Name: Preparando e criando insetos axeônicos com mudas cultivadas de tecido para estudos de interação microbiota hospedeiro-intestinal do besouro-folha (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 56 s
Description: Aprenda a preparar insetos axênicos a partir de ovos esterilizados, utilizando mudas de tecido vegetal para obter folhas livres de microrganismos. Este método facilita estudos sobre interações entre microbiota intestinal e hospedeiro em besouros-folha.

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Este trabalho foi financiado pela National Natural Science Foundation of China (31971663) e pelo Young Elite Scientists Sponsorship Program by CAST (2020QNRC001).

1. Criação de insetos
<ol><li>Manter a população de P. versicolora em uma câmara de crescimento na condição de 27 °C e 70 ± umidade relativa de 5% com um fotoperíodo de 16 h de luz/8 h escuro. Coloque-os em caixas de plástico perfuradas com papel absorvente molhado de azulejos e alimente-os galhos de álamo frescos. Pulverize a água limpa no papel absorvente para manter a umidade e troque os galhos a cada dois dias.</li>
	<li>Isole adultos para oviposição após a pupação. Alimente-os com folhas macias para obter mais ovos.</li>
	<li>Coletar ovos recém-colocados (dentro de 24 h). Coloque os ovos em papel absorvente úmido por 60 h para preparar larvas axenic. NOTA: Os ovos recém-colocados chocarão depois de ~72 h. A melhor hora para esterilizar superfícies de ovos é um dia antes da eclosão; caso contrário, o número de ovos eclodidos com sucesso diminuirá.</li>
</ol>2. Cultivo de álamo sem germes
<ol><li>Prepare as soluções de estoque de ácido acético Murashige e Skoog (MS) e 1 mg/mL α-naphthalene as soluções de estoque (NAA) (ver a Tabela de Materiais).</li>
	<li>Em uma capa de biossegurança, adicione 50 μL de solução de estoque NAA de 1 mg/mL a 500 mL de ms médio, agite para misturar bem e despeje ~50 mL por recipiente de cultura tecidual e espere pela solidificação.</li>
	<li>Preparar bisturis, lâmpada de álcool e fórceps; esterilizar os bisturis e fórceps na chama da lâmpada alcoólica no capô da biossegurança.</li>
	<li>Corte segmentos de haste de 3-4 cm com botões apical ou botões laterais de mudas de álamo a ~1 mês de crescimento (mudas cultivadas com tecido livre de germes), e insira-as no meio de cultura, um ou dois segmentos de haste por recipiente.</li>
	<li>Incubar esses segmentos de haste em uma câmara de crescimento a 25 °C e 50 ± intensidade de luz de 10 cd com um fotoperódo de 16 h de luz/8h escuro por aproximadamente 30 dias. Use as folhas sem germes para alimentar as larvas axenic.</li>
</ol>3. Esterilização da superfície do ovo e criação de larvas axenic
<ol><li>Placas de Petri autoclave, pincéis, papel filtro, água destilada, e uma placa de Petri contendo LB (Luria-Bertani) meio de ágar.</li>
	<li>Coloque as folhas com ovos aderentes em uma placa de Petri, retire cuidadosamente os ovos das folhas usando fórceps e transfira-os para outra placa de Petri. NOTA: Esta etapa deve ser realizada com muito cuidado, pois os ovos são aderentes às folhas.</li>
	<li>Lave esses ovos com 75% de etanol por 8 minutos e repita a lavagem quatro vezes com água estéril.</li>
	<li>Transfira os ovos para o meio ágar LB para preservar a umidade para eclodir. NOTA: O uso do meio de ágar LB pode ajudar a verificar se o óvulo desinfetado está livre de germes.</li>
	<li>Coloque a placa de Petri em uma câmara de crescimento e espere os ovos chocarem dentro de 24 horas.</li>
	<li>Em um capô biossegurança, ladrilho três pedaços de papel filtro molhado em uma placa de Petri, coloque folhas de álamo sem germes no papel, colete as larvas e coloque-as nas folhas, sele a placa de Petri com parafilm, e incuba-as em uma câmara de crescimento a 27 °C e 70 ± umidade relativa com um fotoperperiod de 16 h luz/8 h escuro. NOTA: As folhas cultivadas por tecido são delicadas e podem perder água rapidamente. Assim, o uso de papel filtro úmido é necessário ao transferir as folhas para a placa de Petri.</li>
	<li>Troque as folhas a cada dois dias.</li>
	<li>Para os grupos criados convencionalmente, transfira os ovos das folhas para uma placa de Petri contendo papel filtro úmido e alimente essas larvas com folhas de álamo sem germes.</li>
</ol>4. Verificação de larvas axenic com ensaios dependentes da cultura
<ol><li>Selecione aleatoriamente três larvas1, 2 e 3ª instar dos grupos criados sem germes e convencionalmente criados.</li>
	<li>Disseque as larvas3ª instar com tesouras estéreis e fórceps sob um estereótipo e colete suas entranhas em tubos de microcentrifuuge. Recolher larvas intactas1 e 2ª em tubos. NOTA: Colete larvas inteiras de 1e 2º instar, pois são muito pequenas para dissecar, e mantenha suas entranhas intactas.</li>
	<li>Adicione 100 μL de soro fisiológico tamponado com fosfato e três bolas de aço a tubos de 1,5 mL e triture os tecidos em homogeneizadores usando um homogeneizador de contas.</li>
	<li>Adicione 100 μL do homogeneado ao meio de ágar LB e placa usando uma haste de difusão de vidro estéril.</li>
	<li>Coloque as placas a 37 °C por 24 h e observe as colônias bacterianas.</li>
</ol>5. Verificação de indivíduos axeônicos com ensaios independentes da cultura
<ol><li>Extrair o DNA total dos tecidos (obtidos na seção 4) utilizando um kit de extração de DNA.</li>
	<li>Meça a concentração de DNA usando um espectrofotômetro a 260 nm.</li>
	<li>Amplie o gene rna 16S bacteriano usando primers universais de rRNA 16S com PCR. Configure o sistema de reação com 18 μL de 1,1x PCR master mix (ver a Tabela de Materiais), 0,5 μL de primer 27F (5'-ACGGATACCTTGTTACGAC-3'), 0,5 μL de primer 1495R (5'-ACGGATACCTTGTTACGAC-3') e 100 ng modelo de DNA. Definir as condições do PCR em 95 °C para 3 min; 28 ciclos de 95 °C para 30 s, 55 °C para 1 min e 72 °C por 1 min; seguido por 72 °C para 10 min. Armazene os produtos PCR a 4 °C até uma análise mais aprofundada.</li>
	<li>Misture os produtos PCR com corante ácido nucleico e analise-os usando eletroforese em um gel de 1% de agarose no tampão 1x TAE. Use 10 μL de um marcador de DNA como referência.</li>
	<li>Observe o gel com um transilluminador UV e procure o fragmento alvo em torno de 1.500 bp.</li>
</ol>

