célula saliências

Descrevemos como micro e photomanipulation técnicas tais como o FRAP e photoactivation permitem a determinação de parâmetros de motilidade e a spatiotemporal dinâmica de proteínas dentro de migração de células. Leituras experimentais incluem subcellular dinâmica e volume de negócios de reguladores da motilidade ou o citoesqueleto de actina subjacente.

Técnicas de micromanipulação, permitindo a análise da dinâmica morfogenética e rotatividade dos reguladores do citoesqueleto

Usando um dispositivo projetado previamente para aplicar a tensão mecânica às pilhas aderentes, este papel descreve uma geometria redesenhada do substrato e um instrumento personalizado para a imagem latente da único-pilha de alta resolução de pilhas tensas com um objetivo da imersão do óleo 100x.

Imagem latente de alta resolução da dinâmica nuclear em pilhas vivos a tensão elástica uniaxial

Este método é útil para quantificar a dinâmica precoce da adesão celular e disseminação de células dependentes de ancoragem para a fibronectina. Além disso, este ensaio pode ser usado para investigar os efeitos da homeostase redox alterada na propagação da pilha e/ou nas vias de sinalização intracelular adesão-relacionadas da pilha.

Examinando a dinâmica da adesão celular e disseminação de células epiteliais em fibronectina durante o estresse oxidativo

A imagem viva da excitose lisosômica em células micropatteradas permite uma quantificação espacial desse processo. A normalização da morfologia usando micropatterns é uma excelente ferramenta para descobrir regras gerais sobre a distribuição espacial dos processos celulares.

Quantificando parâmetros espáteris de exocitose celular em células micropatteradas

Neste protocolo, apresentamos os procedimentos experimentais de um ensaio de difusão celular que é baseado em microscopia de células vivas. Fornecemos uma ferramenta computacional de código aberto para a segmentação imparcial de células fluorescentes rotuladas e análise quantitativa da dinâmica da lamellipodia durante a disseminação celular.

Análise quantitativa da dinâmica da borda celular durante a disseminação celular

Este artigo apresenta um protocolo passo a passo detalhado sobre como utilizar um sistema multifuncional e programável integrado ao usuário que permite que a imagem multicanal e a análise mecanobiológica automática e a elucidação da mecano-sensibilidade da proteína associada ao Sim (YAP).

Interrogatório de Mecanobiologia totalmente óptica de proteína associada a sim em câncer humano e células normais usando um sistema multifuncional

Aqui, apresentamos um dispositivo de estiramento equibiaaxial versátil que é acionado pneumaticamente e compatível com microscopia de alta resolução.

Dispositivo de alongamento equibiaxial para microscopia de fluorescência confocal de células vivas de alta ampliação

Aprenda a medir a dinâmica de saliência da borda celular durante a disseminação usando microscopia de células vivas. Este método simples e econômico avalia protrusões, retrações e ondulações sem necessidade de marcação fluorescente.

Medindo a dinâmica de saliência da borda celular durante a disseminação usando microscopia de células vivas

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