Modelando um site ativo enzimático usando freeware de visualização molecular
December 25th, 2021
Uma habilidade fundamental na modelagem biomolecular é exibir e anotar locais ativos em proteínas. Esta técnica é demonstrada usando quatro programas gratuitos populares para visualização macromolecular: iCn3D, Jmol, PyMOL e UCSF QuimeraX.
Visualizar macromoléculas biológicas é uma habilidade crítica para estudantes e profissionais das ciências biológicas. Neste protocolo, demonstramos como modelar o local ativo da enzima glucokinase usando quatro programas disponíveis livremente para modelagem molecular. Este tutorial destaca várias etapas do protocolo para cada programa, que inclui selecionar ligantes vinculados e usar os ligantes para exibir aminoácidos e moléculas de água dentro de cinco angstroms.
As informações de suporte deste manuscrito contêm um vídeo dedicado para cada programa, que detalha todas as etapas do protocolo com maiores explicações. A estrutura será modelo PDBID. 3FGU representa o complexo catalítico da enzima glucokinase.
O local ativo da enzima está ligado a dois de seus substratos, beta-D-glicose, que deu ao identificador BGC e um íon de magnésio, MG. Além disso, este análogo de substrato, um ácido fosfo aminoforico, éster adenilato, ANP está ligado ao local ativo da glucokinase. Este análogo não hidrolisável de triptosfato de adenosina, ATP impede que a reação de fosforilação ocorra, o que captura o complexo de local ativo pré-catálise. A interface do programa de modelagem UCSF ChimeraX contém menus suspensos, uma barra de ferramentas, o visualizador de estrutura e uma linha de comando.
Começaremos o protocolo com a etapa 1.4, selecionando resíduos dentro de cinco angstroms para definir um local ativo. Para selecionar o câmbio de controle de pressão dos ligantes e clique em qualquer átomo ou ligação em cada um dos três ligantes. Pressione a tecla de seta para cima até que todos os três ligantes sejam destacados com um brilho verde.
Defina a seleção para uso futuro clicando no menu suspenso, selecione definir seletor, digite ligantes para o nome de seleção e clique em ok. Novamente, usando o menu selecionado, selecione a zona. Alterne isso para resíduos e certifique-se de que a caixa superior seja verificada.
Clique bem. Observe que as partes do desenho animado dentro de cinco angstroms desses ligantes são destacadas. Para exibir as cadeias laterais como varas e mostrar ao local ativo moléculas de água usam as ações do menu de ligações atômicas para mostrá-las.
Ou alternar com esses botões aqui. Para limpar a seleção, clique em qualquer lugar no espaço vazio. O resultado final deste protocolo deve ser um modelo com o local ativo da proteína e os ligantes mostrados como varas coloridas de forma contrastante.
As principais interações de ligação polar são mostradas com linhas pontilhadas e alguns dos resíduos que fazem contatos são rotulados. A interface iCn3D contém menus suspensos, o visualizador da estrutura e um registro de comando. Esta visualização mostra os conjuntos selecionados e os menus pop-up de sequência e anotações, que aparecem à medida que o usuário executa comandos que exigem deles.
Começaremos o protocolo na etapa 2.4, selecionando resíduos dentro de cinco angstroms para definir um local ativo. Para selecionar os ligantes, use o menu suspenso selecionado e clique em selecionar em 3D, certifique-se de que o resíduo seja verificado. Segurando o botão alt em um PC ou no botão de opção em um Mac, clique no primeiro ligante.
Em seguida, pressione o controle e clique nos dois liganos restantes para adicioná-los à seleção. Salve a seleção usando o menu suspenso, clique em selecionar, salvar seleção, inserir um nome e clicar em salvar. O menu pop-up de configurações selecionadas aparecerá agora com os três ligantes selecionados.
Agora selecione os resíduos dentro de cinco angstroms dos ligantes. Use o menu suspenso selecionado por distância. No menu pop-up que aparece, altere a lança do segundo item com um raio para cinco angstroms digitando no bloco, clique em exibição.