<ol><li>Moran, N. A., Ochman, H., Hammer, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+and+ecological+consequences+of+gut+microbial+communities%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Ecology%2C+Evolution%2C+and+Systematics%22%5BJournal%5D)">Evolutionary and ecological consequences of gut microbial communities.</a> Annual Review of Ecology, Evolution, and Systematics. 50 (1), 451-475 (2019).</li>
<li>Warnecke, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metagenomic+and+functional+analysis+of+hindgut+microbiota+of+a+wood-feeding+higher+termite%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Metagenomic and functional analysis of hindgut microbiota of a wood-feeding higher termite.</a> Nature. 450 (7169), 560-565 (2007).</li>
<li>Tokuda, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiber-associated+spirochetes+are+major+agents+of+hemicellulose+degradation+in+the+hindgut+of+wood-feeding+higher+termites%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Fiber-associated spirochetes are major agents of hemicellulose degradation in the hindgut of wood-feeding higher termites.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (51), 11996-12004 (2018).</li>
<li>Wang, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+microbiome+confer+multigenerational+host+resistance+after+sub-toxic+pesticide+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+%26+Microbe%22%5BJournal%5D)">Changes in microbiome confer multigenerational host resistance after sub-toxic pesticide exposure.</a> Cell Host & Microbe. 27 (2), 213-224 (2020).</li>
<li>Shin, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+microbiome+modulates+host+developmental+and+metabolic+homeostasis+via+insulin+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Drosophila microbiome modulates host developmental and metabolic homeostasis via insulin signaling.</a> Science. 334 (6056), 670-674 (2011).</li>
<li>Storelli, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lactobacillus+plantarum+promotes+Drosophila+systemic+growth+by+modulating+hormonal+signals+through+TOR-dependent+nutrient+sensing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Lactobacillus plantarum promotes Drosophila systemic growth by modulating hormonal signals through TOR-dependent nutrient sensing.</a> Cell Metabolism. 14 (3), 403-414 (2011).</li>
<li>Salem, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitamin+supplementation+by+gut+symbionts+ensures+metabolic+homeostasis+in+an+insect+host%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings.+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Vitamin supplementation by gut symbionts ensures metabolic homeostasis in an insect host.</a> Proceedings. Biological Sciences. 281 (1796), 20141838(2014).</li>
<li>Koch, H., Schmid-Hempel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Socially+transmitted+gut+microbiota+protect+bumble+bees+against+an+intestinal+parasite%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Socially transmitted gut microbiota protect bumble bees against an intestinal parasite.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (48), 19288-19292 (2011).</li>
<li>Cirimotich, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+microbe-mediated+refractoriness+to+Plasmodium+infection+in+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Natural microbe-mediated refractoriness to Plasmodium infection in Anopheles gambiae.</a> Science. 332 (6031), 855-858 (2011).</li>
<li>Kaltenpoth, M., Gottler, W., Herzner, G., Strohm, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Symbiotic+bacteria+protect+wasp+larvae+from+fungal+infestation%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Symbiotic bacteria protect wasp larvae from fungal infestation.</a> Current Biology. 15 (5), 475-479 (2005).</li>
<li>Yuan, C., Xing, L., Wang, M., Hu, Z., Zou, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbiota+modulates+gut+immunity+and+promotes+baculovirus+infection+in+Helicoverpa+armigera%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Science%22%5BJournal%5D)">Microbiota modulates gut immunity and promotes baculovirus infection in Helicoverpa armigera.</a> Insect Science. , (2021).</li>
<li>Dillon, R. J., Vennard, C. T., Charnley, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pheromones+-+Exploitation+of+gut+bacteria+in+the+locust%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Pheromones - Exploitation of gut bacteria in the locust.</a> Nature. 403 (6772), 851(2000).</li>
<li>Xu, L. T., Lou, Q. Z., Cheng, C. H., Lu, M., Sun, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gut-associated+bacteria+of+Dendroctonus+valens+and+their+involvement+in+verbenone+production%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Ecology%22%5BJournal%5D)">Gut-associated bacteria of Dendroctonus valens and their involvement in verbenone production.</a> Microbial Ecology. 70 (4), 1012-1023 (2015).</li>
<li>Schretter, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gut+microbial+factor+modulates+locomotor+behaviour+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A gut microbial factor modulates locomotor behaviour in Drosophila.</a> Nature. 563 (7731), 402-406 (2018).</li>
