Drosófila Comportamento de evasão passiva como um novo paradigma para estudar aprendizagem aversiva associativa

Este protocolo descreve um simples ensaio comportamental que permite estudar a aprendizagem associativa adversa e a consolidação da memória em moscas, incluindo efeitos das interações no ambiente genético. O ensaio aqui apresentado é um procedimento simples, reprodutível e econômico para estudar mecanismos de memória que podem ser facilmente montados com alguns suprimentos disponíveis. Este ensaio poderia fornecer insights sobre mecanismos básicos subjacentes à aprendizagem e prejuízos de memória resultantes de várias manipulações genéticas, farmacológicas e dietéticas.

Demonstrando este procedimento estarão Morgan Tedder e Steven Bradley, estudantes de graduação do meu laboratório. Para começar, faça um furo de quatro milímetros perpendicularmente cerca de quatro milímetros do fundo dentro de um tubo de cultura de polipropileno de 14 mililitros. Remova a parte superior do tubo de cultura para fazer um fragmento inferior de 45 milímetros utilizado como compartimento inferior.

Corte a parte superior de uma ponta de pipeta de 1000 microliter para criar um fragmento de 12 milímetros. Insira o fragmento no orifício de quatro milímetros do tubo de cultura como uma doca de carregamento para transferir as moscas. Corte uma peça de 15 milímetros de tubos de vinil transparentes e insira o compartimento inferior e superior de extremidades opostas na tubulação.

Conecte o conjunto verticalmente usando um grampo ajustável de dois pinos. Localize o compartimento superior verticalmente ligado com tubos de choque. Conecte os tubos de choque com um estimulador elétrico para gerar choques elétricos.

Usando um bloco gelado, imobilize moscas de três a quatro dias de idade e transfira-as para frascos separados com comida 24 horas antes do experimento. Atribua um código a todos os frascos descritos no manuscrito do texto. Suga suavemente uma mosca para dentro do aspirador da boca, desenhando ar.

Deposite a mosca soprando levemente na doca de carregamento e inicie imediatamente um cronômetro de um minuto e cronômetro. Ligue o estimulador e entregue um choque elétrico quando a mosca entrar no tubo de choque. Pressione o cronômetro para gravar a primeira latência.

Se a mosca reenters o tubo de choque, entregar choques adicionais. Usando uma contagem ou um contador baseado em Arduino, registo o número de choques durante um teste de um minuto. Transfira suavemente a mosca de volta para o frasco no final de um julgamento de um minuto.

Regissuam a latência, o número de choques recebidos e qualquer mudança notável no comportamento. Usando 70% de etanol, limpe o compartimento inferior e de choque. Limpe com um tecido de limpeza sem fiapos e seque-o usando um secador de cabelo.

Repita o julgamento com a próxima mosca. Limpe o compartimento inferior com água e detergente inodoro após completar o experimento. Usando 70% de etanol, limpe o compartimento inferior e de choque e o ar seco durante a noite.

Repetindo o processo acima após 24 horas, realize um segundo teste. Em uma sequência semelhante, teste as moscas. Após a realização de um ensaio de evasão passiva em moscas machos Drosophila melanogaster, os resultados mostraram que a latência aumenta, o número de choques diminui, demonstrando que as moscas aprenderam associação entre o compartimento superior e um choque elétrico.

A distribuição de frequência revelou que a maioria das moscas entra no compartimento superior e recebe de um a três choques no primeiro teste. Até o quarto teste, a maioria das moscas não entram no compartimento superior e não recebem choques. Em experimentos subsequentes, a duração do ensaio foi reduzida para um minuto porque a distribuição de frequência para latências mostrou claramente que se a mosca não entra no compartimento superior dentro de 60 segundos no primeiro ensaio, geralmente não entra em tudo.

Os experimentos de ensaio de evasão passiva foram repetidos em simulados de Drosophila moscas masculinas e femininas. Os resultados mostraram que as moscas foram eficazes no aprendizado do comportamento de evasão passiva como evidente a partir das mudanças nas distribuições de frequência para latências e choques em moscas machos e fêmeas. A comparação das latências e o número de choques entre homens e mulheres não revelou diferenças estatisticamente significativas.

No entanto, as moscas fêmeas receberam um pouco mais de choques em cada ensaio. A análise das lutas de preparação nos ensaios dois e três revelou que a duração total do preparo diminui significativamente em moscas femininas de um teste para o julgamento três. Isso sugere que as moscas experimentam estresse comportamental que faz paralelo com comportamentos de ansiedade de roedores.

A comparação dos efeitos da dieta ocidental e do exercício de fuga sobre o comportamento de evasão passiva mostram que a dieta ocidental diminui a latência e aumenta o número de choques indicando que a dieta ocidental prejudica o aprendizado associativo aversivo em moscas. Por outro lado, o exercício de voo atenuou o efeito negativo da dieta ocidental. Ao tentar este procedimento, lembre-se de não estressar moscas.

Moscas estressadas entrariam no compartimento superior muito rapidamente ou não entrariam. Todos os experimentos devem ser realizados sob as mesmas condições ambientais e ao mesmo tempo do dia. Essa técnica dá aos pesquisadores um novo ensaio simples que pode ser usado para dissecar mecanismos intrínsecos de aprendizagem e consolidação da memória em moscas.