E, em seguida, feche a janela clicando no X no canto superior direito. Salve o site ativo de cinco angstrom clicando no menu suspenso, selecione salvar a seleção e use o teclado para inserir um nome. Em seguida, clique em salvar.
Agora crie uma nova seleção que combine os dois conjuntos. Estes podem ser combinados no menu pop-up de configurações selecionadas. Em um PC, clique em controle nos dois conjuntos ou em um clique de comando Mac.
Novamente, clique no menu suspenso, selecione salvar seleção e digite um novo nome e, em seguida, clique em salvar. Para mostrar interações como ligações de hidrogênio use o menu de análise e selecione interações. Só estaremos interessados em ligações de hidrogênio e pontes de sal aqui.
Então vamos desmarcar o resto desses. Vamos selecionar três ligantes. E para o segundo set, os resíduos dentro de cinco angstroms.
Clique em interações de exibição 3D e feche a janela. Isso mostra alguns dos resíduos que estão interagindo, mas não mostra todo o local ativo de cinco angstrom. Para exibir que usará novamente o menu de conjuntos selecionados.
Clique em cinco angstrom completos e, em seguida, no menu suspenso, clique em cadeias laterais de estilo, sticks. Para aplicar a coloração cpk, clique no menu suspenso de cores e clique em átomo. O resultado final do protocolo deve ser um modelo que se pareça com o local ativo da proteína e o ligante mostrado como varas coloridas de forma contrastante.
Importantes interações de ligação são mostradas com linhas pontilhadas e todos os resíduos dentro de uma das seleções criadas durante o protocolo são rotulados. A interface Jmol contém menus suspensos, uma barra de ferramentas, o visualizador de estrutura, um menu pop-up e o console Jmol contendo a linha de comando. Iniciamos o protocolo Jmol na etapa 3.4, selecionando resíduos dentro de cinco angstroms para definir um local ativo.
O console Jmol é a melhor maneira de selecionar os resíduos dentro de cinco angstroms. Digite este comando para selecionar resíduos dentro de cinco angstroms dos três ligantes. 193 átomos são selecionados, mas estes não representam os resíduos completos de aminoácidos.
Para selecioná-los, use o comando digitado, selecione dentro (grupo, selecionado) e pressione enter. Observe que a seções adicionais de halos aparecem. Para mostrar esses resíduos como varas, clique com o botão direito do mouse para trazer o menu pop-up, passe o mouse sobre estilo, esquema e, em seguida, clique em sticks.
Note que ainda há algumas auréolas vazias aqui. Estas são as moléculas de água no local ativo. Para selecionar apenas as moléculas de água, podemos re-executar este comando e depois modificá-lo.
Clique dentro do console e use as teclas de seta para cima para encontrar esse comando e clique em enter para re-executá-lo. Para exibir as moléculas de água como átomos, queremos remover a seleção do ligante e da proteína. Vamos digitar dois comandos para fazer isso.
Nossos liganos são considerados grupos hetero, mas a água também é considerada um. Então, dentro deste comando, precisamos definir que não estamos removendo a água. Pressione enter e agora apenas as moléculas de água são selecionadas.
Clique no menu de exibição suspenso, passe o mouse sobre o átomo e clique em 20% do raio van der Waals. O íon magnésio verde ainda é mostrado como varas. Íons mais comuns são mostrados como esferas.
Clique no console Jmol e digite mg seleto e, em seguida, o espaço encha 50%Os ligantes dentro das cadeias são coloridos de forma idêntica. Para distingui-los um do outro, é útil recolorir os ligantes. No console, executarei um comando multiline, que copiei de uma folha de trapaça que eu escoria no vídeo suplementar da Jmol.
O resultado deste protocolo deve ser um modelo que se parece com este com o local ativo da proteína mostrado como varas. E os ligantes nos mostraram paus em um esquema de cores mais suave. As linhas amarelas indicam as interações de ligação e os resíduos individuais são rotulados como desejados.