<li>Jia, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gut+microbiome+modulates+Drosophila+aggression+through+octopamine+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Gut microbiome modulates Drosophila aggression through octopamine signaling.</a> Nature Communications. 12 (1), 2698(2021).</li>
<li>Ma, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+and+immunological+effects+of+gut+microbiota+in+leaf+beetles+at+the+local+and+systemic+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+Zoology%22%5BJournal%5D)">Metabolic and immunological effects of gut microbiota in leaf beetles at the local and systemic levels.</a> Integrative Zoology. 16 (3), 313-323 (2021).</li>
<li>Xu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistic+action+of+the+gut+microbiota+in+environmental+RNA+interference+in+a+leaf+beetle%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiome%22%5BJournal%5D)">Synergistic action of the gut microbiota in environmental RNA interference in a leaf beetle.</a> Microbiome. 9 (1), 98(2021).</li>
<li>Xu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gut+microbiota+in+an+invasive+bark+beetle+infected+by+a+pathogenic+fungus+accelerates+beetle+mortality%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pest+Science%22%5BJournal%5D)">Gut microbiota in an invasive bark beetle infected by a pathogenic fungus accelerates beetle mortality.</a> Journal of Pest Science. 92, 343-351 (2019).</li>
<li>Berasategui, A., Shukla, S., Salem, H., Kaltenpoth, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+applications+of+insect+symbionts+in+biotechnology%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Potential applications of insect symbionts in biotechnology.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 100 (4), 1567-1577 (2016).</li>
<li>Tikhe, C. V., Martin, T. M., Howells, A., Delatte, J., Husseneder, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+genetically+engineered+Trabulsiella+odontotermitis+as+a+%27Trojan+Horse%27+for+paratransgenesis+in+termites%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Assessment of genetically engineered Trabulsiella odontotermitis as a 'Trojan Horse' for paratransgenesis in termites.</a> BMC Microbiology. 16 (1), 202(2016).</li>
<li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fighting+malaria+with+engineered+symbiotic+bacteria+from+vector+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Fighting malaria with engineered symbiotic bacteria from vector mosquitoes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (31), 12734-12739 (2012).</li>
<li>Leonard, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+symbionts+activate+honey+bee+immunity+and+limit+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Engineered symbionts activate honey bee immunity and limit pathogens.</a> Science. 367 (6477), 573-576 (2020).</li>
<li>Kietz, C., Pollari, V., Meinander, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+germ-free+Drosophila+to+study+gut-microbe+interactions%3A+protocol+to+rear+Drosophila+under+axenic+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Generating germ-free Drosophila to study gut-microbe interactions: protocol to rear Drosophila under axenic conditions.</a> Current Protocols in Toxicology. 77 (1), 52(2018).</li>
<li>Brummel, T., Ching, A., Seroude, L., Simon, A. F., Benzer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+lifespan+enhancement+by+exogenous+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Drosophila lifespan enhancement by exogenous bacteria.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (35), 12974-12979 (2004).</li>
<li>Correa, M. A., Matusovsky, B., Brackney, D. E., Steven, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+axenic+Aedes+aegypti+demonstrate+live+bacteria+are+not+required+for+mosquito+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Generation of axenic Aedes aegypti demonstrate live bacteria are not required for mosquito development.</a> Nature Communications. 9 (1), 4464(2018).</li>
<li>Romoli, O., Schonbeck, J. C., Hapfelmeier, S., Gendrin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+germ-free+mosquitoes+via+transient+colonisation+allows+stage-specific+investigation+of+host-microbiota+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Production of germ-free mosquitoes via transient colonisation allows stage-specific investigation of host-microbiota interactions.</a> Nature Communications. 12 (1), 942(2021).</li>
<li>Berasategui, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gut+microbiota+of+the+pine+weevil+degrades+conifer+diterpenes+and+increases+insect+fitness%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Ecology%22%5BJournal%5D)">Gut microbiota of the pine weevil degrades conifer diterpenes and increases insect fitness.</a> Molecular Ecology. 26 (15), 4099-4110 (2017).</li>
