Identificação da fonte de proteínas secretadas no rim por injeção de Brefeldin A

Nossa técnica nos permite identificar a fonte e a contribuição relativa das células produtoras de citocinas nos rins lesados. O uso de Brefeldin A para prevenir a secreção de proteínas nos permite reunir mais informações sobre as células produtoras de citocinas em órgãos sólidos, como o tipo de célula e o estado dessas células.

Nosso protocolo deve ser facilmente adaptável a muitos sistemas de órgãos. Como a Brefeldina A é uma pequena molécula permeável às células, ela deve inibir a secreção na maioria dos tipos de células, permitindo a detecção de citocinas e outras proteínas secretadas.

A injeção do cóccix é a etapa mais desafiadora tecnicamente porque o cóccix do rato é muito pequeno. Recomendamos praticar esta etapa antes de realizar nosso protocolo em animais experimentais.

[Instrutor] Comece colocando a gaiola pela metade, metade fora da almofada de aquecimento por 10 minutos para garantir que os ratos estejam aquecidos. Depois de colocar o mouse em um dispositivo de contenção, desinfete a cauda usando um cotonete de iodopovidona e álcool três vezes. Segure a cauda horizontalmente e visualize as veias laterais da cauda. Em seguida, insira uma agulha de calibre 28, mantendo a agulha e a seringa paralelas à veia na direção da cabeça. Injete 200 microlitros da solução de BFA de 1,25 miligrama por mililitro. A veia deve ficar clara à medida que o sangue é substituído pela solução injetável. Em seguida, remova a agulha e pressione a cauda suavemente até que o sangramento pare. Retorne os ratos para a gaiola e monitore-os quanto a sangramento adicional ou sinais de angústia. Use uma seringa de 20 mililitros e perfunda o camundongo com 10 a 20 mililitros de PBS através do ventrículo esquerdo a uma taxa de fluxo de dois a quatro mililitros por minuto até que o perfusato fique claro. Remova os rins segurando a artéria e a veia renais perto da papila e cortando o vaso do lado oposto ao rim. Em seguida, remova suavemente a cápsula renal retirando-a manualmente ou com uma pinça fina e estéril. Use uma caneta marcadora de barreira hidrofóbica e contorne as seções de tecido mantendo pelo menos cinco milímetros de distância do tecido até o contorno da barreira hidrofóbica. Em seguida, adicione 50 microlitros de tampão de bloqueio contendo 3% de soro de burro e 0,1% de triton em 1% de albumina de soro bovino TBS no topo da seção. Incube a temperatura ambiente por uma hora em uma câmara umidificada. Diluir os anticorpos primários com PBS na concentração apropriada. Para detectar citocinas, dilua os anticorpos direcionados contra TGF beta one, PDGF-D ou CTGF em 50 microlitros de PBS. Adicione o anticorpo primário Anti-Alpha SMA conjugado com Cy3 à solução de anticorpo primário em diluições de 1:200 para marcar os miofibroblastos. Remova o tampão de bloqueio e adicione os anticorpos primários à seção, garantindo que ela não vaze do contorno hidrofóbico circular. Incube durante a noite a quatro graus Celsius em uma câmara umidificada. Remova a câmara umidificada da incubadora e lave as lâminas com PBS três vezes por cinco minutos. Em seguida, dilua os anticorpos secundários apropriados em um a 200 com PBS. Incubar as amostras com 50 microlitros de soluções de anticorpos secundários por uma hora em temperatura ambiente em uma câmara umidificada. Remova as lâminas da câmara umidificada e lave com PBS por cinco minutos. Diluir a lectina de lótus tetragonolobus conjugada com fluoresceína em PBS com cálcio e magnésio na concentração de 10 microgramas por mililitro. Em seguida, incube os tecidos com 50 microlitros de solução LTL por 30 minutos em temperatura ambiente em uma câmara umidificada. Remova as lâminas da câmara umidificada e lave-as com PBS com cálcio e magnésio por cinco minutos. Incube os tecidos com 50 microlitros de DAPI para corar os núcleos de DNA por cinco minutos em temperatura ambiente. Lave uma vez com PBS. Adicione 20 microlitros de reagente de montagem antidesbotamento ao tecido para montar as lamínulas e, em seguida, coloque lentamente a lamínula. Aguarde 24 horas para que o reagente antidesbotamento solidifique antes de fazer a imagem. Ligue o microscópio invertido com uma platina XY automatizada e selecione a objetiva de 20x. Coloque a lâmina no microscópio stage e localize a seção de tecido. Em seguida, abra o software de aquisição de imagem e clique em ao vivo para abrir a janela de visualização ao vivo. Encontre a seção de tecido garantindo que esteja em foco. Clique no menu Adquirir e selecione digitalizar imagem grande. Configure a área a ser escaneada movendo o palco usando o joystick para a parte mais à esquerda da seção de tecido e clique na seta para a esquerda. Repita isso para os segmentos de tecido superior, direito e inferior. Clique no menu de aquisição e certifique-se de que a caixa de seleção para captura multicanal esteja marcada. Para capturar imagens multicanal, clique na guia lambda, clique em cada canal e defina o tempo de exposição para um nível em que a coloração seja aparente sem saturar nenhuma parte da imagem. Repita isso para cada canal a ser coletado. Em seguida, clique em Digitalizar. Abra o software de aquisição de imagem e clique em Arquivo. Em seguida, clique em Abrir e selecione a imagem. Clique com o botão direito do mouse na janela de imagem e escolha ROI poligonal. Descreva o ROI com uma ferramenta à mão livre. Em seguida, delineie as células do túbulo positivo para LTL ou células intersticiais positivas para SMA alfa. Clique na guia de medição e, em seguida, no limite. Configure os limites superior e inferior ajustando os controles deslizantes para ambos os lados da área de sinal positivo. Em seguida, clique na guia ROI. Por fim, clique no ícone de exportação para salvar os valores. Use um software de planilha para calcular as porcentagens da área do sinal positivo por área de ROI.