A interface PyMOL contém menus suspensos, o visualizador da estrutura, o painel de objetos nomes e o menu de controles do mouse. A linha de comando principal também está rotulada nesta figura. Iniciamos o protocolo primitivo na etapa 4.4, selecionando resíduos dentro de cinco angstroms para definir um local ativo.
Para selecionar os ligantes clique em cada um deles. Uma nova seleção aparece, que pode ser renomeada clicando no botão A. Usando o teclado, exclua as letras sele e digite liganos no lugar delas.
Pressione enter. Podemos usar esta seleção para definir a área ao seu redor. Comece clicando no botão A e selecione a duplicata do item do menu.
Nesta nova seleção, sel01, clique em A e selecione o item do menu de renome. Usando o teclado, exclua as letras existentes e digite ativo. Isso ainda está selecionando nossos três ligantes, então teremos que modificá-lo novamente, usando o botão ações A.
Clique no botão, selecione modificar e expanda a seleção por cinco angstroms. Agora capturamos os ligantes e os resíduos dentro de cinco angstroms. O s no botão S significa show.
Clique nisso para exibir a proteína de diferentes maneiras. Vamos mostrar este alcaçuz como paus. Clique no espaço vazio para limpar a seleção.
Isso capturou os aminoácidos dentro de cinco angstroms, mas não a água. Podemos novamente, duplicar a seleção e agora modificá-la para selecionar apenas a água. Nas ações Um botão, duplicado.
A seleção 2 aparece. Vamos renomear isso para água ativa. Desta vez, usaremos o botão A para modificar, ao redor para selecionar os átomos em torno de nossa seleção.
Átomos dentro de quatro angstroms. Isso selecionou a água, mas também alguns átomos das cadeias laterais. Para modificar isso ainda mais, use o botão A para modificar e restringir ao solvente.
Agora podemos ver que as moléculas de água estão acesas. Novamente no botão A, podemos aplicar uma predefinição. Selecione predefinição, bola e vara e agora as moléculas de água são mostradas como esferas.
O resultado final do protocolo é um modelo que se parece com este com o site ativo em ligantes mostrados como sticks coloridos de forma contrastante. As linhas amarelas de traço mostram interações de ligação polar e resíduos individuais são rotulados usando as seleções criadas no painel de objetos nomes. Erros na execução do protocolo podem levar a resultados abaixo do normal.
Por exemplo, toda a proteína sendo exibida como varas. Para solucionar problemas, o usuário precisará primeiro ocultar a representação do bastão para toda a estrutura. E, em seguida, reexibir a representação do bastão apenas para o objeto chamado ativo usando o botão S.
Aqui os modelos gerados usando cada programa são mostrados lado a lado. Embora haja diferenças no display da enzima, as mesmas características e interações principais podem ser vistas em cada um dos quatro modelos. Um usuário interessado em dominar um dos programas que contém uma linha de comando quer aprender a aplicar e modificar comandos digitado.
Como eu aludi no protocolo Jmol, uma ferramenta útil é uma folha de trapaça de comando. Um arquivo de texto simples contendo códigos frequentemente usados para referência. Para se tornar um usuário avançado, é útil entender quais partes do protocolo podem ser adaptadas e modificadas.
Com a prática, esses protocolos podem ser aplicados para modelar qualquer site ativo de enzimas de interesse.
Visão Geral
Este artigo demonstra a habilidade de modelagem biomolecular através da visualização do sítio ativo da enzima glucoquinase usando quatro programas gratuitos: iCn3D, Jmol, PyMOL e UCSF ChimeraX. O tutorial fornece instruções passo a passo para modelagem e anotação do sítio ativo com ligantes ligados.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Modelagem biomolecular
- Visualização de proteínas
- Análise do sítio ativo da enzima
Fundo
- Entender as estruturas das proteínas é crucial nas ciências biológicas.