<li>Lin, X. L., Kang, Z. W., Pan, Q. J., Liu, T. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+five+antibiotics+on+larval+gut+bacterial+diversity+of+Plutella+xylostella+%28Lepidoptera%3A+Plutellidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Science%22%5BJournal%5D)">Evaluation of five antibiotics on larval gut bacterial diversity of Plutella xylostella (Lepidoptera: Plutellidae).</a> Insect Science. 22 (5), 619-628 (2015).</li>
<li>Muhammad, A., Habineza, P., Hou, Y., Shi, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+red+palm+weevil+Rhynchophorus+Ferrugineus+%28Olivier%29+%28Coleoptera%3A+Dryophthoridae%29+germ-free+larvae+for+host-gut+microbes+interaction+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-protocol%22%5BJournal%5D)">Preparation of red palm weevil Rhynchophorus Ferrugineus (Olivier) (Coleoptera: Dryophthoridae) germ-free larvae for host-gut microbes interaction studies.</a> Bio-protocol. 9 (24), 3456(2019).</li>
<li>Gelman, D. B., Bell, R. A., Liska, L. J., Hu, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artificial+diets+for+rearing+the+Colorado+potato+beetle%2C+Leptinotarsa+decemlineata%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Insect+Science%22%5BJournal%5D)">Artificial diets for rearing the Colorado potato beetle, Leptinotarsa decemlineata.</a> Journal of Insect Science. 1, 7(2001).</li>
<li>Bengtson, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+program+for+the+evaluation+of+artificial+diets%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+World+Aquaculture+Society%22%5BJournal%5D)">A comprehensive program for the evaluation of artificial diets.</a> Journal of the World Aquaculture Society. 24 (2), 285-293 (2007).</li>
<li>Utsumi, S., Ando, Y., Ohgushi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+feeding+preference+in+a+leaf+beetle%3A+the+importance+of+phenotypic+plasticity+of+a+host+plant%5BTitle%5D)+AND+%22Ecology+Letters%22%5BJournal%5D)">Evolution of feeding preference in a leaf beetle: the importance of phenotypic plasticity of a host plant.</a> Ecology Letters. 12 (9), 920-929 (2009).</li>
<li>Ishihara, M., Ohgushi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reproductive+inactivity+and+prolonged+developmental+time+induced+by+seasonal+decline+in+host+plant+quality+in+the+willow+leaf+beetle+Plagiodera+versicolora+%28Coleoptera%3A+Chrysomelidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Entomology%22%5BJournal%5D)">Reproductive inactivity and prolonged developmental time induced by seasonal decline in host plant quality in the willow leaf beetle Plagiodera versicolora (Coleoptera: Chrysomelidae).</a> Environmental Entomology. 35 (2), 524-530 (2006).</li>
<li>Bright, M., Bulgheresi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+complex+journey%3A+transmission+of+microbial+symbionts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%3A+Microbiology%22%5BJournal%5D)">A complex journey: transmission of microbial symbionts.</a> Nature Reviews: Microbiology. 8 (3), 218-230 (2010).</li>
<li>Hassan, B., Siddiqui, J. A., Xu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vertically+transmitted+gut+bacteria+and+nutrition+influence+the+immunity+and+fitness+of+Bactrocera+dorsalis+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Vertically transmitted gut bacteria and nutrition influence the immunity and fitness of Bactrocera dorsalis larvae.</a> Frontiers in Microbiology. 11, 596352(2020).</li>
<li>Hosokawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obligate+bacterial+mutualists+evolving+from+environmental+bacteria+in+natural+insect+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Obligate bacterial mutualists evolving from environmental bacteria in natural insect populations.</a> Nature Microbiology. 1, 15011(2016).</li>
<li>Habineza, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+promoting+effect+of+gut+microbiota+on+growth+and+development+of+red+palm+weevil%2C+Rhynchophorus+ferrugineus+%28Olivier%29+%28Coleoptera%3A+Dryophthoridae%29+by+modulating+its+nutritional+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The promoting effect of gut microbiota on growth and development of red palm weevil, Rhynchophorus ferrugineus (Olivier) (Coleoptera: Dryophthoridae) by modulating its nutritional metabolism.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 1212(2019).</li>
<li>Meilan, R., Ma, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poplar+%28Populus+spp.%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Poplar (Populus spp.).</a> Methods in Molecular Biology. 344, Clifton, N.J. 143-151 (2006).</li>
<li>Wani, Z. A., Ashraf, N., Mohiuddin, T., Riyaz-Ul-Hassan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant-endophyte+symbiosis%2C+an+ecological+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Plant-endophyte symbiosis, an ecological perspective.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 99 (7), 2955-2965 (2015).</li>
<li>Grout, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meristem-tip+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Meristem-tip culture.</a> Methods in Molecular Biology. 6, Clifton, N.J. 81-91 (1990).</li>
</ol>