[Apresentador] As vesículas beta-positivas para TGF no terceiro dia após a administração de cisplatina ou solução salina são mostradas nas imagens representativas. Vesículas beta positivas para TGF são observadas em PTCs marcados com LTL em rins tratados com cisplatina na presença de BFA. No entanto, essas vesículas não foram observadas em rins não lesionados ou não tratados com BFA.

[Instrutor] A modificação revelou um aumento na área positiva para TGF beta com o tratamento com BFA na lesão renal aguda induzida por cisplatina. Semelhante ao TGF beta, as vesículas positivas para PTGF-D ou CTGF positivas também se acumularam com o tratamento com BFA na LRA induzida por cisplatina. A quantificação demonstrou que as áreas positivas para PDGF-D e CTGF também aumentaram significativamente com BFA: Em células do túbulo proximal positivas para LTL, a injeção de BFA não aumentou significativamente os níveis plasmáticos de BUN no terceiro dia após a injeção de cisplatina. Vesículas beta positivas para TGF foram observadas em células intersticiais marcadas com SMA alfa em LRA de cisplatina com tratamento com BFA. A modificação revelou que as áreas positivas para TGF beta na área positiva para SMA alfa aumentaram significativamente com o tratamento com BFA na LRA cisplatina. Semelhante às vesículas beta positivas para TGF, as vesículas positivas para CTGF também aumentaram com o tratamento com BFA. A quantificação demonstrou que o tratamento com BFA aumentou a proporção de área positiva de CTGF para área positiva de SMA alfa na LRA induzida por cisplatina. Em comparação com a lesão induzida pela cisplatina, as vesículas positivas para TGF-beta nos PTCs foram muito menores na fase crônica da AA. Houve coloração positiva mínima em PTCs positivos para LTL. No entanto, a intensidade do sinal de TGF beta em PTCs positivos para a molécula de lesão renal um foi aumentada com o tratamento com BFA. O nível médio de intensidade do TGF beta foi três vezes maior com a injeção de BFA do que sem BFA.

A etapa mais crítica é garantir que a injeção da veia da cauda seja bem-sucedida. Uma injeção fracassada prejudicaria os resultados. Portanto, procure os sinais de sucesso, como a veia ficando clara com a injeção, e procure os sinais de falha, como inchaço nas caudas.

A injeção de Brefeldin A pode ser combinada com vários ensaios, incluindo western blot ou citometria de fluxo para avaliar a produção de citocinas em um órgão ou escala de célula única.

Usando essa técnica, conseguimos identificar novas citocinas secretadas por células epiteliais renais que antes se pensava serem provenientes de outros tipos de células. Ele pode ser usado para resolver debates de longa data sobre a contribuição de tipos específicos de células para lesões.