- Sítios ativos são essenciais para a função da enzima e interação com substratos.
- Várias ferramentas de software estão disponíveis para visualização de macromoléculas.
- Este estudo se concentra na glucoquinase, uma enzima envolvida no metabolismo da glicose.
Propósito do Estudo
- Ensinar aos pesquisadores como modelar sítios ativos de enzimas efetivamente.
- Comparar diferentes ferramentas de visualização molecular.
- Fornecer um guia abrangente para seleção e exibição de ligantes e resíduos.
Métodos Utilizados
- Utilização de iCn3D, Jmol, PyMOL e UCSF ChimeraX para modelagem.
- Protocolo passo a passo para seleção de resíduos dentro de cinco angstroms dos ligantes.
- Visualização de aminoácidos e moléculas de água na proximidade dos ligantes.
- Anotação de interações chave e características estruturais.
Principais Resultados
- Modelagem bem-sucedida do sítio ativo da glucoquinase com ligantes ligados.
- Visualização clara das interações entre a enzima e os substratos.
- Demonstração das capacidades de cada ferramenta de software.
- Criação de um vídeo instrucional detalhado para cada programa.
Conclusões
- O estudo fornece insights valiosos sobre técnicas de modelagem biomolecular.
- Destaca a importância das ferramentas de software na biologia estrutural.
- Pesquisadores podem visualizar e analisar efetivamente sítios ativos de enzimas.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
Biomolecular visualization enables target validation by revealing structural determinants of ligand binding and enzyme function. Modeling active sites supports mechanistic de-risking in early discovery by clarifying structure-function relationships. This skill enhances predictive confidence in lead identification and assay development workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through visualization of ligand-binding interactions in the glucokinase active site.
- Operational Value: Supports biological de-risking by identifying key amino acid residues and water molecules involved in substrate recognition.
- Predictive Value: Facilitates portfolio triage by providing structural insights that inform target confidence and druggability assessments.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological models for downstream screening by defining active site residues within five angstroms of bound ligands.
- Operational Value: Promotes assay standardization and reproducibility through consistent visualization of binding interactions across iCn3D, Jmol, PyMOL, and UCSF ChimeraX.
- Scalability: Enables platform reuse for screening campaigns by providing transferable protocols for modeling any enzyme active site of interest.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-stage structural insights to preclinical validation by maintaining consistency in active site modeling across workflows.
- Mechanistic De-risking: Highlights polar binding interactions and residue labeling to support structure-based design and lead optimization.
- Disease Relevance: Models human glucokinase, a key enzyme in glucose metabolism, relevant to diabetes and metabolic disorder target programs.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target validation through lead identification by enabling structural analysis of enzyme-ligand complexes.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by visualizing how ligands bind to the glucokinase active site.
- Screening: Ensures assay readiness through standardized selection and display of residues and water molecules in proximity to ligands.
- Analytics: Generates quantitative structural outputs such as hydrogen bond visualization and residue labeling that aid in comparing ligand-binding modes.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by providing a reusable framework for modeling enzyme active sites in disease-relevant systems.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable capability for modeling any enzyme active site, reducing redundant training and increasing cross-team consistency.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation, reduction of mechanistic ambiguity in enzyme-ligand interactions.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and cross-platform consistency in biomolecular visualization.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions, capital efficiency in early discovery, and reduced biological risk in lead optimization.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of targets based on structural confidence and binding site accessibility.
Implementation Considerations
- Requires foundational knowledge in structural biology and protein-ligand interactions.
- Needs access to computational infrastructure capable of running iCn3D, Jmol, PyMOL, or UCSF ChimeraX.
- Demands cross-team standardization of visualization protocols to ensure consistent interpretation of active site models.
- Involves adaptation considerations when applying the protocol to different enzyme systems or ligand types.
- Limited by user proficiency in command-line interfaces and selection tools across the four software platforms.