Os autores não têm conflitos de interesse para divulgar.

A preparação de larvas livres de germes e a obtenção de larvas gnotobióticas, reintroduzindo cepas bacterianas específicas, são métodos poderosos para elucidar os mecanismos subjacentes às interações hospedeiro-micróbio. Larvas recém-eclodidas obtêm microbiota intestinal de duas formas principais: transmissão vertical da mãe para a prole ou aquisição horizontal de irmãos e ambiente34. O primeiro pode ser cumprido pela transferência dos pais para a prole através da contaminação da superfície do ovo...

Semelhante aos mamíferos, o trato digestivo de insetos é uma cavidade para digestão e absorção de alimentos. A maioria dos insetos abriga diversas bactérias commensais que prosperam em suas entranhas e vivem de nutrição fornecida pelos hospedeiros1. A comunidade commensal intestinal tem um impacto profundo em múltiplos processos fisiológicos em insetos, incluindo digestão e desintoxicaçãode alimentos 2,3,4, nutrição e desenvolvimento 5,6,7, defesa contra patógenos e parasitas 8,9,10,11, comunicação química 12,13 e comportamentos14 15. Curiosamente, algumas microbiota intestinal podem ser facultativamente patogênicas ou manipuladas por patógenos invasores para agravar a infecção, indicando que bactérias intestinais podem ser prejudiciais em alguns casos 16,17,18. As bactérias intestinais também podem servir como um recurso microbiano para aplicações biotécnicas e manejo de pragas. Por exemplo, bactérias digeridoras de lignocelulose de insetos fitofagosos e xilofagos foram usadas para digerir células vegetais para o desenvolvimento de biocombustíveis19. A dispersão de simbionts intestinais projetados expressando moléculas bioativas é uma tática nova e promissora para gerenciar a agricultura e pragas florestais e mosquitos que transmitem doenças infecciosas 19,20,21, que também podem ser usadas para melhorar a aptidão de insetos benéficos 22. Ilustrar como uma bactéria intestinal se comporta in vivo é, portanto, considerada uma prioridade para alavancar plenamente sua função e explorá-la ainda mais para várias aplicações.
Os animais podem abrigar de 1 a >1000 espécies microbianas simbióticas no intestino1. Como resultado, é difícil verificar com precisão como a taxa bacteriana individual ou sua montagem se comportam dentro de um animal, e se o hospedeiro ou seus parceiros microbianos conduzem uma função específica. Portanto, o preparo de larvas machadonicas para obter insetos gnóbitos por colonização mono ou multiespécies é necessário para investigar a função bacteriana e a interação com insetos23. Atualmente, administrar coquetéis antibióticos e esterilizar a superfície dos ovos de insetos são métodos comuns para remover bactérias intestinais 14,24,25,26. No entanto, as dietas antibióticas não podem eliminar completamente as bactérias intestinais e têm um efeito negativo na fisiologiado inseto hospedeiro 27,28. Consequentemente, o uso de insetos tratados com antibióticos pode obscurecer as verdadeiras habilidades de algumas bactérias intestinais. Felizmente, a esterilização superficial de ovos pode negar esse problema23,29, que não tem efeitos ou insignificantes sobre insetos experimentais. Além disso, dietas artificiais não podem se assemelhar totalmente a alimentos naturais para insetos, e desenvolver uma dieta artificial é um processo caro e que consome mão-de-obra30,31.
O besouro-folha de salgueiro, Plagiodera versicolora (Laicharting) (Coleoptera: Chrysomelidae), é uma praga comedora de folhas generalizada que se alimenta principalmente de árvores salicacesas, como salgueiros (Salix) e álamo (Populus L.) 32,33. Aqui, o besouro-folha de salgueiro foi usado como um inseto representativo que come folhas para desenvolver um protocolo para preparar e criar um inseto livre de germes. Exploramos a cultura do tecido vegetal para obter folhas de álamo sem germes para criar larvas machados P. versicolora de ovos esterilizados. O status axenic das larvas de P. versicolora foi verificado através de ensaios dependentes da cultura e independentes da cultura. Este protocolo pode manter insetos axenic que melhor imitam a condição selvagem do que a criação de insetos com uma dieta artificial. Mais importante, este método é conveniente a um custo muito baixo, o que aumenta a viabilidade de obter insetos axenic para futuros estudos de interação inseto-intestino, especialmente para insetos não-modelos sem dietas artificiais bem desenvolvidas.

<table><tbody><tr><td>0,22 &micro; m filtros de seringa</td><td>Millipore</td><td>SLGP033RB</td><td></td></tr><tr><td>1 mg/mL de solução</td><td></td><td></td> estoque de NAA <td>a. Prepare a solução de NaOH 0,1 M (dissolva 0,8 g de NaOH em 200 mL de água destilada). b. Adicione 0,2 g de NAA em um béquer de 250 mL, adicione pouca solução de NaOH 0,1 M até que o NAA se dissolva e ajuste o volume final para 200 mL com água destilada. c. Filtre a solução para remover bactérias com um 0,22 &micro; m e uma seringa estéril de 50 ml, subembalar a solução em tubos de centrífuga de 1,5 ml e restaurar a -20 °C.</td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga de 1,5 mL</td><td>Sangon Biotech</td><td>F600620</td><td></td></tr><tr><td>10x solução estoque PBS</td><td>Biosharp Life Sciences</td><td>BL302A</td><td></td></tr><tr><td>Solução de KOH</td><td></td><td></td> 2 M <td>Dissolva 22,44 g de KOH (peso molecular: 56,1) em 200 mL de água destilada e autoclave por 20 min a 121 °C.</td></tr><tr><td>Copos de 250 mL e 2.000 mL</td><td>Shubo</td><td>sb16455</td><td></td></tr><tr><td>Seringas estéreis de 50 mL</td><td>Jinta</td><td>JT0125789</td><td></td></tr><tr><td>Cilindro de medição de 500 mL</td><td>Shubo</td><td>sb1601</td><td></td></tr><tr><td>50x TAE solução</td><td></td><td></td> estoque <td>a.&nbsp; Dissolver 242 g de Tris e 18.612 g de EDTA em 700 mL de água destilada. b. Ajuste o pH para 7,8 com cerca de 57,1 mL de ácido acético. c. Ajuste o volume final para 1.000 mL. d. A solução estoque foi diluída para 1x tampão TAE quando usada.</td></tr><tr><td>75% etanol</td><td>Xingheda trade</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-naftaleno ácido acético (NAA)</td><td>Solarbio Life Sciences</td><td>86-87-3</td><td></td></tr><tr><td>Papel</td><td></td><td></td> absorvente <td>22,3 cm x 15,3 cm x 9 cm</td></tr><tr><td>Ácido acético</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Coolaber</td><td>9002-18-0</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Biowest</td><td>111860</td><td></td></tr><tr><td>Autoclave</td><td>Panasonic</td><td>MLS-3781L-PC</td><td></td></tr><tr><td>Homogeneizador de batida de grânulos</td><td>Jing Xin</td><td>XM-GTL64</td><td></td></tr><tr><td>Kit de extração de DNA</td><td>MP Biomedicals</td><td>116560200</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Saiguo Biotech</td><td>1340</td><td></td></tr><tr><td>Papel de filtro</td><td>Jiaojie</td><td></td><td>70 mm de diâmetro</td></tr><tr><td>Unidade</td> <td>de eletroforese em gelBio-rad</td><td>164-5052</td><td></td></tr><tr><td>Gel Sinal Corante de ácido nucleico verde</td><td>TsingKe</td><td>TSJ003</td><td></td></tr><tr><td>Mudas de choupo sem germes</td><td></td><td></td><td>Choupo Shan Xin da Universidade de Ludong na província de Shandong Golden</td></tr><tr><td>Star Super PCR Master Mix (1,1 e vezes;)</td><td>TsingKe</td><td>TSE101</td><td></td></tr><tr><td>Câmara de crescimento</td><td>Ruihua</td><td>HP400GS-C</td><td></td></tr><tr><td>LB meio</td><td></td><td></td> de ágar <td>a. Dissolva 5 g de triptona, 5 g de NaCl, 2,5 g de extrato de levedura em 300 mL de água destilada. b. Ajuste o volume final para 500 mL, transfira a solução para um frasco cônico de 1.000 mL e adicione 7,5 g de ágar. c. Autoclave o meio por 20 min a 121 °C.</td></tr><tr><td>Mini centrífuga</td><td>DRAGONLAB</td><td>D1008</td><td></td></tr><tr><td>MS meio básico</td><td>Coolaber</td><td>PM1121-50L</td><td>M0245</td></tr><tr><td>MS meio sólido para cultura de mudas de choupo livre de germes</td><td></td><td></td><td>a. Dissolva 4,43 g de pó médio básico MS e 30 g de sacarose em 800 mL de água destilada. b. Ajuste o pH para cerca de 5,8 com 2 M KOH por um medidor de pH. c. Ajuste o volume final para 1.000 mL, separar em duas partes, transferir para dois frascos cónicos de 1.000 ml e adicionar 2,6 g de ágar por 500 ml. d. Autoclave por 20 min a 121 °C.</td></tr><tr><td>Espectrofotômetro NanoDrop 1000</td><td>Pincel</td> Thermo Fisher Scientific <td></td><td></td></tr><tr><td>1</td><td>cm de largura, usado para coletar os ovos</td>Parafilm Bemis PM-996 PCR Termocicladores Eppendorf 6331000076 placas de Petri Supin Medidor de pH de 90 mm de diâmetro METTLER TOLEDO FE20 <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipetas 0,2-2 &micro; L</td><td>Gilson</td><td>ECS000699</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas 100-1,000 &micro; L</td><td>Eppendorf</td><td>3120000267</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas 20-200 &micro; L</td><td>Eppendorf</td><td>3120000259</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas 2-20 &micro; L</td><td>Eppendorf</td><td>3120000232</td><td></td></tr><tr><td>Recipiente para cultura de tecidos vegetais</td><td>Chembase</td><td>ZP21</td><td>240 mL</td></tr><tr><td>Caixa</td><td></td><td></td> de plástico <td>2,35 L</td></tr><tr><td>Hidróxido de potássio (KOH)</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primers para amplificar o gene bacteriano 16S rRNA</td><td>Sangon Biotech</td><td></td><td>27-F: 5'-ACGGATACCTTGTTACGAC-3', 1492R: 5'-ACGGATACCTTGTTACGAC-3'</td></tr><tr><td>Cloreto de sódio (NaCl)</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de sódio (NaOH)</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Esferas</td><td></td> de aço <td>de 0,25 mm</td><td>usadas para moer tecidos</td></tr><tr><td>Estereomicroscópio</td><td>OLYMPUS</td><td>SZ61</td><td></td></tr><tr><td>Sacarose</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>, Trans2K plus II DNA marcador</td><td>Transgene Biotech</td><td>BM121-01</td><td></td></tr><tr><td>Base Tris</td><td>Biosharp Life Sciences</td><td>1115</td><td></td></tr><tr><td>Triptona</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>&nbsp; LP0037</td><td></td></tr><tr><td>Transiluminador UV</td><td>Monad Biotech</td><td>QuickGel 6100</td><td></td></tr><tr><td>Vortexer</td><td>Scilogex</td><td>MX-S</td><td></td></tr><tr>Ramos <td></td><td></td><td>de salgueiro</td><td>Sha Lake Park, Wuhan, China</td></tr><tr><td>Besouro</td><td></td><td></td> da folha de salgueiro <td>Huazhong Agricultural University, Wuhan, China</td></tr><tr><td>Extrato de levedura</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>LP0021</td><td></td></tr></tbody></table>

preparando e criando insetos axeônicos com mudas cultivadas de tecido para estudos de interação microbiota hospedeiro-intestinal do besouro-folha

Preparing and Rearing Axenic Insects with Tissue Cultured Seedlings for Host-Gut Microbiota Interaction Studies of the Leaf Beetle

As entranhas dos insetos são colonizadas por diversas bactérias que podem impactar profundamente os traços fisiológicos do hospedeiro. Introduzir uma cepa bacteriana particular em um inseto axenic é um método poderoso para verificar a função microbiana intestinal e elucidar os mecanismos subjacentes às interações entre micróbios intestinais. Administrar antibióticos ou esterilizar superfícies de óvulos são dois métodos comumente usados para remover bactérias intestinais de insetos. No entanto, além dos potenciais efeitos adversos dos antibióticos em insetos, estudos anteriores indicaram que a alimentação de antibióticos não poderia eliminar bactérias intestinais. Assim, dietas artificiais sem germes são geralmente empregadas para manter insetos axenic, que é um processo tedioso e intensivo em mão-de-obra que não pode se assemelhar totalmente a componentes nutricionais em alimentos naturais. Descrito aqui é um protocolo eficiente e simples para preparar e manter larvas axenic de um besouro de folhas (Plagiodera versicolora). Especificamente, superfícies dos ovos de besouro foram esterilizadas, seguindo as quais folhas de álamo sem germes foram usadas para retrotecanças. O status axenic dos insetos foi confirmado ainda através de ensaios dependentes da cultura e independentes da cultura. Coletivamente, combinando desinfecção de ovos e cultivo livre de germes, um método eficiente e conveniente foi desenvolvido para obter a P. versicolora axenic, fornecendo uma ferramenta facilmente transferível para outros insetos comedores de folhas.

As fases de vida de P. versicolora são mostradas na Figura 1. O macho adulto é menor que o feminino adulto (Figura 1A). No campo, o besouro agrupa seus ovos em uma folha; aqui, quatro ovos foram retirados de uma folha (Figura 1B). Os segmentos de haste de álamo e as mudas utilizadas para a criação de insetos axeônicos são mostrados na Figura 2. O intestino de uma larva instar 3é most...

Para obter um inseto axenic, sua superfície de ovo é esterilizada, e a larva eclodida é posteriormente criada usando folhas axenic. Este método fornece uma maneira eficiente de preparação de insetos machados sem administrar antibióticos ou desenvolver uma dieta artificial, que também pode ser aplicada a outros insetos comedores de folhas.

Preparando e criando insetos axeônicos com mudas cultivadas de tecido para estudos de interação microbiota hospedeiro-intestinal do besouro-folha

Insect guts are colonized by diverse bacteria that can profoundly impact the host&#39;s physiological traits. Introducing a particular bacterial strain ...

As bactérias intestinais podem afetar múltiplos processos fisiológicos de hospedeiros de insetos. Preparar e manter larvas axenic é uma ferramenta poderosa para estudar as funções das bactérias intestinais. As principais vantagens deste protocolo são que a cultura do tecido vegetal é usada para obter folhas livres de germes para a folha de axenic traseira que come insetos derivados de ovos esterilizados pela superfície, e que este método não é restrito por dietas artificiais.Este método é conveniente e aumenta a visibilidade da manutenção de insetos machados para futuros estudos de bactérias intestinais, especialmente para insetos não-modelos sem dietas artificiais bem desenvolvidas. Mantenha a população de P.versicolora em uma câmara de crescimento a 27 graus Celsius e 70% de umidade relativa, com uma luz de 16 horas e oito horas de fotoperíodo escuro. Coloque os insetos em caixas de plástico perfuradas com papel absorvente molhado inclinado e alimente-os galhos de álamo frescos.Pulverize a água limpa no papel absorvente para manter a umidade e troque os galhos a cada dois dias. Isole os adultos para oviposition após a pupação, e alimente-os folhas macias para obter mais ovos. Dentro de 24 horas, colete ovos recém-colocados e coloque-os em papel absorvente úmido por 60 horas para preparar larvas axenic.Prepare o meio MS em um miligrama por ácido acético alfa-naftalen ou naa. Em um capô de biossegurança, adicione 50 microliters da solução de estoque NAA a 500 mililitros de ms médio, e agite para misturar bem. Em seguida, despeje aproximadamente 50 mililitros por recipiente de cultura tecidual e aguarde a solidificação.Esterilizar bisturis e fórceps em uma chama de lâmpada de álcool no capô da biossegurança. Corte segmentos de haste de três a quatro centímetros com botões apical ou botões laterais de mudas de álamo em aproximadamente um mês de crescimento, e insira-os no meio de cultura, um ou dois segmentos de haste por recipiente. Incubar esses segmentos de haste em uma câmara de crescimento por aproximadamente 30 dias.E use essas folhas sem germes para alimentar as larvas axenic. Autoclave placas de Petri, pincéis de tinta, papel filtro, água destilada em uma placa de Petri contendo meio ágar LB. Coloque folhas com ovos aderentes em uma placa de Petri.Em seguida, remova cuidadosamente os ovos das folhas usando fórceps e transfira-os para outra placa de Petri. Lave esses ovos com 75% de etanol por oito minutos. Em seguida, repita a lavagem quatro vezes com água estéril.Transfira os ovos para o meio ágar LB para preservar a umidade para eclodir. Coloque a placa de Petri em uma câmara de crescimento e espere os ovos chocarem dentro de 24 horas. Em um capuz biossegurança, ladrilho três pedaços de papel filtro molhado em uma placa de Petri, e coloque folhas de álamo sem germes no papel.Pegue as larvas e coloque-as nas folhas. Sele a placa de Petri com Parafilm, e incuba-a em uma câmara de crescimento. Troque as folhas a cada dois dias.Para os grupos criados convencionalmente, transfira os ovos das folhas para uma placa de Petri contendo papel filtro úmido, e alimente essas larvas com folhas de álamo sem germes. Selecione aleatoriamente três primeira, segunda e terceira larva instar dos grupos sem germes e convencionalmente criados. Disseque a terceira larva instar com tesouras estéreis e fórceps sob um microscópio estéreo, e colete suas entranhas em tubos de microcentrifuuge.Coletar larvas intactas primeiro e segunda instar em tubos. Adicione 100 microliters de PBS e três bolas de aço aos tubos de 1,5 mililitro, e triture os tecidos em homogeneizadores usando um homogeneizador de batida de contas. Adicione 100 microliters do homogeneizar ao meio de ágar LB e placa usando uma haste de difusão de vidro estéril.Incubar as placas a 37 graus Celsius por 24 horas. Então observe as colônias bacterianas. Extrair o DNA total dos tecidos obtidos anteriormente usando um kit de extração de DNA, e medir a concentração de DNA com um espectrômetro.Amplie o gene rna 16S bacteriano usando primers universais de rRNA 16S com PCR, configurando a reação conforme descrito no manuscrito do texto. Armazene os produtos PCR a quatro graus Celsius até uma análise mais aprofundada. Misture os produtos PCR com corante ácido nucleico e analise-os usando eletroforese em um gel de 1% de agarose no tampão TAE 1X.Use 10 microliters de um marcador de DNA como referência. Observe o gel com um transilluminador UV, e procure o fragmento de destino em torno de 1.500 pares de base. Embora nenhuma colônia bacteriana tenha sido observada em qualquer grupo livre de germes, elas foram observadas em todos os grupos criados convencionalmente, indicando que larvas de ovos esterilizados que eram alimentados com tecidos cultivados com folhas de álamo não continham bactérias.As 1.500 bandas pcr de par base apareceram em todos os grupos criados convencionalmente. Em contraste, nenhuma banda foi observada nos grupos livres de germes ou no controle negativo, implicando que não existiam bactérias intestinais em larvas axenicas. Para espécies de insetos com ovos minúsculos, os tipos de desinfetantes e duração da esterilização precisavam ser otimizados.Além disso, os endófitos em plantas cultivadas por tecidos devem ser notáveis. Este protocolo fornece um novo método para manter insetos livres de germes, que é uma ferramenta útil para facilitar estudos de interação entre insetos e intestinos, especialmente para insetos não-modelos sem dietas artificiais bem desenvolvidas.

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Research

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Biology

Biologia

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